Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

Yapay mikroRNA aracılı RNA girişimini optogenetik ile birleştirmenin genel amacı, gen yıkımının sağlam nöronal devreler içindeki presinaptik fonksiyon üzerindeki etkisini karakterize etmektir. Bu yöntem, sağlam beyin devrelerinde presinaptik proteinlerin fizyolojik rolünü ele almak gibi sinaptik fizyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, incelenen presinaptik proteinin ekspresyonunun azaldığı nöronlarda sinaptik iletimin seçici olarak izlenmesini mümkün kılmasıdır.

Ayrıca, akut beyin dilimlerinde presinaptik fonksiyonu araştırmak için bu yöntemi kullandık. Nöronal güvenliği in vivo olarak manipüle etmek ve araştırmak için de uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Carmela Vitale olacaktır.

MikroRNA'ları tasarladıktan ve mikroRNA'ları ve optogenetik probu eksprese etmek için rekombinant bir vektör oluşturduktan sonra, ilgilenilen beyin bölgesinden birincil nöronal kültürler hazırlayın. Bunu yapmak için, L.A.Cingolani and Company tarafından aşağıdaki değişikliklerle oluşturulmuş bir kortikokültürleme protokolünü izleyin. İlk olarak, altı oyuklu plakalar kullanın, oyuk başına yarım milyon nöron plaka kullanın ve oyuk başına 2,5 mililitre bağlantı ortamı kullanın.

Plakayı dört saat inkübe ettikten sonra, oyuk başına 3,3 mililitre bakım ortamına geçin ve astrosit aşırı büyümesi gözlenirse, üç ila dört DIV'de 7,5 mikromolar AraC ile desteklenen 0,5 mililitre bakım ortamı ekleyin. Beş ila altı DIV'de, test etmek için her mikroRNA için üç kuyuyu enfekte edin. Nöronların en az% 99'unu enfekte edecek en düşük bulaşıcı dozu kullanın.

Virüsü doğrudan nöronlara ekleyin, hafifçe karıştırın ve plakaları 37 santigrat derecede inkübatöre geri yerleştirin. 17 ila 18 DIV'de, bir RNA ekstraksiyonu için nöronları parçalar. Plakaları eğin ve her bir oyuktan tüm ortamı çıkarmak için cam pipetler kullanın.

Ardından, hemen her bir oyuğa 700 mikrolitre lizis reaktifi ekleyin. Kısa bir karıştırmadan sonra, hücre lizatını her bir oyuktan ve ayrı 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. Ardından, her lizata 140 mikrolitre kloroform ekleyin.

İçeriği emülsifiye etmek için tüpleri hızlı bir şekilde kapatın ve 15 saniye kuvvetlice çalkalayın. Daha sonra, tüpleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, RNA içeren üst sulu fazı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın.

Pipet ucunun organik faza temas etmesine izin vermeyin. Sulu faza 1.5 hacim% 100 etanol ekleyin ve karıştırmak için çözeltiyi üç kez yavaşça pipetleyin. Ardından, ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak RNA'yı saflaştırın ve verimleri ölçün.

Örnek başına en az 3.5 mikrogram bekleyin. Proteinler ve organik bileşikler üzerindeki saflık oranlarının her ikisi de en az 1.9 olmalıdır. Ardından, 250, 500 veya 1.000 nanogram RNA'yı retro-transkribe etmek için bir kit kullanın.

Ardından, kantitatif RTPCR ile ilgilenilen endojen gen için knockdown verimliliğini ölçün. En az %60'lık bir nakavt verimliliği hedefleyinBu protokol için, A.Cetin and Company tarafından daha önce yayınlanan bir protokole göre, 15 gün veya daha uzun süre önce beyne RAAV12 enjekte edilmiş bir hayvan kullanın. Beyni izole edin ve vibratom ve gaz verilmiş buz gibi ACFF ile akut beyin dilimleri yapın.

İlgilenilen bölgenin dilimlerini toplayın ve optogenetik probun aktivasyonunu önlemek için ışığa maruz kalmalarını en aza indirin. Dilimlerin aynı ACFF'de 37 santigrat derecede 30 dakika iyileşmesine izin verin. Beyin dilimlerini tutmak için özel olarak tasarlanmış bir oda kullanın.

Ardından, dilimleri altı ila sekiz saat boyunca sağlıklı kalacakları oda sıcaklığına getirin. Devam etmek için, bir dilimi kayıt odasına aktarın ve dakikada iki mililitre ACFF'de süperfüzyon yapın. Ardından, enfeksiyonun lokalizasyonunu ve yoğunluğunu belirlemek için ifade edilen floresan raportörünün sinyalini kısaca kontrol edin.

Ardından, bir yama elektrodunu hücre içi çözelti ile doldurun. Şimdi, kızılötesi aydınlatma altında, enfekte nöronlardan sinaptik girdiler alan bir nöron üzerinde sıkı bir şekilde kapatılmış bir toptan konfigürasyon elde edin. Seri direnç telafi edilmeden bırakılabilir, ancak sabit ve düşük olmalıdır.

Örneğin, CA3 piramidal nöronları enfekte olmuşsa, CA1 bölgesinin proksimal ila medial yolundaki piramidal nöronları yamalayın. Hücreler küçülmüş veya şişmiş görünmeye başladığında, yama zorlaştığında veya partiler kararsız olduğunda, seçilen dilimler artık kayıt için yeterince sağlıklı değildir. Daha sonra, incelenen sinaptik akımları izole etmek için farmakolojiyi kullanın.

Örneğin, amaç uyarıcı sinaptik iletimi araştırmaksa, banyoya bikükülin ekleyerek inhibitör sinaptik iletimi engelleyin. Daha sonra, enfekte nöronların somaması üzerine yerleştirilmiş bir optik fibere bağlı 473 nanometre mavi bir lazer kullanarak, uyarıcı postsinaptik akımlar gibi sinaptik akımları uyandırın. Lazeri nöronların aksonlarına yöneltmeyin.

Örneğin, Shaffer teminatlarına ışık tutmaktan kaçının. Aksonların doğrudan depolarizasyonu arzu edilmez. Ardından, ışık darbesi başına birden fazla aksiyon potansiyeli uyandırma olasılığını azaltmak için stimülasyon uzunluğunu minimuma ayarlayın.

Ardından, küçük ama net bir şekilde tespit edilebilir sinaptik akımı uyandırmak için lazerin yoğunluğunu iyileştirin. Örneğin, CA3 ve CA1 piramidal nöronları arasındaki uyarıcı sinaptik iletim için, lazerin yoğunluğunu 20 ila 50 pikoamperlik sinaptik akımları uyandıracak şekilde ayarlayın. Deneyin sonunda, sodyum kanallarını bloke etmek için 0.5 mikromolar derecede tetrodotoksin uygulayın.

Optik olarak uyarılan akımların tetrodotoksine duyarlılığı, bunların aksiyon potansiyeli güdümlü olduğunu gösterir. En az üç farklı hayvandan belirli bir durum için en az sekiz nöron yamalanana kadar veri toplamaya devam edin. Bu, sonuçları analiz etmek için gereken minimum veridir.

Tarif edilen yöntem kullanılarak, presinaptik P / Q tipi voltaj kapılı kalsiyum kanallarının alternatif ek izoformları parçalandı. Bu kanalların CA3 ila CA1 uyarıcı sinapslarda kısa süreli sinaptik plastisiteyi düzenlediği düşünülmektedir. İzoforma özgü mikroRNA'ları ifade eden dört farklı yapı yapıldı; her biri floresan proteini Td-Tomato ile birlikte ultra hızlı bir kanal rhodopsin ile birlikte eksprese edildi.

İlk olarak, her yapının, izoforma özgü kantitatif RTPCR kullanılarak birincil sıçan nöronal kültürlerinde yeterli yıkım verimliliğine ve seçiciliğe sahip olduğu doğrulandı. Daha sonra, her yapı P18 sıçanlarının hipokampusuna enjekte edildi. Sonuç olarak, yapıların CA3 ila CA1 sinapslarında kısa süreli sinaptik plastisite üzerindeki etkisi, enfekte CA3 piramidal nöronlarının 473 nanometre ışıklı kısa darbelerle uyarılması ve elde edilen EPSC'lerin CA1 bölgesinin piramidal nöronlarından toptan konfigürasyonda kaydedilmesiyle araştırıldı.

Farklı ek izoformlarının yıkılması, zıt yönlerde eşleştirilmiş nabız stimülasyonuna verilen yanıtları etkiledi. A izoformunun yıkılması, eşleştirilmiş nabız kolaylaştırmasını artırdı; B izoformunun yıkılması ise onu ortadan kaldırdı. RNA girişimlerini optogenetikle birleştirmek, sinaptik fizyoloji alanındaki araştırmaların, presinaptik proteinlerin sağlam devrelerde kısa süreli sinaptik plastisiteyi nasıl düzenlediğini keşfetmesine olanak tanır.

Bu videoyu izledikten sonra, RNA etkileşimi için mikroRNA'ların nasıl doğrulanacağını ve akut beyin dilimlerinde sinaptik iletimi araştırmak için bunları optogenetik ile nasıl birleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.