Yalıtım ve Endomyocardial Bioptic örnekleri Aritmojenik kardiyomiyopati hasta kardiyak Mezenkimal Stromal hücrelerden karakterizasyonu

Bu protokolün genel amacı, aritmojenik kardiyomiyopatili hastalardan kardiyak mezenkimal stromal hücreleri izole etmek, adipojenik farklılaşma yeteneklerini test etmek ve yüzey belirteçlerini fenotiplemektir. Bu yöntem, adipo-ikame ve moleküler mekanizmaların altını çizen kardiyak stromal hücrelerin katılımı gibi aritmojenik kardiyomiyopati alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, stoma hücrelerinin izolasyonunun çok küçük kalp örneklerinden birkaç basit pasajla gerçekleştirilebilmesidir.

Bu yöntem aritmojenik kardiyomiyopati çalışması hakkında fikir verebilir. Endomiyokard biyopsisinin endike olduğu kardiyovasküler hastalıkların incelenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntem fikrini ilk olarak, stoma hücresi izolasyonu prosedürünü kardiyak biyopsilere uygulamak ve bize sağlayabileceği elektrofizyolojiye uygulamak için ölçeklendirebileceğimizi anladığımızda inceledik.

Bu protokol için, entegre elektroanatomik haritalama ve kardiyak floroskopi kullanarak bir ACM hastasının sağ ventrikülünden bir endomiyokard biyopsisi alın. Yaklaşık beş gram doku alın ve TMES ortamında laboratuvara gönderin. Laboratuvarda, ensomatik sindirime kadar prosedürü gerçekleştirmek için biyolojik güvenlik kabinini gerektiği gibi kurun.

Daha sonra biyopsiyi bir tabağa aktarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Bu noktada, biyopsi mikroskop altında fotoğrafla belgelenebilir. Daha sonra biyopsiyi bir mililitre kollajenaz çözeltisi içeren iki mililitrelik bir tüpe aktarın.

Burada, numuneyi 0,5 ila bir milimetre genişliğinde küçük parçalar halinde kesin. Daha sonra dokuyu sürekli dönen ajitasyon ile 37 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. Daha sonra, sindirilmiş çözeltiyi santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve peleti bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Ardından tüpü tekrar santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve peleti bir mililitre TMES içinde yeniden süspanse edin. Şimdi süspansiyonu 60 milimetrelik bir plaka üzerine yerleştirin ve plakayı TMES kullanarak üç mililitreye kadar doldurun, ancak daha fazla değil. Daha sonra hücreleri metin protokolüne göre kültürleyin ve genişletin.

Başlamadan önce, hücre ayrışma reaktifini, yıkama tamponunu ve gerekli antikorları kullanıma hazır hale getirin. Kültürün tahmini hücre sayısı üç milyona ulaştığında, 100 milimetrelik plakayı 10 mililitre steril PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücrelere beş mililitre bir hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve hücreleri ayırmak için plakayı oda sıcaklığında yedi ila 10 dakika inkübe edin.

Hücreler ayrıldıktan sonra, hücrelere 15 mililitre PBS ekleyin ve süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Şimdi, hücreleri santrifüjleyin ve peleti bir mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Sonra hücreleri sayın ve üç milyonu 1.5 mililitre yıkama tamponunun son hacminde yeni bir tüpe aktarın.

Ardından, süspansiyonu 12 faks tüpüne bölün. Her tüpe, önerilen konsantrasyonlarda CMSC'leri karakterize etmek için kullanılan antikorları ekleyin. İzotip denetimlerini eklediğinizden emin olun.

Hazırlandıktan sonra, tüpleri ışıktan korunarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra reaksiyonları durdurmak için her tüpe bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Daha sonra hücreleri santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve peletleri 250 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin.

Şimdi akış sitometrisi kullanarak hücreleri karakterize etmeye devam edin. Hücrelerin adipojenik farklılaşmasından sonra, lipid birikimini test etmek için ORO boyaması kullanın. Başlamadan önce, ORO çalışma çözümüne sahip olduğunuzdan emin olun.

Hücreleri boyamadan önce, ortamı çıkarın ve hücreleri iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra hücreleri% 4 paraformaldehit ile kaplayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca sabitlenmelerine izin verin. Daha sonra paraformaldehiti atın ve hücreleri iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, hücreleri kaplayacak kadar ORO çalışma solüsyonu ekleyin. Daha sonra plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bu inkübasyon, otomatik çözümün çalışmayacağı bir ortamda gerçekleştirilmelidir, bu nedenle dolu odalar önerilmez.

İnkübasyondan sonra, ORO çözeltisini aspire edin ve hücreleri, leke PBS yıkamasında görülemeyene ve mikroskop altında bakıldığında spesifik olmayan lekelenme tespit edilmeyene kadar birkaç kez iki mililitre PBS ile yıkayın. Şimdi, ters çevrilmiş bir doku kültürü faz kontrast mikroskobu kullanarak, 20x büyütmede her bir oyuğun 20 görüntüsünü yakalayın. Ayrıntılar metin protokolünde verilmiştir.

CMSC'ler tarif edildiği gibi endomiyokardiyal biyopsilerden izole edildi. Mezenkimal soylarını doğrulamak için, hücreler uygun florofour konjuge antikorlarla inkübe edildi ve akış sitometrisi ile analiz edildi. CMSC'ler spesifik mezenkimal yüzey antijenleri CD29, CD44 ve CD105 için pozitifti.

CD90 pozitif hücrelerin fraksiyonunun değişken olduğu bilinmektedir. Endotel kalıtımı, monosit veya makrofaj kalıtımı, onomatopoetik kalıtım ve majör histo-uyumluluk kompleksi için belirteçler ifade edilmedi. Daha sonra, CMSC'ler adipojenik farklılaşma için T.ADIPO ortamında kültürlendi ve hücre içi lipid damlacıklarını aramak için ORO ile boyandı.

Aritmojenik kardiyomiyopatili hastalardan alınan CMSC'ler, sağlıklı kontrollerden alınan hücrelerden daha fazla lipid damlacığı biriktirdi. Bu farklılıklar farklılaşma koşulları altında 72 saat ve yedi günde ölçüldü. Bir kez ustalaştıktan sonra, hücre çözünürlüğü üç saat içinde yapılabilir, boyama iki saat içinde yapılabilir ve faks analizi üç saat içinde tamamlanabilir.

Bu işlemi takiben, aynı hastalardan alınan stoma hücrelerini farklı uyaranlara yanıt verebilir miyiz gibi ek sorulara cevap vermek için ilaç testi gibi başka yöntemler de yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, aritmojenik kardiyomiyopati alanındaki araştırmacıların, insan kardiyak stroma hücrelerinin hastalık patogenezindeki rolünü araştırmalarının yolunu açmıştır.