Name: Lipid dizin belirlenmesi mantar patojen Ustilago Maydis sıvı Floresans kurtarma tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Öğrenin lipid damlacık indeksini belirlemeyi Ustilago maydis hücrelerinde BODIPY 493/503 kullanarak. Bu yüksek verimli yöntem, lipid metabolizması ve biyoteknoloji araştırmalarında yağ birikim dinamiklerini incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser hibe tarafından desteklenen Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-YUDUM-20170864), Programa de Apoyo Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-Universidad Nacional Autonoma de México () UNAM) ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP ve 256520-yumurta). Fundação de Amparo bir Pesquisa yapmak Rio de Janeiro (FAPERJ-Cientistas Nosso Estado yapın: E 26/103.353/2011). Biz QFB sayesinde. Oscar Iván Luqueño Bocardo şematik genel bakış. Biz Dr Miguel Tapia Rodríguez LDS confocal mikroskobu değerli yardım için teşekkür ederim. Dr. Bruno Bozaquel Morais U. maydisiçin uyarlanmış S. cerevisiae teknikte gelişmekte olan öncü çalışmaları için teşekkür etmek istiyorum.

1. hazırlanması arabellekleri ve çözümleri
<ol><li>Fosfat 1 litre hazırlamak için serum fizyolojik (PBS, pH 7) arabelleğe alınmış, 8 gram NaCl, 0.2 gram KCl, 1.44 g Na2HPO4, KH2PO4 ' te 800 mL distillated su 0,24 g geçiyoruz. 7.0 ile HCl pH ayarlama ve 10 x hisse senedi çözüm olarak yapılan ve oda sıcaklığında depolanan son hacmi 1 L. PBS için su ekleyin.</li>
	<li>Çözüm sabitleme 10 mL hazırlamak için 1 mL % 37 formaldehit son konsantrasyonu % 3.7 ulaşmak için PBS için 9 mL ekleyin. Bu çözüm sadece kullanmadan önce hazırlayın. Dikkat: eldiven formaldehit çözüm işlemek için kullanın.</li>
	<li>Şoklama çözüm (500 mM) hazırlamak için KI 8.3 g distile su 100 ml geçiyoruz. Bu çözüm kullanmadan önce hazırlamak ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>BODIPY 10 mM hisse senedi çözüm hazırlamak için 10 mg BODIPY 493/503 Dimetil sülfoksit (DMSO) 3.8 ml geçiyoruz. -70 ° C'de 100 µL aliquots bıraktığımız</li>
	<li>BODIPY 5 µM Şoklama çözüm hazırlamak 10 mm BODIPY 500 mM çözüm Şoklama 493/503-2 mL 1 µL ekleyin. LFR tahlil için BODIPY 5 mikron son bir konsantrasyon gereklidir.</li>
	<li>Mineral çözüm hazırlamak için H3BO 0,06 g ekleyin4-2 H2O, 0.1 g FeCl3-6 H2O ve 0.4 g CuSO çalışma MoO3, MnCl2-4 H2O, 0.4 g ZnCl2, 0,04 g Na20.14 g 4-5 H2O 1 litre saf su için.</li>
	<li>Tuz solüsyonu hazırlamak KH2PO4,4, KCl 8 g, 2 g MgSO4, CaCl21 g ve 1 litre için mineral çözüm 8 mL distile su böylece Na24 g 16 g ekleyin.</li>
	<li>U. maydis FB2 (a2b2), bir nitrojen kaynağı olmadan en az orta hazırlamak için 10 g glikoz ve tuz solüsyonu 62.5 mL distile su, 1 litre Holliday göre et al. ekleyin. 31. pH 7,0 için ayarlamak ve sonra 100 mL 250 mL şişe medya dağıtmak ve onları sterilize. Otoklav 20 dk, 15 psi (1,05 kg/cm2) sıvı döngüsü veya filtre için sterilize.</li>
	<li>Maya pepton dekstroz orta (YPD) hazırlamak 5 g maya ekstresi, pepton, 2.5 g ve 5 g glikoz 1 litre için distile su ekleyin. 100 mL 250 mL şişe çözümde dağıtmak ve onları sterilize. Otoklav 20 dk, 15 psi (1,05 kg/cm2) sıvı döngüsü veya filtre için sterilize.</li>
</ol>2. Kültür durumu ve hücre fiksasyon
Not: hücreleri en kısa zamanda düzelterek LDs yapısını korumak. Fiksasyonun microcentrifuge tüplerde yapılabilir. Dehidratasyon su ince bir tabaka bırakarak kaçınılması Eğer sabit hücreleri 4 ° C'de en fazla bir ay için tutulabilir.
<ol><li>U. maydis hücreler kültür koşullar altında ilgili çalışma için büyümek. Kültür bir ilk OD600 0,05 ile başlamak (1.15 × 106 hücre / mL). Hücreleri 28 ° c, 180 rpm 24 h için kuluçkaya. 1 bir OD600 2.3 × 107 hücrelere karşılık gelen / mL.</li>
	<li>Seçili, kez, çekilme hücrelerin bir aliquot. U. maydis, için 5 mL her 2 h ilk 8 h sırasında geri alıyorum. Büyüme 8 h sonra aliquots 2 ml yeterlidir.</li>
	<li>600 optik yoğunluk ölçmek her aliquot nm.</li>
	<li>14.000 x g masa üstü bir santrifüj kullanarak 4 ° C'de 1 dk. için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak.</li>
	<li>PBS-formaldehit % 3.7 arabelleği 1 mL hücrelerde Pelet askıya alma. Oda sıcaklığında 15 dk için hücreleri kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra santrifüj kapasitesi 14.000 x g 4 ° C'de 1 dk. için de hücre süspansiyon Süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücreleri Pelet iki kez distile su (1 mL) benzer bir hacmi ile yıkayın. 14.000 x g 4 ° C'de 1 dk. için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi Süpernatant her yıkama adımdan sonra atın.</li>
	<li>Hücre Pelet 5 OD600 ayarlamak (1.15 x 108 hücre / mL) ile distile su (Denklem 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq1.jpg">    Denklem 1.
</li>
	<li>Örnek 4 ° C'de kullanımı kadar tutun.</li>
</ol>3. sıvı Floresans kurtarma tahlil (LFR)
<ol><li>Spektrofotometre üzerinde açmak ve Skanlt yazılımını açın. Tıkırtı üstünde yeni oturumve Başlat ve sonra Varioskan Luxseçin. İletişim kuralı oturum ağacından seçin, Floresans dalga boylarında (uyarma 485 nm/emisyon 510 nm; optik yoğunluk 600 nm) ayarlarını girin ve otomatik photomultiplier kazanç seçin. Uyarma için bant genişliği, select 12 nm. Optik, üst seçin (uyarma örnek olduğunu iyi en baştan).</li>
	<li>Nazik ve sürekli ajitasyon (300 rpm) girin. Plaka dışarı koşmakve Duraklat kadar kullanıcı eylemi (kuyuları örneğine eklenmesi için kullanılan zaman) seçin. Protokol beş kez tekrarlayın. Kaydet ' i tıklatın ve Oturum adı alanıüzerinde oturum için bir ad yazın. İletişim kuralı artık örnekleri analizleri için hazırdır.</li>
	<li>BODIPY 5 µM-200 µL çözüm 96 de siyah-clear alt plaka her şey için su ekleyin.</li>
	<li>Plaka Spektrofotometre odası yerleştirin ve 30 ° C'de 5 dk kuluçkaya Bu noktadan sonra mümkün olduğu kadar ışık plaka korumak.</li>
	<li>Başlat düğmesini tıklatın ve floresan (uyarma 485/emisyon 510) ve boşlukları için karşılık gelen OD600 okuyun.</li>
	<li>5 µL formaldehit sabit hücre Süspansiyon sırasında duraklama süresini wells için ekleyin. Örnekleri dikkatle pipet ile karıştırın. Spektrofotometre içinde plaka koymak ve devam' ı tıklatın. O zaman, örnekleri üzerinde tasarlanmış protokolüne göre işlenir.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 5 µL üç art arda ekleme yineleyin. Hücreleri değil çökelti emin olun. (Şekil 1).</li>
</ol>4. hesaplamalar LD dizin
<ol><li>Mikroplaka her örnek için bir grafik Floresans ve birbirini izleyen her ek (5 puan boş dahil) hacmi karşı Absorbans arsa. Bu çalışmada, hesaplamalar için Microsoft Excel yazılımı kullanın. Verileri çizmek, ilk olarak, birim, floresan ve Absorbans veri girmek için veri sayfası, ikinci ve üçüncü sütunun anılan sıraya göre. Sonra imleci ile tüm verileri seçin, EKLE'yi tıklatın ve (XY) dağılım seçin.</li>
	<li>Grafikte her noktalarını seçin ve ilgili TREND çizgisi DENKLEMİ göster kutusunu seçili ekleyin. Denklem 2 göre iki düz çizgiler yamaçları değerleri yazın: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq2.jpg">    Denklem 2 Nerede y floresan veya optik yoğunluk, x = örnek hacmi = (0, 5, 10, 15, 20 µL), m floresan veya optik yoğunluk hat ve b eğim = y kesişim noktası =.</li>
	<li>Floresans çizgisinin eğimini LD dizin, denklem 3 almak için optik yoğunluk çizgisinin eğimini tarafından bölün. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq3.jpg">    Denklem 3 LD dizin Floresans sayının karşılık gelir ve optik yoğunluk yamaçlarında.</li>
</ol>5. veri kalitesi analizi
<ol><li>Her düz çizgi korelasyon katsayısını hesaplar: İşlev Sihirbazı ' nda (fx) tıklatın ve korelasyonseçin. Eğer r &lt; 0.9, verilerini atmak ve okumalar yineleyin. R ≥ 0,9, okuma güvenilir iseniz.</li>
</ol>

<ol><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+roles+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding roles for lipid droplets.</a> Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).</li>
<li>Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+neutral+lipid+synthesis+by+Yarrowia+lipolytica+on+various+carbon+substrates+under+nutrient-sufficient+and+nutrient-limited+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions.</a> Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).</li>
<li>Raimondi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+lipids+from+glycerol%3A+new+perspectives+on+biotechnological+exploitation+of+Candida+freyschussii%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii.</a> Microbial Cell Factories. 13, 83(2014).</li>
<li>Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+accumulation+in+Rhodotorula+glutinis+induced+by+nitrogen+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation.</a> Biotechnology for Biofuels. 7, 164(2014).</li>
<li>Galafassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+for+second+generation+biodiesel+by+the+oleaginous+yeast+Rhodotorula+graminis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis.</a> Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).</li>
<li>Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodotorula+glutinis-potential+source+of+lipids%2C+carotenoids%2C+and+enzymes+for+use+in+industries%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).</li>
<li>Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+by+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+using+industrial+by-products+under+different+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).</li>
<li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+Lipid+Droplet+Proteome+of+the+Oleaginous+Yeast+Rhodosporidium+toruloides%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides.</a> Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).</li>
<li>Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Palmitoleic+and+Linoleic+Acid+in+Oleaginous+and+Nonoleaginous+Yeast+Biomass%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass.</a> International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).</li>
<li>Radulovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+lipid+droplets+in+yeast%3A+current+status+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches.</a> Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin-Mediated+Lipid+Droplet+Formation+in+Adipocytes+Promotes+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein-1+Processing+and+Triacylglyceride+Accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation.</a> Plos One. 8 (5), e64605(2013).</li>
<li>Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).</li>
<li>Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and lipid droplets.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oily+yeasts+as+oleaginous+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oily yeasts as oleaginous cell factories.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).</li>
<li>Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+neutral+lipids%3A+synthesis%2C+storage+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).</li>
<li>Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+lipid+droplet+accumulation+associated+with+a+peripheral+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy.</a> Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).</li>
<li>Filipe, A., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+and+lipid+droplets%3A+finding+a+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).</li>
<li>Greenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipid+droplets+in+metabolic+disease+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).</li>
<li>Aguilar, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+accumulation+and+other+biochemical+changes+induced+in+the+fungal+pathogen+Ustilago+maydis+under+nitrogen-starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation.</a> Archives of Microbiology. , (2017).</li>
<li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PLoS One. 5 (10), e13692(2010).</li>
<li>Madeira, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC1+Inhibition+Induces+Lipid+Droplet+Replenishment+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).</li>
<li>Maya-Monteiro, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+induces+macrophage+lipid+body+formation+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-+and+mammalian+target+of+rapamycin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).</li>
<li>Listenberger, L. L., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aListenberger%2C+LL+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soraphen+A%2C+an+inhibitor+of+acetyl+CoA+carboxylase+activity%2C+interferes+with+fatty+acid+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation.</a> Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924203116302995">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+spectroscopic+property+of+Bodipy+derivates+through+tuning+the+molecular+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).</li>
<li>Pagac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEIPIN+Regulates+Lipid+Droplet+Expansion+and+Adipocyte+Development+by+Modulating+the+Activity+of+Glycerol-3-phosphate+Acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase.</a> Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).</li>
<li>Qiu, B., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY+493%2F503+Staining+of+Neutral+Lipid+Droplets+for+Microscopy+and+Quantification+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry.</a> Bio-protocol. 6 (17), (2016).</li>
<li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42(2015).</li>
<li>Holliday, R. Ustilago maydis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolliday%2C+R+%22Handbook+of+genetics%22">Handbook of genetics</a>. King, R. , Plenum. New York. 575-595 (1974).</li>
</ol>

Yazarlar açıklama yok

LFR başarıyla yapıldı lipid metabolizma S. cerevisiae ve daha sonra eğitim ilk kez uygulanan bir yöntemdir roman U. maydis20,21' uygulanmaktadır. LD dizin hücrelerinde birikmiş Etiketler mutlak değerini vermek değil rağmen hücre lipid içeriği hakkında hızlı bir fikir sağlar ve ne zaman iki veya daha fazla deneysel koşullar dizinden LD karşılaştırılır verilerin yorumlanması basittir. BODIPY 493/503 nötr lipitler, LDs ana bileşeni için çok özel ve...

Lipid damlacıkları (LDs) her yerde birden bulunan hücre içi yağ nötr lipitler, esas olarak Etiketler ve sterol esterler (SE) özünü oluşan organlarıdır. Çekirdek perilipin ve enzim diacylglycerol açil transferaz, acetyl-CoA carboxylase ve asil-CoA synthase1gibi nötr lipitler sentezi yer gibi proteinler ile etkileşim bir monolayer fosfolipitler, çevrilidir. Dinamik davranış nedeniyle, Fosfolipid monolayer Etiketler ve SE2hidrolize triacylglycerol lipaz da içerir. Bağlı olarak hücre tipi ve organizma, saklı nötr lipitler enerji üretmek için kullanılabilir veya fosfolipitler ve sinyal molekülleri sentez. Maya ve diğer Mantarlar, yanıt olarak azot/karbon oranı düşük azot durumu tarafsız lipid üretim3,4 artırmak için anahtar olabilir gösteren kültür medyada değişimler LDs içeriğini değiştirir ,5. Yüksek miktarlarda Etiketler Maya üretimi bir potansiyel biyoteknoloji biyoyakıt ve gıda sektöründe kaynak olarak kullanıldı. Saklı bazı yağlar omega 3 ve omega 6, beslenme ve diyet önemi 6,7,8,9,10 ile gibi çoklu doymamış yağ asitleri yüksek oranlarda içerir , 11. insan hücreleri de dahil olmak üzere memeli hücrelerinin LDs de içeren Etiketler ve kolesterol esterleri. Fosfolipid monolayer Maya LDs açıklanan proteinlerin homolog memeli ile ek bir protein yoktur perilipin ile etkileşim S. cerevisiae12. Bir rol Fosfolipid monolayer ve onun ilişkili proteinler için LDs yapısı stabilize etmek ve etkileşime LDS organelleri mitokondri, endoplazmik retikulum, tanımladıkları ve çarpıtmalar, esas olarak lipid değişimi için izin vermek için önerilen 13,14. İlginçtir ki, insanlarda, LDs patolojiler tip 2 diyabet, ateroskleroz, steatohepatitis ve Koroner kalp hastalığı, onların sayı 15,16,17 bir artış olduğu gibi yer gibi görünüyor . Biraz tip-in virüs LDs platformlar virions 2,18,19düzenlemek için kullanın.
İnsan patolojiler ve potansiyel Biyoteknolojik kullanımları LDS'de etkileri nedeniyle, LDs oluşumu tam deneysel belirlenmesi önemli bir görevdir. Bu makalede, floresan (LFR) BODIPY 493/503 kurtarma üzerinde dayalı güvenilir bir tahlil (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), hücrelerinde nötr lipitler içeriğini göreli değerini almak için. Bu tahlil ile nötr lipitler mantarlar U. maydis ve S. cerevisiaegibi ve aynı zamanda lipid ayıklama 20. , gerek kalmadan memeli hücrelerinde birikimi dinamikleri takip etmek mümkündür S. cerevisiae protein fosfatazlar tanımlamak için ilk kez yöntemi uygulandı ve söz konusu olursa kinaz lipid metabolizma düzenlenmesi. Bu lipid çekme ya da protein saflaştırma21,22mümkün oldu. LFR da LDs oluşumu Periton makrofajlar23yılında dinamikleri kurmak için kullanılmıştır. Kullanım BODIPY 493/503 Nil kırmızı diğer tarafsız lipid boyalar üzerinde bazı avantajları vardır. BODIPY 493/503 nötr lipitler için çok özel ve dar bir emisyon spektrum örnekleri tarafından confocal mikroskobu analiz edilir zaman boyalar gibi kırmızı floresan protein veya Mito-izci, gelen sinyalleri eşzamanlı algılama kolaylaştırmak. Ne yazık ki, BODIPY 493/503 photobleaching için hassas olduğunu, ancak bu işlem sırasında hafif24maruz antiquenching bir reaktif kullanarak önlenebilir.
Maya hücreleri LFR tahlil yapmak, onlar istenen beslenme koşulları altında kültürlü ve aliquots farklı zamanlarda çekilmiş. Daha sonra hücreler ne zaman hücreleri 4 ° C'de depolanan ay LDs bütünlüğünü korur formaldehit ile giderilen Diğer fiksasyon teknikleri, özellikle de onlar LDs bozulması hücreleri24içinde yol beri metanol veya soğuk aseton kullanarak kaçınılmalıdır. LD dizin ölçmek için hücreleri formaldehit sabit su içinde tanımlanmış bir konsantrasyon elde etmek için askıya alınır. Sonra fluorophore BODIPY 493/503 KI tarafından su içeren bir çözüm eklenir ve fluorophore hücreye girer ve LDs ile ilişkilendirir zaman onun Floresans kurtarılması yoktur. Floresans ölçüme (485 nm/510 nm) eşlik eden, hücre konsantrasyonu 600 optik yoğunluk ölçerek sayılabilir nm. Her örnek sonraki 5 µL aliquots formaldehit sabit hücre süspansiyon, sizin için de ekleyerek dört kere okunur. Boşlukları Absorbans ve floresan hücreleri toplamadan önce elde edilir. Floresan ve Absorbans veri kalitesi ölçümleri doğrusallık belirlenerek değerlendirilir: Eğer r < 0,9, veri atılır. R değeri önemli çünkü temelde floresan yoğunluğu artan hücre konsantrasyonları doğrusal bir yanıt üretmek gerekir. Hücre konsantrasyonu çok yüksek ise, doğrusallık kaybolur. LFR tahlil istenen LD fenotip yüksek üretilen iş deneylerde seçmek için hızlı, basit ve ekonomik bir yöntemdir. İstediğiniz koşulları seçtikten sonra tek tek hücreleri LD içeriğini confocal mikroskobu, BODIPY, hücre LDS'de görüntüsünü sağlayan ile lekeli aynı formaldehit sabit hücreleri kullanarak tarafından ele. Onların Etiketler ve SE içeriği şimdi daha da ince tabaka Kromatografi tarafından çözümlenebilir.

<table><tbody><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Varioskan Lux çok modlu mikroplaka reade</td><td>D5879</td><td>Filtre 493/503 veya monokromatör dedektör</td></tr><tr><td>Plaka costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3615</td><td>96 kuyu siyah duvar / şeffaf alt</td></tr><tr><td>Plaka costar Corning</td><td>Inc</td><td>3598</td><td>96 kuyu hücre kültürü plakası costar</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen / Thermofisher</td><td>D3922</td><td>4,4-difloro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene</td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>ACS reaktifi, H2O içinde ağırlıkça %37, polimerizasyonu önlemek için %10-15 metanol içerir</td></tr><tr><td>Potasyum iyodür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60399</td><td>BioUltra, &ge; %99,5 (AT)</td></tr><tr><td>FB2 Ustilago maydis</td><td>ATCC</td><td>201384</td><td>Basidiomycete-Maya</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746398</td><td>ACS reaktifi, inorganik tuz</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td>ACS reaktifi</td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Seç Sigma Aldrich</td><td>Y100</td><td>Kültür ortamı için amini asitler, peptitler, suda çözünür, vitaminler ve karbonhidratların karışımı</td></tr><tr><td>NZ kutusu artı</td><td>Sigma aldrich</td><td>N4642</td><td>Sığır sütünden kazein enzimatik hidrolizatı</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-8270</td><td>D (+) glikoz</td></tr><tr><td>Skaker şişesi</td><td>Pirex</td><td>CLS4450250-6EA</td><td>Boroziikat cam</td></tr><tr><td>Çalkalayıcı</td><td>SEV M & eacute; xico</td><td>INO650V-7</td><td>Orbital çalkalayıcı</td></tr><tr><td>Santrifüj tablası</td><td>Eppendorf</td><td>5415C</td><td>Santrifüj</td></tr><tr><td>Mikrotüpleri</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606340</td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td>Axygen scientific</td><td>T-200-Y</td><td>Eğimli Uçlu Üniversal Pipet Uçları, 200 mikrolitre, steril olmayan</td></tr><tr><td>mLine pipet Biohit</td><td></td><td>725130</td><td>8 kanal, hacim aralığı 5-100 uL</td></tr></tbody></table>

lipid dizin belirlenmesi mantar patojen ustilago maydis sıvı floresans kurtarma tarafından

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Makale, triacylglycerols (Etiketler) lipid damlacıkları (LDs) birikimi belirlemek için bir hassas Mikroplaka tahlil LD dizin tahlil uygulamak gösterilmiştir. LD dizin lipid ayıklama elde edilir. O LDs içeriği zengin büyüme veya azot tükenmiş medya gibi farklı koşullar altında yüksek üretilen iş deneylerde ölçüm sağlar. Yöntem Saccharomyces cerevisiae, lipid damlacık metabolizmasında çalışmaya ilk kez açıklanan olsa basidiomycete Ustilago maydisbaşarıyla uygulandı. İlginçtir, ve LDs filogenetik korunmuş ökaryotik hücrelerde organellerin olduğundan, yöntem hücreleri, büyük bir çeşitlilik için Maya memeli hücreleri için uygulanabilir. LD dizin sıvı Floresans kurtarma tahlil (LFR) üzerinde su verme koşullarda BODIPY 493/503. formaldehit ile sabit hücreleri eklenmesiyle dayanmaktadır Potasyum iyot Floresans içki kullanılır. Floresan ve optik yoğunluk yamaçlar arasındaki oran LD dizin adı verilmiştir. Yamaçları ne zaman elde edilen düz çizgiler hesaplanan BODIPY floresan ve optik yoğunluk 600 nm (OD600) örnek ek karşı çizilen. En iyi veri kalitesi korelasyon katsayıları eşit veya 0,9 (r ≥ 0,9) yukarıda yansıtılır. Birden çok örneği aynı anda bir Mikroplaka uygulanabilir gibi okuyabilirsiniz. BODIPY 493/503 lipofilik bir floresan boya o bölümleri lipid damlacıkları olduğundan, LDs birikir hücreleri birçok türleri kullanılabilir.

LFR, ile BODIPY 493/503 floresan sonda olarak büyüme koşulları LDs U. maydis, ne olursa olsun içinde dinamik birikimi çalışmaya güvenilir ve kolay bir yöntemdir. Hücreleri YPD-ortamda kültürlü, durağan faz (şekil 2A) bir düşüş ardından bir artış LD dizin veya üssel faz sırasında oldu. Buna ek olarak, azot açlık altında yetiştirilen hücrelerde, her iki Üstel ve sabit aşamaları (şekil 2B) LD dizinde sürekli bir artış vardı...

Burada, triacylglycerols hücrelerdeki yüksek üretilen iş deneylerde kültürlü dinamiklerini incelemek için lipid damlacık dizin (LD dizini) elde etmek için bir protokol açıklayın. LD dizin tahlil BODIPY 493/503 kullanır kolay ve güvenilir bir yöntemdir. Bu tahlil dispendious lipid çekme ya da mikroskobu analiz ihtiyacı yok.

Lipid dizin belirlenmesi mantar patojen Ustilago Maydis sıvı Floresans kurtarma tarafından

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

Bu prosedürün genel amacı, farklı beslenme koşulları altında kültürlenen hücrelerin Lipid Damlacık İndeksini belirlemektir. Bu yöntem, birikim dinamiği ve farklı beslenme koşulları gibi Lipid Damlacık ve Lipid Alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mikroplakada uygulanabildiği için birden fazla numunenin aynı anda okunabilmesidir.Bu yöntemin başlamasıyla birlikte, nitrojen açlığı altında kültürlenen Ustilago maydis hücrelerinin kırılmasını gözlemlediğimizde ve daha sonra bunun bu eğitmenlerin lipit damlacıkları olabileceği anlamına gelebileceğini fark ettiğimizde. Bu nedenle, Brezilya'daki Universidade Federale do Rio de Janeiro'dan Monica Montero ile temasa geçtik ve Saccharomyces cerevisiae'deki lipid damlacıklarının Sıvı Floresan Geri Kazanım Testini uygulayarak Ustilago maydis için prosedürü uyarlamak üzere bir işbirliği başlattık. Bu protokoldeki ilk adım, gerekli tamponların ve çözeltilerin hazırlanmasıdır.10 milimolar BO-DP stok çözeltisi hazırlamak için 10 miligram BO-DP 493-503 ve 3.8 mililitre dimetil sülfoksit çözün. 100 mikrolitrelik alikotlara bölün. Sonra karanlıkta eksi 70 santigrat derece tutun.Sıvı floresan geri kazanım

lipid-index-determination-liquid-fluorescence-recovery-fungal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz maya kullanarak anket-tarama elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI / MS) gibi çok sayıda lipid türlerinin belirlenmesi için yeni bir nicel lipidomics yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, şu anda, lipidler, hassasiyet ve hız çeşitli moleküler formları çözmek için yeteneği lipid tanımlanması ve ölçülmesi için kullanılabilir yöntemleri aşıyor.

Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome

Biz gramicidin kanal aktivitesinin bir ölçüsü olarak floresan su verme hızı monitörleri hızlı bir floresan bazlı analiz tanıtmak. Gramicidin kanalları, çift katlı kapsayan proteinler tarafından algılanan, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri izlemek için moleküler kuvvet dönüştürücüler olarak kullanılır.

Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme

Tohum bulaşmasını mantarlar tarafından tahılların yıkım daha iyi bitki-patojen etkileşimleri anlamak için sayısız araştırma çabaları açtı. Bir laboratuvar ortamında tohum-mantar etkileşimleri çalışmak için, mantar üretimi, biyokütle, ve çekirdek biyoanalizlerin kullanarak mikotoksin kontaminasyonu ölçümü için sağlam bir yöntem geliştirdi.

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

Bir Nile Red boyama prosedürü kullanılarak alg hücrelerinin nötral lipid içeriğini belirlemek için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu zaman tasarrufu tekniği geleneksel gravimetrik esaslı lipid miktar protokoller için bir alternatif sunuyor. Bu izleme biyoproses performansı belirli bir uygulama için tasarlanmıştır.

Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Makale, birçok numuneyle yapılan çalışmalarda toprak mikrobik topluluk yapısını belirlemek için hem toplam lipidlerin hem de gösterge lipidlerinin göreceli olarak bolluğunun karakterize edilmesinde kullanılmak üzere, mikroorganizmaların hücre membranlarından lipidlerin ekstraksiyonu için çaba ve doğruluğu denkleştirirken, verimliliği arttıran bir yöntemi açıklıyor.

Çok Örnekli Deneylerde Toprak Mikroplarını Karakterize Etmek İçin Bir Lipid Ekstraksiyon ve Analiz Metodu

Burada, floresan mikroorganizma ve tomurcuklanan Maya hücrelerinin floresans mikroskopisi görüntülerinin otomatik algılama ve niceliksel tanımı ile ilgili bir MATLAB uygulaması sunuyoruz.

Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi

Bu protokol lipozomların imalatını ve bunların bir yüzeyüzerinde nasıl hareketsiz hale getirilebildiğini ve floresan mikroskopi kullanılarak büyük bir paralel şekilde tek tek nasıl görüntülenebileceğini açıklar. Bu, popülasyonun tek lipozomları arasındaki boyutun ve bileşimsel homojenliğin nicelikselleştirilmesine olanak sağlar.

Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi

Hayati floresan boyalar modern mantar hücre biyolojisinde canlı hücre görüntüleme analizleri için gerekli araçlardır. Bu yazıda, filamentöz mantarlarda plazma membran dinamiği, endo-/eksositoz ve hücre duvarı morfogenezinin izlenmesi için kurulmuş ve daha az bilinen floresan boyaların uygulanması ayrıntılı olarak anlatılır.

Filamentöz Mantarların Canlı Hücre Görüntülemesi İçin Membran ve Hücre Duvarı Seçici Floresan Boyaların Uygulanması

Saccharomyces cerevisiae'dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Toprağın opaklığı nedeniyle, kurucu mikroplar arasındaki etkileşimler hücresel çözünürlükle kolayca görselleştirilemez. Burada, mantar-mikrobiyal etkileşimleri araştırmak için yeni fırsatlar sunan iki mikroakışkan araç sunulmaktadır. Cihazlar çok yönlü ve kullanımı kolaydır, bu da hücresel düzeyde yüksek mekansal zamansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Bu protokol, yüksek oranda farklılaşmış ve polarize olmuş insan retinal pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde bir lipofussin birikim modelini ve RPE'nin toplam OS tüketimini/bozulma kapasitesini saptamak için geliştirilmiş bir dış segment (OS) fagositoz testini tanımlamaktadır. Bu yöntemler, önceki lipofussin modellerinin ve klasik nabız kovalama dış segment fagositoz testlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmektedir.

Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofussin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi

Öğrenin lipid damlacık indeksini belirlemeyi Ustilago maydis hücrelerinde BODIPY 493/503 kullanarak. Bu yüksek verimli yöntem, lipid metabolizması ve biyoteknoloji araştırmalarında yağ birikim dinamiklerini incelemeyi kolaylaştırır.

Lipid dizin belirlenmesi mantar patojen Ustilago Maydis sıvı Floresans kurtarma tarafından

Daha fazla video keşfet