Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Bu yöntem, doğum sonrası gelişim gibi genetik ve nöro gelişimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ev yapımı cihazla basit bir teknik olmasıdır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü beyne hedefli enjeksiyonlar yapmak ayrıntılara tam dikkat gerektirir.

Başlamak için, yenidoğan yavrularını stereotaksik bir aparatta kullanmak için bir tutucu yapın. İlk önce baş tepsisini yapın. Yenidoğan yavrusunun başı için bir açıklık yapmak için 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpünün tabanının yaklaşık 1 / 5'ini kesin.

Ardından, stereotaksik aparatın kaidesine uyan boş bir pipet ucu kutusu seçin. Ardından, başlık tepsisini uç kutusunun tabanına sabitlemek için sıcak tutkal kullanın. Ardından, kafası sabitken yavrunun gövdesini destekleyebileceği kutuya bir doku gömme kaseti yapıştırın.

Şimdi enjeksiyon için 30 gauge paslanmaz çelik iğneler hazırlayın. İlk olarak, bir cam şişede üç gün boyunca kloroformda bekleterek önceden temizleyin. Üç gün sonra, iğneleri dikkatlice çıkarın ve 20 dakika boyunca mutlak etanol ile ve 50 rpm çalkalama ile yıkayın.

Daha sonra, yıkama başına 10 dakika boyunca% 70 etanol içinde üç kez, ayrıca çalkalama ile yıkayın. Yıkadıktan sonra iğneleri kurumaya bırakın ve kullanılana kadar oda sıcaklığında temiz bir kutuda saklayın. Mikroenjeksiyon düzeneği için, PE10 borusunu 26 gauge 10 mikrolitrelik bir şırıngaya köprülemek için beş santimetrelik bir PE20 polietilen boru segmenti kullanın.

Bağlantıyı siyanoakrilat ile sabitleyin. Ardından, yeni 30 gauge enjeksiyon iğnesini PE10 tüpünün diğer ucuna monte edin. Şimdi 10 mikrolitrelik mikroenjeksiyon şırıngasını yükleyin.

Pistonu çıkarın ve borudaki havayı çıkarmak için tertibatı otoklavlanmış damıtılmış su ile geri yüklemek için 25 gauge başka bir şırınga kullanın. Ardından pistonu mikrolitre şırıngaya geri yerleştirin ve pistonu namluda sadece iki mikrolitre damıtılmış su kalana ve daha az olmayana kadar itin. Ardından, mikrolitre şırıngayı mikro akışlı şırınga pompasına dikkatlice monte edin.

Daha sonra, deneysel virüs sıvılarında küçük miktarlarda filtrelenmiş %0.1 Hızlı Yeşil boyayı bir parça parafilm üzerine pipetleyin. Şimdi, enjeksiyon iğnesi ile boru arasında bir hava kabarcığı görünene kadar şırıngaya az miktarda hava aspire edin. Ardından, mikroenjeksiyon tüpündeki sıvıların akışını test etmek için 0,7 mikrolitre filtrelenmiş Fast Green solüsyonu yükleyin.

Akış iyiyse, ikinci bir hava kabarcığı yapmak için küçük bir hacim daha hava aspire edin ve ardından enjeksiyon solüsyonunu mikroenjeksiyon tüpüne yükleyerek takip edin. Mikroenjeksiyon iğnesini stereotaksik cihaza takın ve sabitleyin ve yenidoğan farelerin mikroenjeksiyonuna devam edin. Ameliyata hazırlanırken, stereotaksik aleti %70 etanol ile iyice silin ve cerrahi aletleri %70 etanol ile sterilize edin.

Daha sonra hipotermi kullanarak bir yenidoğanı uyuşturun. Yavruyu bir lateks eldivenin içine yerleştirin ve beş dakika boyunca boynuna kadar kırılmış buza batırın. Ardından, pedal refleksi olmadığından emin olmak için yavrunun ayaklarını forseps ile sıkıştırın.

Ardından, yavruyu eldivenle birlikte baş tepsisine yerleştirin ve hipotermi anestezisini sürdürmek için lateks manşonun etrafına biraz kırılmış buz koyun. Ardından yavrunun kafasını %70 etanol ile ovalayın ve lambda dönüm noktasını bulun. Bir işaretleyici ile işaretleyin.

Ardından iğne ucunu lambdaya doğrultun ve ön/arka ve medial/lateral koordinatları sıfıra ayarlayın. Daha sonra, bir beyin atlasına danışarak, enjeksiyon kolunu hedef bölgeye hareket ettirin. Örneğin, P2 yavrularının striatumu lambdanın 2.4 milimetre önünde, orta hattın her iki tarafında 1.0 milimetre ve ventralde 1.7 milimetredir.

Ardından, bir kalem kullanarak Hızlı Yeşil boyanın PE10 tüpü üzerindeki konumunu işaretleyin. Daha sonra, iğne ucu kafatasının yüzeyine temas edene kadar iğneyi deriden ve kafatasından yavaşça nüfuz etmeye başlayın. Sırt/ventral koordinatı sıfır olarak ayarlayın.

Ardından iğneyi yavaşça hedef bölgeye indirin. Yerleştirildikten sonra, parankimin normal şekline dönmesine izin vermek için bir dakika bekleyin. Daha sonra mikroenjeksiyon programını dakikada 100 nanolitre hızında çalıştırın.

Enjeksiyon sırasında, Hızlı Yeşil boyanın PE borudaki hareketini izleyin. İğne ucu kafatasının yüzeyine temas edene kadar iğneyi deriden ve kafatasından yavaşça nüfuz ettirmek çok önemlidir. Enjeksiyon sırasında, Hızlı Yeşil boyanın PE boruda hareket etmesini izlemek zorunludur.

Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, bir dakika bekleyin ve ardından iğneyi yavaşça nüfuz edilen DV derinliğinin 1 / 2'sine getirin. Ardından, iğneyi yavrunun kafasından yavaşça çekmeye devam etmeden önce 30 saniye daha bekleyin. Enjeksiyonun tamamlanmasından sonra, iğneyi yavaşça nüfuz edilen DV derinliğinin 1 / 2'sine getirmeden önce bir dakika beklemek önemlidir.

Ardından, iğneyi yavrunun kafasından yavaşça çekmeden önce 30 saniye daha bekleyin. Hedeflenen tüm bölgelere enjekte edildikten sonra, yavruyu 33 santigrat derecelik bir inkübatörde 20 dakika ısıtın. Sternal yaslanma kendini kazanana kadar yavruyu her beş dakikada bir kontrol edin.

Daha sonra yavruyu barajına geri koyun. GFP ile kaynaşmış Cre DNA rekombinaz eksprese eden 200 nanolitre virüs, Ai14 farelerinin P2 striatumuna enjekte edildi. Bu fareler, bir loxP yan durdurma kasetinin Cre aracılı silinmesi üzerine tdTomato raportör genini ifade etti.

Beyinler, GFP ve tdTomato'nun immün boyaması için P14'te toplandı. Striatum boyunca birçok AAV transdüksiyonlu GFP pozitif hücre mevcuttu, bu da striatal hücrelerin AAV EGFP Cre virüsleri tarafından geniş bir enfeksiyona uğradığını gösteriyordu. TdTomato'nun benzer geniş ekspresyonu striatumda da bulundu.

Yüksek büyütmede mikroskobik incelemede, açıkça tüm GFP pozitif striatal hücrelerin tdTomato raportör genini birlikte eksprese ettiği bulundu. Ayrıca, globus pallidus'taki muhtemelen akson terminallerinde, substantia nigra pars reticulata'da, striatonigral ve striatopallidal projeksiyon nöronlarının hedef bölgelerinde tdTomato sinyalleri tespit edildi. Birlikte, bu sonuçlar, yenidoğan striatal nöronlarında Cre aktivitesinin AAV aracılı ekspresyonu ile indüklenen başarılı bir Cre loxP aracılı DNA rekombinasyonunu göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bilateral striatal enjeksiyon için 30 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bunun sabır ve dikkat gerektiren hassas bir yenidoğan beyin ameliyatı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu prosedürden, doğum sonrası gelişim sırasındaki olgunlaşmayı analiz etmek için optogenetik ve kemogenetik gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.