Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Bu protokolün genel amacı, lenfositleri Peyer yamaları ve mezenterik lenf nodları dahil olmak üzere bağırsak indüktif bölgelerinden ve lamina, propria ve epitel dahil olmak üzere efektör bölgelerden izole etmektir. Bu yöntem, gastrointestinal enfeksiyonlara, kanserlere ve enflamatuar hastalıklara karşı bağışıklık tepkilerini anlamak gibi mukozal immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ince bağırsağın farklı bölmelerinden yüksek oranda saflaştırılmış ve canlı lenfositlerin minimum çapraz kompartmantal kontaminasyon ile izolasyonunu sağlamasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, mezenter lenf düğümlerini ve Peyer yamalarını tanımlamak ve izole etmek ve optimum verim için hız ve hassasiyeti dengelemek zor olduğu için mücadele edeceklerdir. Protokole başlamak için, önceden anestezi uygulanmış bir fareyi sırtına yerleştirin ve üzerine %70 etanol püskürtün. Orta hat kesisi yapmak için makas kullanın ve periton boşluğunu ortaya çıkarmak için cildi ve karın duvarını açın.

Ardından, çekumu bulun ve çekumu nazikçe aşağı çekmek için forseps kullanın. İnce bağırsağı dikkatlice sağa hareket ettirmek için forseps kullanın ve kolonla aynı hizada olan tüm Mezenterik Lenf Düğümlerini veya MLN zincirini açığa çıkarın. Çekuma en yakın bulunan zincirdeki alt düğümü tanımlayın.

Etrafındaki mezenter yağını kavramak için bir set forseps kullanın ve lenf nodu etrafındaki yağı başka bir forseps seti ile cımbızlayarak MLN zincirini aşağıdan yukarıya doğru nazikçe hareket ettirin. Ardından bir havluyu hasat ortamıyla nemlendirin ve MLN zincirini kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Zinciri kağıt havlu üzerinde yuvarlayarak ve yağı iki set forseps ile çekerek mezenter yağını çıkarın.

Daha sonraki izolasyon adımları için MLN'yi soğuk hasat ortamına yerleştirin. Makasla, ince bağırsağı pilor sfinkterinin altından ve çekumun üstünden kesin. Bir set forseps kullanarak bağırsağı ileumdan duodenuma yavaşça çekin ve başka bir forseps seti kullanarak bağlı mezenter yağını çıkarın.

Bağırsağı hasat ortamıyla nemlendirilmiş bir kağıt havluya yerleştirin ve kalan mezenter yağını iki set forseps ile alın. Hasat ortamını periyodik olarak uygulayarak bu adımlar boyunca bağırsağı nemli tutun. Peyer'in yamalarını kavisli bir makasla bağırsaktan çıkararak toplayın.

İnce bağırsaktan 5-11 Peyer yaması toplayın. Daha sonraki izolasyon adımları için Peyer yamalarını soğuk hasat ortamına yerleştirin. Forsepsin düz tarafını kullanın ve dışkı içeriğini ve mukusu dışarı atmak için duodenumdan ileuma doğru yavaşça kaydırın.

Mukusun çoğunu çıkarmak için bu adımı bir kez tekrarlayın. Bir noktada künt uçlu ince makas kullanın, künt ucu bağırsağa sokun ve bağırsağı duodenumdan ileuma kadar uzunlamasına kesin. Açılan bağırsağı yanal olarak iki santimetrelik parçalar halinde kesin.

Bağırsak parçalarını, daha sonraki izolasyon adımları için 25 mililitre soğuk hasat ortamı ile 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Lenfositleri, üç mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanarak 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden nazikçe ayırarak MLN'den izole edin. Hücre süzgecini beş mililitre soğuk hasat ortamı ile yıkayın.

MLN hücrelerini, dört santigrat derecede beş dakika boyunca yerçekiminin 400 katı santrifüjleyerek peletleyin. Daha sonra hücre peletini bir mililitre soğuk hasat ortamında yeniden süspanse edin. İnce bağırsak parçalarını, tüpü 10 kez ters çevirerek 25 mililitre soğuk hasat ortamı ile üç kez yıkayın.

Bağırsak parçalarının yerleşmesine ve süpernatanı dökmesine izin verin. Daha sonra, bağırsak parçalarını içeren 50 mililitrelik konik tüpe 20 mililitre önceden ısıtılmış ditioeritritol veya DTE çözeltisi ekleyin ve içeriği bir karıştırma çubuğu ile 50 mililitrelik silikonlu bir Erlenmeyer şişesine aktarın. Karıştırma çubuğunu tutmak için şişenin dışında büyük bir mıknatıs kullanın ve dokuyu ve çözeltiyi 50 mililitrelik konik tüpe geri aktarın.

Ardından tüpü maksimum ayarda 10 saniye boyunca girdaplayın. Süpernatanı, doku parçalarını orijinal tüpte tutmaya dikkat ederek, 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın. Hücreleri peletleyin.

Hücre peletini 10 mililitre soğuk hasat ortamında yeniden süspanse edin ve buz üzerinde saklayın. Bağırsak parçaları içeren 50 mililitrelik konik tüpe 20 mililitre önceden ısıtılmış DTE çözeltisi ekleyin ve bir karıştırma çubuğu içeren 50 mililitrelik silikonlu Erlenmeyer şişesine geri aktarın. Karıştırma çubuğunu tutmak için şişenin dışında büyük bir mıknatıs kullanın ve dokuyu ve çözeltiyi 50 mililitrelik konik tüpe geri aktarın.

Tüpü maksimum ayarda 10 saniye boyunca girdaplayın. Süpernatanı 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek, ilk DTE işleminin süpernatantından hücreleri içeren tüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleyin. Hücre peletini oda sıcaklığında sekiz mililitre% 44 Yoğunluk Gradyanı veya DG çözeltisinde yeniden süspanse edin.

Sekiz mililitre% 44 DG çözeltisini ve hücre süspansiyonunu 17 milimetre x 100 milimetre 14 mililitre polipropilen yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Hücreleri beş mililitre RT% 67 DG çözeltisi ile doldurun. Freni kullanmadan RT'de 25 dakika boyunca yerçekiminin 1.600 katında santrifüjleyin.

Canlı hücreler %44 ve %67 arayüzde kabarık bir tabaka oluşturur. Vakum aspirasyonu ile üstteki yağ tabakasını çıkarın. Arayüzde buffy kaplamayı hasat etmek için bir Pasteur pipeti kullanın ve 40 mililitre soğuk hasat ortamı içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Dört santigrat derecede beş dakika boyunca yerçekiminin 400 katı santrifüjleme ile pelet hücreleri ve hücre peletini bir mililitre soğuk hasat ortamında yeniden süspanse edin. Kalan bağırsak parçalarına 25 mililitre önceden ısıtılmış EDTA çözeltisi ekleyerek bağırsak dokusu parçalarından epitel hücrelerini çıkarın ve içeriği bir karıştırma çubuğu ile 50 mililitrelik silikonlu bir Erlenmeyer şişesine aktarın ve karıştırın. Karıştırma çubuğunu tutun ve bağırsak parçalarını şişede tutarken süpernatanı dikkatlice atın.

Epitel hücresi çıkarma adımını bir kez daha tekrarlayın. Daha sonra, 50 mililitre oda sıcaklığında hasat ortamı ekleyin ve içindekileri bir mıknatısla kısa bir süre karıştırın. Sonra bağırsak parçalarının yerleşmesine izin verin ve süpernatanı dikkatlice atın.

30 mililitre önceden ısıtılmış kollajenaz çözeltisi ekleyin ve bağırsak parçalarını karıştırın. Karıştırdıktan sonra, sindirilmiş dokuyu ve süpernatanı 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Filtreyi ezmek için üç mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanarak kalan doku parçalarını nazikçe ayırın.

Filtreyi 10 mililitre soğuk hasat ortamı ile yıkayın ve hücreleri peletleyin. Döndürdükten sonra, hücre peletini sekiz mililitre ortam sıcaklığında% 44 DG çözeltisinde yeniden süspanse edin. Sekiz mililitre% 44 DG çözelti hücresi süspansiyonunu 70 milimetreye 100 milimetre polipropilen yuvarlak tabanlı yeni bir tüpe aktarın.

Beş mililitre ortam sıcaklığında% 67 DG çözeltisi ile altlık yapın, ardından gradyanları santrifüjleyin. Vakum aspirasyonu ile üstteki yağ tabakasını çıkarın. Arayüzde buffy kaplamayı hasat etmek için bir Pasteur pipeti kullanın ve 40 mililitre soğuk hasat ortamı içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

En sonunda, hücre peletini bir mililitre soğuk hasat ortamında yeniden süspanse edin. Her bağırsak bağışıklık bölmesi, lenfosit alt kümelerinin benzersiz bir bileşimi ile karakterize edilir. MLN ağırlıklı olarak alfa beta T hücrelerinden oluşurken, PP lenfositler çoğunlukla B hücreleridir.

LP lenfosit bileşimi esas olarak alfa beta T hücreleri ve B hücrelerinden oluşur. IEL esas olarak gama delta T hücreleri ve esasen B hücresi olmayan alfa beta T hücreleridir. LP ve IEL kompartmanları içindeki CD8 alfa pozitif alfa beta T hücreleri, CD8 alfa homodimer veya CD8 alfa beta heterodimerini eksprese ederken, indüktif bölge CD8 alfa pozitif alfa beta T hücreleri ağırlıklı olarak CD8 alfa beta heterodimerini eksprese etti.

IEL bölmesindeki gama delta T hücrelerinin çoğunluğu CD8 alfa eksprese ederken, MLN'de bulunan gama delta T hücreleri CD8 alfa'dan yoksundur. Bu prosedürü denerken, bağırsak bölmeleri arasındaki kontaminasyonu sınırlamak için doku izolasyon adımları sırasında yeterli zaman ve özen harcamayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, izole lenfositler, daha ileri fenotipik ve fonksiyonel analiz için ex vivo stimülasyon, akış sitometrisi ve diğer tekniklere tabi tutulabilir.