Sinerjik uyuşturucu kombinasyonları örtüşme² yöntemi tarafından yüksek üretilen iş tanımlaması

Bu metodolojinin genel amacı, Yüksek Verimli tarama ile birleştirildiğinde birbirlerinin aktivitesini artıran sinerjik molekülleri tanımlamaktır. Sinerjik ilaç çiftleri, ilaca dirençli enfeksiyonlarla mücadelede umut verici bir stratejidir, ancak tanımlanması zordur. Bu yöntem, bulaşıcı hastalıkları tedavi etmek için kullanılan mevcut antimikrobiyal ilaçlarla etkileşime giren molekülleri tanımlayabilir.

Uzun vadede bu kombinasyonlar klinik öncesi değerlendirmeye girebilir ve sonunda hasta bakımını iyileştirebilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen herhangi bir organizma ile ve herhangi bir küçük molekül kütüphanesi ile yapılabilmesidir. Bu tekniğin etkileri, ilgilenilen herhangi bir organizma ile çalıştığı için çoklu bulaşıcı hastalıkların tedavisine kadar uzanır.

Eklenen küçük molekülün belirli bir konsantrasyonunun varlığında, tüm mutantlar için ortalama büyüme skorunu ve standart sapmayı hesaplamak için standart bir elektronik tablo kullanın. Ardından, küçük molekül konsantrasyonunun her biri için Z puanlarını hesaplayın. Ardından, önemli Z skorlarına sahip gen mutantlarını vurgulayın.

İlk olarak, gece boyunca 37 santigrat derecede M9 minimum ortamda bir E.coli kültürü büyütün. Daha sonra, küçük molekülleri dimetil sülfoksit içinde mililitre başına 10 miligramın üzerinde yüksek bir konsantrasyonda çözün. Daha sonra, 96 oyuklu bir plakadaki her bir oyuğa 100 mikrolitre M9 ortamı ekleyin.

Birinci sütuna 100 mikrolitre daha M9 ortamı pipetleyin, böylece bu sütundaki hacim 200 mikrolitre olur. Ardından, birinci sütuna yaklaşık 10 mikrolitre konsantre küçük moleküllü çözelti ekleyin. Küçük molekülleri ekledikten sonra, plakanın X ekseni boyunca seyreltmeye başlayın.

Sütun 11'de 100 mikrolitre olana kadar seyreltmeye devam edin. 11. sütunu karıştırdıktan sonra, o sütundan 100 mikrolitre atın. Verileri normalleştirmek için sütun 12'de yalnızca orta olsun.

Ardından, M9 minimal ortamında yetiştirilen gece kültürünün 600 nanometresindeki optik yoğunluk değerini kaydedin. Ardından, her bir oyuğa iki mikrolitre kültür ekleyin. Öyle ki kuyu başına 1000 hücre vardır.

Ardından plakayı hafifçe sallayın. Ve sıfır saatlik zaman noktası için 600 nanometrede optik yoğunluk okumasına dikkat edin. Okuma kaydedildikten sonra, plakayı bir gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Yine 24 saatlik zaman noktası için 600 nanometrede optik yoğunluk değerini ölçün. Dama tahtası tahlilini gerçekleştirmek için, gece boyunca 37 santigrat derecede M9 minimum ortamında bir E.coli kültürü büyütün. Ardından, her bir oyuğa 100 mikrolitre M9 ortamı ekleyin ve 96 oyuklu bir plakanın birinci sütununa aynı ortamdan fazladan 100 mikrolitre ekleyin.

Daha sonra, testleri ekleyin, küçük moleküller, her bir sütundaki oyukta. Ve A1 kuyusuna konsantrasyonun iki katını ekleyin. Ardından, 100 mikrolitreyi birinci sütundan ikinci sütuna aktararak X ekseni boyunca bir seyreltme gradyanı oluşturun. Sütun 11'e 100 mikrolitre eklenene kadar seyreltme işlemine devam edin.

Sütun 11'i karıştırdıktan sonra, o sütundan 100 mikrolitre atın ve sütun 12'yi herhangi bir ilaç kullanmadan sadece ortamla bırakın. İkinci ilaç seyreltmesi için başka bir gradyan oluşturun. Bunu yapmak için, A satırına iki X, minimum inhibitör konsantrasyon içeren ortamdan 100 mikrolitre ekleyin.Ardından, 100 mikrolitreyi A satırından B'ye aktarın.G satırına 100 mikrolitre eklenene kadar seyreltme işlemine devam edin.G sırasını karıştırdıktan sonra, kuyudan 100 mikrolitre atın.

Daha sonra plakayı iki mikrolitre kültürle her bir oyuğa aşılayın. Öyle ki kuyu başına 1000 hücre vardır. Ardından, sıfır saatlik zaman noktası için 600 nanometrede optik yoğunluk okumasını ölçün.

Okuma kaydedildikten sonra, plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, 24 saatlik zaman noktası için 600 nanometrede optik yoğunluk değerini ölçün. Sinerjik ilaçlar için Yüksek verimli tarama yapmak için, M9 minimal ortamında hem vahşi tip hem de sinerji tahmini mutant hücreleri kültürleyin.

Ardından, kütüphanedeki ilaçları ortama ekleyin. Daha sonra, bir tabak kütüphane ilacını vahşi tiple ve diğer bir plakayı sinerji tahmini mutant bakterilerle aşılayın. Bu plaka, sinerjik ilaç kombinasyonlarını araştırmak için kullanılan dama tahtası tahlilini temsil eder.

Bu plakada, en düşük FICI puanı 0.07 olan F9 kuyusu, küçük molekül çiftinin sinerjik olduğunu gösterir. Bu plaka, etkileşmeyen ilaç kombinasyonunu araştırmak için dama tahtası tahlilini temsil eder. Bu plakada, en düşük FICI puanı 1.0 olan C3 kuyusu, küçük molekül çiftinin birbiriyle etkileşime girmediğini gösterir.

Bu plaka, antagonistik ilaç kombinasyonlarını araştırmak için kullanılan dama tahtası tahlilini temsil eder. Bu plakada, en düşük FICI skoru 8.0 olan A1 kuyusu, ilaç molekülleri arasındaki etkileşimin antagonistik olduğunu gösterir. Daha sonra, Flukonazolde küçük moleküllü bir ilaç olan Befeldin A, C ve U Forminlerinin büyümesini incelemek için kullanılır.

Grafik, hem vahşi tipin hem de sinerji tahmin mutantının büyümesinin hafifçe ve aynı ölçüde engellendiğini göstermektedir. Bu, Befeldin A ve Flukonazolün sinerjik olmayan ilaç ortakları olduğunu gösterir. Aksine, C ve U Forminlerinin sinerji tahmin mutantının büyümesi, Refromisyn ve Flukonazol varlığında önemli ölçüde inhibe edilir.

İlaçların sinerjik ortaklar olduğunu gösterir. İlginç bir şekilde, vahşi tip büyüme hiç engellenmez. Burada, aşılamadan 32 ila 49 saat sonra en büyük büyüme farkı gözlenir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik sinerjik ilaç etkileşimlerini belirleme süresini kısaltabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, dama tahtası tahlilinin son satırındaki son sütunda ilaçları birleştirmemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ek sinerjik ilaç etkileşimlerini tanımlamak için diğer sinerjik molekül tanımlama yöntemleri gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz organizma ile sinerjik ilaç etkileşimlerini bulmak için varsayılan sinerji belirteçlerini belirlemek için O2M metodolojisini nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bazı küçük moleküllerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu protokolü uygularken MSDS'deki herhangi bir önlemin alınması gerektiğini unutmayın.