Name: Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Öğrenin, yeni doğan fare beynindeki striatal hücrelerde genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi yöntemini. Bu teknik, ev yapımı bir cihaz kullanarak hassas mikroenjeksiyonlar yapmayı ve erken nörogelişim süreçlerini incelemeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Bilim Bakanlığı tarafından desteklenen ve teknoloji MOST104-2311-B-010-010-MY3, verir MOST106-2321-B-010-012, Ulusal Sağlık araştırma enstitüleri NHRI-EX106-10429NI ve seçme alanlarda araştırma merkezi programı hibe verin Eğitim Bakanlığı aracılığıyla beyin Araştırma Merkezi, Ulusal Yang Ming Üniversitesi Tayvan, ve doktora sonrası bursu MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 ve MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.) verir.

Burada anlatılan hayvan iletişim kuralları hayvan bakımı ve kullanımı komiteler Ulusal Yang Ming Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlanması sahibi için yenidoğan Pups içinde stereotaksik aparatı
<ol><li>Baş tepsi olun: 1/5 Tüp duvarı kaldırarak yenidoğan pups Başkanı uygun şekil 1.5 mL santrifüj tüpü (15 mm uzun) alt kesti.</li>
	<li>Stereotaksik aparatı Kaide ile uygun doğru boyutta bir pipet ucu kutusu ve üst kapağı sökün. Adım 1.1 ve doku gömme kaset ipucu tepsi sıcak-erime yapıştırıcı ile temeli üzerine hazırlanan baş tepsi yapıştırmayın. 7 mm, PUPs boyun ve gövde baş-sabit konumda desteklemek için kullanılan doku gömme kaset yüksekliğidir.</li>
	<li>Tüm kurulum bir standart stereotaksik aparatı yerleştirin.</li>
</ol>2. 30G Enjeksiyon paslanmaz çelik iğneler hazırlanması
<ol><li>30 G şırınga iğneleri için 3 gün içinde kloroform ıslatarak önceden temiz.</li>
	<li>Forseps dikkatli ve yavaş bir kimyasal başlıklı Polipropilen hub üzerinden iğneyi çıkar için kullanın.</li>
	<li>Mutlak etanol iğnelerle bir shaker 50 RPM üzerinde % 70 etanol durular 3 × 10 dk ardından 20 dakika yıkayın. Kuru ve temiz bir kutu, oda sıcaklığında (RT) temizlenmiş iğneler depolamak iğneler hava kadar kullanmak izin.</li>
</ol>3. bir bağdaştırıcı mikroenjeksiyon boruları hazırlayın
<ol><li>Microliter şırınga 30 G Enjeksiyon iğne PE10 Polietilen boru (PE10 tüp) ile bağlayın. PE20 Polietilen boru (PE20 tüp) adaptör enjeksiyon iğne ve microliter şırınga köprülemesini için hazırlayın. PE10 tüp çapı 26 G microliter şırınga iğne daha küçük olduğu için adaptör kullanımı gereklidir.</li>
	<li>Microliter enjektör boruları hazırlayın: önceden temizlenmiş 30G Enjeksiyon iğne PE20 tüp ile 5 cm bağlanmak ve anlık tutkal ile birleşme mühür. Bu boru adaptörü yeniden kullanılabilir. Not: iğne mikroenjeksiyon şırınga 30 G ise, hazırlık (adım 3.1) ve bu adaptörü (adım 3.3) kullanımını gerekli değildir.</li>
	<li>(3.1 adımda hazırlanan) boru adaptörü microliter şırınga (10 µL) takın.</li>
	<li>PE10 (60 cm uzun) tüp PE20 boru adaptörü 30 G iğne üzerine bir ucunu bağlayın. Yeni 30 G Enjeksiyon iğne üzerine PE10 tüp diğer ucunu bağlayın.</li>
</ol>4. yük Autoclaved distile su, boya ve virüsler ile mikroenjeksiyon tüp
<ol><li>Microliter şırınga pistonu çıkarın. 25 G şırınga microliter şırınga ve onun bağlı PE boru boru gelen havayı çıkarmak için autoclaved distile su ile yüklemek için kullanın.</li>
	<li>Geri microliter şırınga fırlatıcıya yerleştirin ve pistonu 2 µL distile su kalır varil kadar itin. 2 µL düşük hale distile su hacmi izin vermeyin.</li>
	<li>Dikkatle microliter şırınga mikro akış hızı şırınga pompa üzerine monte.</li>
	<li>Küçük miktarlarda (% 0,9 serum içinde hazırlanan ve 0,22 µm filtre ile filtre) %0.1 hızlı yeşil boya ve bir parça parafilm virüs sıvı pipet.</li>
	<li>Az miktarda hava bir hava kabarcığı mikroenjeksiyon tüp sıvı akışını sınamak için 30 G Enjeksiyon iğne ve tüpün içine süzülmüş hızlı yeşil 0.7 µL yükleyerek takip PE10 tüp arasındaki kavşakta görünür yapmak için geri alıyorum.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon boru içine virüs sıvılar yükleyerek ardından ikinci bir hava kabarcığı yapmak hava küçük bir miktar geri alıyorum.</li>
	<li>Takın ve 30 G mikroenjeksiyon iğne kolu stereotaksik aygıtının güvenli.</li>
</ol>5. anestezi hipotermi tarafından yenidoğan farelerin
<ol><li>Yavru bir lateks eldiven kol koyun ve 5 min için boyun kadar ezilmiş buz bırakın.</li>
	<li>Pups ayak forseps ile para çekme yanıt onun ayak emin olmak için çimdik.</li>
	<li>Lateks eldiven kol ile yavru baş tepsisine yerleştirin ve hipotermi anestezi için soğuk tutmak için lateks kol çevresinde bazı ezilmiş buz koyun.</li>
	<li>Veteriner merhem pups gözünü anestezi altında iken kuruluk mümkünse önlemek için geçerlidir.</li>
</ol>6. mikroenjeksiyon
<ol><li>Steril Cerrahi stereotaksik araç % 70 etanol ile iyice silerek hazırlayın. Cerrahi alet % 70 etanol çeker tarafından sterilize.</li>
	<li>Pups kafa % 70 etanol ile fırçalayın. Kafatasında Simgesel Yapı lambda bulun ve lambda marker kalemle işaretlemek. Lambda için iğne ucu amaç ve ön-arka (AP) ve medial-lateral (ML) koordinatları sıfır ayarlayın.</li>
	<li>Enjeksiyon kol hedef site X ve Y koordinatlarını göre hedef siteye taşımak. Doğum sonrası gün (P) 2 striatum için pups, Koordinatlar: AP, 2,4 mm anterior lambda; ML, ±1.0 mm orta hat yanal; dorsal-ventral (DV), kafatası mm'den −1.7. PE10 tüp hızlı yeşil boya bulunduğu bir kalemle işaretlemek.</li>
	<li>30 G Enjeksiyon iğne yavaş yavaş deri ve kafatası nüfuz ve kafatası yüzeyde durana kadar iğne ucu kadar alın. DV konumu sıfır ayarlayın.</li>
	<li>Hedef site DV koordinatı ulaşıncaya kadar 30 G Enjeksiyon iğne yavaşça. Sürdürme normal şeklini parankimi izin vermek 1 dakika bekleyin. Mikroenjeksiyon çalıştırın (100 nL/dk).</li>
	<li>Hızlı yeşil boya işareti virüs sıvı beyne enjekte edilir emin olmak için PE tüp hareketli olduğundan emin olun.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon fesih sonra 1 dakika bekleyin ve sonra yavaş yavaş ve aşamalı olarak iğneyi DV derinliği 30 içinde 1/2 yüksekliğine getirmek s. Sonra 30 s, yavaş yavaş iğne pups başından çekilme.</li>
	<li>Microinjections tüm hedeflenen sitelerin tamamlanıncaya kadar 6.2-6,7 adımları yineleyin.</li>
</ol>7. ameliyat sonrası kurtarma yavru
<ol><li>Yavru için 33 ° C kuluçka 20 dk kadar sıcak. Yavru fok sternal recumbency korumak için yeterli bilinci yerine geldi kadar yavru fok kurtarma hipotermi anestezi her 5 dk dan kontrol edin.</li>
	<li>Yavru fok tamamen iyileşti sonra yavru fok baraja geri dönün.</li>
</ol>

<ol><li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).</li>
<li>Tau, G. Z., Peterson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+development+of+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Normal development of brain circuits.</a> Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).</li>
<li>Mitchell, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+neurodevelopmental+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The genetics of neurodevelopmental disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).</li>
<li>Sahin, M., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+circuits%2C+and+precision+therapies+for+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders.</a> Science. 350 (6263), (2015).</li>
<li>Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+microinjection+of+viral+vectors+expressing+Cre+recombinase+to+study+the+role+of+target+genes+in+cocaine+conditioned+place+preference%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference.</a> J. Vis. Exp. (77), e50600(2013).</li>
<li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice%3A+a+neurosurgical+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Bull%22%5BJournal%5D)">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).</li>
<li>Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microinjection+technique+for+targeting+regions+of+embryonic+and+neonatal+mouse+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo.</a> Brain Res. 1307, 43-52 (2010).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neostriatal+mosaic%3A+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuit%22%5BJournal%5D)">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72(2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu da çalışmanın, yenidoğan fare beyni striatum AAV virüs enjekte için basit ve güvenilir stereotaksik yöntem gösterilmektedir. Biz P2, Ai14 muhabir farelerin striatum içine AAV-eGFP-Cre virüs microinjected ve muhabir gen ekspresyonu P14, analiz ettik. AAV GFP pozitif hücreler boyunca striatum, rostrocaudal düzeyde transduced bulduk. Ayrıca, neredeyse tüm GFP pozitif hücreler AAV aracılı ifade Cre faaliyet tarafından indüklenen başarılı bir Cre-loxP DNA rekombinasyon düşündüren tdTomato muhabir gen striatal hücrelerdeki ...

Modern çalışmalar yapısı ve beyin fonksiyonu genellikle belirli genler nöronal hücrelerdeki genetik manipülasyon gerektirir. Farklı genler, transgenik fareler de dahil olmak üzere mutant gen taşıyan fonksiyonlar soruşturma için nakavt ve çakma allelleri düzenli olarak yeniden üretilmedi. Stereotaksik beyin ameliyatı yetişkin kemirgen için yerel olarak uyuşturucu, virüsler, izleyiciler ve diğer kimyasalları kemirgen beyin1,2özel bölgeler için teslim etmek için standart bir yöntemdir. Stereotaksik beyin ameliyatı transgenik fareler için uygulama bir genetik olarak gen fonksiyon ve fare beynin belirli nöron popülasyonları nöronal aktivite işlemek için izin verir. Hücre türüne özgü işleme karmaşık sinir devreleri beyin3,4,5nöronal işlevlerinde deşifre etmek için güçlü bir yaklaşım sağlar.
Sinir sisteminin sinirsel gelişme aşamalarında erken embriyonik başlar ve gelişim süreçleri Juvenil dönemine kadar doğumdan sonra devam edin. Postnatal olgunlaşma sinir sistemi beyin6fizyolojik ve bilişsel işlevler için temel sinir devreleri, hassas sinaptik kablolama içerir. Bu nedenle, yenidoğan zaman pencerelerde oluşan gelişimsel olaylarını eğitim sadece normal sinirsel gelişim anlamak için önemlidir, ancak de nörogelişimsel ve Nöropsikiyatrik bozukluklar7 patogenezinde anlayışlar sağlayabilir ,8. Stereotaksik beyin ameliyatı yöntemleri yetişkin kemirgen için hazır2,9, olmasına rağmen birkaç protokolleri stereotaksik beyin ameliyatı yenidoğan fareler10,11' deki yönergeleri için Internet üzerinde kullanılabilir. Yenidoğan yavru Başkanı standart stereotaksik aparatı düzeltilmesi için çok kırılgan olduğu için aslında, reaktifler stereotaksik microinjections yenidoğan fare pups beyinlerinin içine, zordur. Yine de, stereotaksik beyin ameliyatı uygulamaya transgenik farelerde neonatal fareler12için mümkün olabilir. Burada, yeni doğmuş fare pups içinde stereotaksik beyin ameliyatı gerçekleştirmek için ev yapımı bir kurulum ile basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik bir muhabir gen fareler ve koşullu olarak floxed transgenik fareler striatum AAV ifade Cre DNA recombinase microinjecting tarafından floxed genler koşullu olarak silmek izin verdiğini göstermektedir. Bu teknik aynı zamanda reaktifler vahşi tipi farelerin striatum yenidoğan sunmak için geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>30G PrecisionGlide İğne</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 305106</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton MİKROLITRE Şırınga</td><td>Hamilton&nbsp;</td>PE10 tüp için <td>80300</td><td>30G iğne fit; 26G iğne bir PE20 adaptörüne ihtiyaç duyar</td></tr><tr><td>Polietilen boru PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen boru PE10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Akış Hızı Şırınga Pompası</td><td>Daha Uzun Hassas Pompa Co.</td><td>TJ-2A (Denetleyici) ve L0107-2A (Sürücü Ünitesi)</td><td></td></tr> <tr><td>25G şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 302105</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı yeşil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>%0.1</td></tr> <tr><td>Standart Stereotaksik Aletler</td><td>RWD Yaşam Bilimleri</td><td>68037</td><td>68030 kullanmadan Fare / Yenidoğan Sıçan Adaptörü</td></tr><tr><td>Anti-FOXP2 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab16046</td><td>FOXP2'ye tavşan poliklonal, 1: 4.000</td></tr><tr><td>Anti-RFP antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab65856</td><td>RFP'ye fare monoklonal, 1:1.000</td></tr><tr><td>BX63 mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan konjuge Alexa fluor594</td><td>Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td><td>111-585-003</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td><td>Penn Vektör Çekirdeği</td><td>AV-9-PV1848</td><td>Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)</td></tr><tr><td>AAV9.chicken aktin-eGFP</td><td>AAV çekirdeği, Biyomedikal Bilimler Enstitüsü, Academia Sinica, Tayvan</td><td>N/A</td><td>1x1014 (GC/ml)</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J</td><td>Jackson Laboratuvarı&nbsp;</td><td>007914</td><td>Ai14</td></tr><tr><td>B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td><td>Jackson Laboratuvarı&nbsp;</td><td>026259</td><td>Foxp2fl/fl</sup</td></tr><tr><td>>Dulbecco' s fosfat tamponlu salin</td><td>Corning&nbsp; cellgro</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr></tbody></table>

yenidoğan fare beyin striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Birçok genler embriyonik beyinlerinde ifade edilir ve bazıları sürekli doğumdan sonra beyinde ifade edilir. Israrla ifade böyle genler için gelişimsel süreci ve/veya neonatal beynindeki fizyolojik fonksiyon düzenlemek için çalışmayabilir. Beyindeki belirli genlerin nörobiyolojik işlevleri araştırmak için beyindeki genleri devre dışı bırakabilirsiniz esastır. Burada, striatum gen ifadesinde transgenik fareler yenidoğan zaman Windows devre dışı bırakabilirsiniz için basit bir stereotaksik yöntem açıklanmaktadır. AAV-eGFP-Cre virüs Ai14 muhabir gen fareler striatum Doğum sonrası gün (P) 2 stereotaksik beyin ameliyatı tarafından microinjected. TdTomato muhabir gen ekspresyonu P14 striatum, başarılı bir Cre-loxP DNA rekombinasyon AAV transduced striatal hücrelerdeki aracılı düşündüren tespit edildi. Daha fazla bu teknik AAV-eGFP-Cre virüs P2Foxp2fl/fl fareler microinjecting tarafından doğrulanmış. Çift etiketleme GFP ve Foxp2 GFP pozitif hücreler P9 striatum, AAV-eGFP-Cre transduced striatal hücrelerdeki Foxp2 protein kaybı düşündüren Foxp2 immunoreactivity yoksun gösterdi. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar yenidoğan beynindeki belirli nöron popülasyonları floxed transgenik fareler Stereotaxic microinjected AAV-eGFP-Cre virüsler tarafından etkili bir genetik silme işlemini göstermektedir. Sonuç olarak, bizim stereotaksik tekniği yenidoğan fare beynindeki genetik manipülasyon için kolay ve basit bir platform sağlar. Bu teknik sadece genler, yenidoğan beyinlerinin belirli bölgelerde silmek için kullanılamaz, ancak farmakolojik ilaçlar, nöronal izleyiciler, genetiği değiştirilmiş optogenetics ve chemogenetics proteinler, nöronal aktivite göstergelerini enjekte etmek için de kullanılabilir ve diğer reaktifler striatum, yenidoğan fare beyinlerinin içine.

Deney ilk kümesi için biz 200 microinjected nL Cre DNA recombinase hızlı AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virüs (AAV-eGFP-Cre, Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz 1/10 seyreltme) erimiş GFP ile Ai14 farelerin P2 striatum. Ai14 fareler tdTomato muhabir gen Cre-aracılı silme (floxed) loxP çevrili STOP kaset (2F rakam) üzerine hızlı. Beyin P14 GFP ve tdTomato immunostaining için hasat edildi. Birçok AAV GFP pozitif hücreler transduced hediye (<strong class="xfi...

Biz yenidoğan fare beyni striatum microinjecting reaktifler için ev yapımı bir baş-sabit aygıt ile bir protokol stereotaksik cerrahi açıklamak. Bu teknik, yenidoğan fare beyni, özel bölgelerin nöronal hücrelerin genetik manipülasyon sağlar.

Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Bu yöntem, doğum sonrası gelişim gibi genetik ve nöro gelişimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ev yapımı cihazla basit bir teknik olmasıdır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü beyne hedefli enjeksiyonlar yapmak ayrıntılara tam dikkat gerektirir.Başlamak için, yenidoğan yavrularını stereotaksik bir aparatta kullanmak için bir tutucu yapın. İlk önce baş tepsisini yapın. Yenidoğan yavrusunun başı için bir açıklık yapmak için 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpünün tabanının yaklaşık 1 / 5'ini kesin.Ardından, stereotaksik aparatın kaidesine uyan boş bir pipet ucu kutusu seçin. Ardından, başlık tepsisini uç kutusunun tabanına sabitlemek için sıcak tutkal kullanın. Ardından, kafası sabitken yavrunun gövdesini destekleyebileceği kutuya bir doku gömme kaseti yapıştırın.Şimdi enjeksiyon için 30 gauge paslanmaz çelik iğneler hazırlayın. İlk olarak, bir cam şişede üç gün boyunca kloroformda bekleterek önceden temizleyin. Üç gün sonra, iğneleri dikkatlice çıkarın ve 20 dakika boyunca mutlak etanol ile ve 50 rpm çalkalama ile yıkayın.Daha sonra, yıkama başına 10 dakika boyunca% 70 etanol içinde üç kez, ayrıca çalkalama ile yıkayın. Yıkadıktan sonra iğneleri kurumaya bırakın ve kullanılana kadar oda sıcaklığında temiz bir kutuda saklayın. Mikroenjeksiyon düzeneği için, PE10 borusunu 26 gauge 10 mikrolitrelik bir şırıngaya köprülemek için beş santimetrelik bir PE20 polietilen boru segmenti kullanın.Bağlantıyı siyanoakrilat ile sabitleyin. Ardından, yeni 30 gauge enjeksiyon iğnesini PE10 tüpünün diğer ucuna monte edin. Şimdi 10 mikrolitrelik mikroenjeksiyon şırıngasını yükleyin.Pistonu çıkarın ve borudaki havayı çıkarmak için tertibatı otoklavlanmış damıtılmış su ile geri yüklemek için 25 gauge başka bir şırınga kullanın. Ardından pistonu mikrolitre şırıngaya geri yerleştirin ve pistonu namluda sadece iki mikrolitre damıtılmış su kalana ve daha az olmayana kadar itin. Ardından, mikrolitre şırıngayı mikro akışlı şırınga pompasına dikkatlice monte edin.Daha sonra, deneysel virüs sıvılarında küçük miktarlarda filtrelenmiş %0.1 Hızlı Yeşil boyayı bir parça parafilm üzerine pipetleyin. Şimdi, enjeksiyon iğnesi ile boru arasında bir hava kabarcığı görünene kadar şırıngaya az miktarda hava aspire edin. Ardından, mikroenjeksiyon tüpündeki sıvıların akışını test etmek için 0,7 mikrolitre filtrelenmiş Fast Green solüsyonu yükleyin.Akış iyiyse, ikinci bir hava kabarcığı yapmak için küçük bir hacim daha hava aspire edin ve ardından enjeksiyon solüsyonunu mikroenjeksiyon tüpüne yükleyerek takip edin. Mikroenjeksiyon iğnesini stereotaksik cihaza takın ve sabitleyin ve yenidoğan farelerin mikroenjeksiyonuna devam edin. Ameliyata hazırlanırken, stereotaksik aleti %70 etanol ile iyice silin ve cerrahi aletleri %70 etanol ile sterilize edin.Daha sonra hipotermi kullanarak bir yenidoğanı uyuşturun. Yavruyu bir lateks eldivenin içine yerleştirin ve beş dakika boyunca boynuna kadar kırılmış buza batırın. Ardından, pedal refleksi olmadığından emin olmak için yavrunun ayaklarını forseps ile sıkıştırın.Ardından, yavruyu eldivenle birlikte baş tepsisine yerleştirin ve hipotermi anestezisini sürdürmek için lateks manşonun etrafına biraz kırılmış buz koyun. Ardından yavrunun kafasını %70 etanol ile ovalayın ve lambda dönüm noktasını bulun. Bir işaretleyici ile işaretleyin.Ardından iğne ucunu lambdaya doğrultun ve ön/arka ve medial/lateral koordinatları sıfıra ayarlayın. Daha sonra, bir beyin atlasına danışarak, enjeksiyon kolunu hedef bölgeye hareket ettirin. Örneğin, P2 yavrularının striatumu lambdanın 2.4 milimetre önünde, orta hattın her iki tarafında 1.0 milimetre ve ventralde 1.7 milimetredir.Ardından, bir kalem kullanarak Hızlı Yeşil boyanın PE10 tüpü üzerindeki konumunu işaretleyin. Daha sonra, iğne ucu kafatasının yüzeyine temas edene kadar iğneyi deriden ve kafatasından yavaşça nüfuz etmeye başlayın. Sırt/ventral koordinatı sıfır olarak ayarlayın.Ardından iğneyi yavaşça hedef bölgeye indirin. Yerleştirildikten sonra, parankimin normal şekline dönmesine izin vermek için bir dakika bekleyin. Daha sonra mikroenjeksiyon programını dakikada 100 nanolitre hızında çalıştırın.Enjeksiyon sırasında, Hızlı Yeşil boyanın PE borudaki hareketini izleyin. İğne ucu kafatasının yüzeyine temas edene kadar iğneyi deriden ve kafatasından yavaşça nüfuz ettirmek çok önemlidir. Enjeksiyon sırasında, Hızlı Yeşil boyanın PE boruda hareket etmesini izlemek zorunludur.Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, bir dakika bekleyin ve ardından iğneyi yavaşça nüfuz edilen DV derinliğinin 1 / 2'sine getirin. Ardından, iğneyi yavrunun kafasından yavaşça çekmeye devam etmeden önce 30 saniye daha bekleyin. Enjeksiyonun tamamlanmasından sonra, iğneyi yavaşça nüfuz edilen DV derinliğinin 1 / 2'sine getirmeden önce bir dakika beklemek önemlidir.Ardından, iğneyi yavrunun kafasından yavaşça çekmeden önce 30 saniye daha bekleyin. Hedeflenen tüm bölgelere enjekte edildikten sonra, yavruyu 33 santigrat derecelik bir inkübatörde 20 dakika ısıtın. Sternal yaslanma kendini kazanana kadar yavruyu her beş dakikada bir kontrol edin.Daha sonra yavruyu barajına geri koyun. GFP ile kaynaşmış Cre DNA rekombinaz eksprese eden 200 nanolitre virüs, Ai14 farelerinin P2 striatumuna enjekte edildi. Bu fareler, bir loxP yan durdurma kasetinin Cre aracılı silinmesi üzerine tdTomato raportör genini ifade etti.Beyinler, GFP ve tdTomato'nun immün boyaması için P14'te toplandı. Striatum boyunca birçok AAV transdüksiyonlu GFP pozitif hücre mevcuttu, bu da striatal hücrelerin AAV EGFP Cre virüsleri tarafından geniş bir enfeksiyona uğradığını gösteriyordu. TdTomato'nun benzer geniş ekspresyonu striatumda da bulundu.Yüksek büyütmede mikroskobik incelemede, açıkça tüm GFP pozitif striatal hücrelerin tdTomato raportör genini birlikte eksprese ettiği bulundu. Ayrıca, globus pallidus'taki muhtemelen akson terminallerinde, substantia nigra pars reticulata'da, striatonigral ve striatopallidal projeksiyon nöronlarının hedef bölgelerinde tdTomato sinyalleri tespit edildi. Birlikte, bu sonuçlar, yenidoğan striatal nöronlarında Cre aktivitesinin AAV aracılı ekspresyonu ile indüklenen başarılı bir Cre loxP aracılı DNA rekombinasyonunu göstermektedir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bilateral striatal enjeksiyon için 30 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bunun sabır ve dikkat gerektiren hassas bir yenidoğan beyin ameliyatı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu prosedürden, doğum sonrası gelişim sırasındaki olgunlaşmayı analiz etmek için optogenetik ve kemogenetik gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

stereotaxic-surgery-for-genetic-manipulation-striatal-cells-neonatal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Stereotaksik koordinatları kullanarak excitotoxin infüzyonu ile belirli beyin bölgesinin Hedefli ablasyonu (ler) tarif edilir. Bu teknik aynı zamanda sıçan beyin içine diğer kimyasalların infüzyon için adapte edilebilir.

Yetişkin Rat spesifik Beyin Alanlarının eksitotoksik Lezyon için Stereotaksik Cerrahi

Somatik kök hücre genişleme kontrolü kendi çalışma ve tedavide kullanımı engelleyen önemli bir faktördür. Burada geçici olarak fare beyin üretilen nöron sayısını artırmak için kullanılabilir geliştirme ve yetişkinlik döneminde nöral kök hücrelerinin genişlemesi, kontrol etmek için bir sistemi tanımlamak.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Kaynak: Porlan, E., et al. Nöral Kök Hücre Özerk ve Özerk Olmayan Etkilerin Analizi için Yetişkin Fare V-SVZ'de Hücrelerin Kararlı ve Verimli Genetik Modifikasyonu. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, bir fare modelinde virüs taşıyan bir terapötik genin stereotaksik enjeksiyonu yoluyla ventriküler-subventriküler bölgedeki (V-SVZ) nöral kök hücrelerin (NSC'ler) stabil genetik modifikasyonunu göstermektedir. Virüs NSC'lere girer, ters transkripsiyona uğrar, genoma entegre olur ve nöroterapötik...

Bir fare modelinde stabil genetik modifikasyon için virüslerin stereotaksik enjeksiyonu

Bu videoda, yenidoğan farelerin ventriküllerine enjekte edilen transpozon DNA'yı kullanarak glioblastomları (GBM) indüklemek için etkili bir teknik açıklanmaktadır. Plazmidi alan subventriküler bölgenin hücreleri, insan GBM'sinin histopatolojik özelliklerine sahip tümörleri dönüştürür, çoğalır ve oluşturur.

SB Aracılı Transpozisyon Kullanılarak Glioblastoma İndüksiyonu: SB Plazmidinin Yenidoğan Fare Beynine Transpozon Aracılı Entegrasyonu Kullanılarak Yeni Fare Modeli Oluşturmak İçin Bir Teknik

Kaynak: Chen, S., et al., Yenidoğan Fare Beyinlerinin Striatal Hücrelerinde Genetik Manipülasyon için Stereotaksik Cerrahi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, Cre rekombinaz ve yeşil floresan proteini veya GFP'yi kodlayan bir viral vektörün, bir loxP ile çevrili STOP kasetini eksize ederek, kırmızı floresan proteinini veya RFP'yi bir raportör olarak aktive ederek gen manipülasyonu elde etmek için genetik olarak değiştirilmiş bir fare yavrusunun striatumuna stereotaksik enjeksiyonunu göstermektedir.

Bir Fare Yavrusu Striatumunda Gen Manipülasyonu için Viral Bir Vektörün Stereotaktik Mikroenjeksiyonu

Kaynak: Fricano-Kugler, C. J., et al. Stereotaksik enjeksiyon yoluyla yüksek titreli CRISPR retro ve Lentivirüslerin tasarımı, paketlenmesi ve teslimi. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, fare beyninde hassas nöronal gen düzenlemesi için stereotaksik viral enjeksiyonu göstermektedir. Protokol, dentat girusa doğru virüs iletimini sağlayarak, nöral devreleri, gen fonksiyonunu ve hastalık mekanizmalarını in vivo olarak incelemek için floresan etiketleme ve CRISPR aracılı gen nakavtını mümkün kılar.

Fare beyninde hedeflenen nöronal gen düzenlemesi için stereotaksik viral enjeksiyon

Kaynak: Gonzalez-Ramos, A., et. al., Nörogelişimsel Bozuklukları Azaltmak için İnsan Kök Hücre Kaynaklı GABAerjik Nöronların Erken Doğum Sonrası Fare Hipokampüsüne Nakli. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, uyarıcı-inhibitör dengeyi yeniden sağlamayı amaçlayan, azaltılmış inhibitör internöronlara sahip genetik olarak değiştirilmiş bir fare yavrusunun hipokampüsüne insan kaynaklı internöron öncü hücrelerinin stereotaksik enjeksiyonunu göstermektedir.

İnsan Kaynaklı İnternöron Öncü Hücrelerinin Fare Yavrusu Hipokampusuna Nakli

Burada, erişkin ventriküler-subventriküler nörojenik nişteki nöral kök hücrelerin ve/veya bunların bitişik ependimal hücrelerinin uzun vadeli genetik modifikasyonu için lentiviral partiküllerin kullanımına dayanan ve nöral kök hücreler üzerindeki hücre otonom ve otonom olmayan, nişe bağlı etkilerin ayrı ayrı analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz.

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Biz lentiviral bir tek koku alma duyu nöron akson genetik manipülasyon ve görselleştirme tekniği ve terminal arborization...

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Kemirgenler üzerinde stereotaksik cerrahi, ilaçlar ya da uyanık davranmak hayvanlar elektriksel stimülasyon ve kayıtları, hedeflenen yönetim için izin verir. Bu video sunumu biz bu uzun soluklu bir prosedür başarıyla sağkalım oranı ve düşük ameliyat sonrası kilo kaybı son usul ayrıntılandırmaları gösterecektir.

Behavioral Neuroscience Kemirgen Stereotaksik Cerrahi ve Hayvan Refahı Sonuç İyileştirmeler

Öğrenin, yeni doğan fare beynindeki striatal hücrelerde genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi yöntemini. Bu teknik, ev yapımı bir cihaz kullanarak hassas mikroenjeksiyonlar yapmayı ve erken nörogelişim süreçlerini incelemeyi mümkün kılar.

Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Daha fazla video keşfet