Name: Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Öğrenin fare ve insan alveoler makrofajlarını izole etme ve in vitro kültür yöntemlerini. Bu teknik, pulmoner immünolojide solunum hastalıkları ve enfeksiyonları araştırmak için yüksek saflıkta hücre popülasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Clare Prendergast el yazması düzenleme ile yardım için teşekkür. DKN desteklenmektedir tarafından bir araştırma Flinn Vakfı'ndan (#2095) vermek ve TM Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01HL056643 ve R01HL092514) gelen hibe tarafından desteklenmektedir. DKN yöntemleri geliştirilmiş, çalışma tasarlanmış ve el yazması yazdı; OM hayvan çalışmaları ve klinik örnek ihale ile destekli; SB akış sitometrik çözümlemesi ve hücre sıralama ile destekli; TM çalışmalar denetimli ve el yazması inceledim.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) ve St Joseph's Hastanesi ve Tıp Merkezi, kurumsal inceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır.
1. yalıtım AMs üzerinden fare Bronchoalveolar lavaj (BAL) sıvı
<ol><li>Bir sekiz haftalık C57BL/6 fare ile ketamin (87,5 mg/kg vücut ağırlığı) ve xylazine (12.5 mg/kg vücut ağırlığı) mayi bir enjeksiyon kokteyl uyuşturan. Cerrahi anestezi Reflekslerin kaybı ve kas gevşeme ile fare attains devam.</li>
	<li>Fareyi bir diseksiyon yüzeye ventral yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Oftalmik veteriner merhem gözleri su kaybı önlemek ve dezenfekte için % 70 isopropanol ile doymuş steril alkol hazırlık yastıkları ile fare tüm menfez yüzey silmek için uygulayın.</li>
	<li>Fare ölçülü tüm dört ayaklı bağlayın.</li>
	<li>Yavaşça karın boşluğu ile mikro diseksiyon Araçlar'ı açın. Herhangi bir visseral organlara zarar verme ya da çıkıntılı doku oluşturma olmadan mümkün olduğu kadar alan açmak için özen göstermelidir.</li>
	<li>Yavaşça göğüs boşluğuna yavaş yavaş mediasten aracılığıyla göğüs kafesi incising tarafından açın. İdeal olarak, göğüs kafesinin yan tarafına eksize. Aşırı akciğerler plevra göğüs boşluğuna açılırken değil incitmek özen göstermelidir.</li>
	<li>İnferior vena kava bulun ve fare kanamaya bir kesi yapmak. Kan emmek için emici pamuk tamponlarla kullanabilirsiniz.</li>
	<li>10 mL buz gibi fosfat tamponlu tuz (PBS) dolaşımdaki kan hücreleri temizlemek için (10 mL şırınga ve 25 G iğne kullanarak) sağ ventrikül enjekte. Kan emici pamuklu ped ile akışını emer. Tamamen periosteum sonra akciğerler beyazlatılmış görünür ve sonra lavaj için hazırsınız.</li>
	<li>Nazikçe cildi kesip ve hava yolu ortaya çıkarmak için boyun kas. Dikkatle bitişik kaslar, kıkırdak ve yağlı doku nefes borusu zarar vermeden tüketim.</li>
	<li>Küçük bir kesi yapmak (< 2 mm) gırtlak için posterior Trakea üzerinde. Bu kesik nefes borusu hâlâ gırtlak için bağlı iken bir kateter içine eklemek yeterli olmalıdır. Trake akciğerlere doğru iğne olmadan 1-inç 22 G kateter takın. İpek örgülü dikiş sondayla güvenli (4-0; absorbe olmayan) bir Meydanı düğüm ile. Not: Kateter kesilmiş olabilir fare boyutu temelinde gerekiyor. Son derece kısa veya uzun Kateterler sızıntı ve/veya hava yolu Lavaj sırasında gözyaşı eğilimindedir. Kateter uzunluğu böyle olması gerektiğini iyi nefes borusu içinde o zaman tam olarak ipucu kalır eklenen ve birincil bronşlar ulaşmak değil.</li>
	<li>Buz gibi BAL arabelleğe (Ca2 + ve Mg2 + ücretsiz PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic asit, EDTA) kateter ile dolu bir 1-mL şırınga ekleyin ve yavaş yavaş arabellek akciğerleri aşılamak. Bu akciğerleri şişirmek. Beş saniyeliğine için kateter bağlı şırınga tutmak ve pistonu hafifçe çekerek lavaj sıvı Aspire edin. Bu akciğerler deflate. Buz üzerinde yerleştirilen bir 15 mL konik tüp sıvı toplamak.</li>
	<li>Adım 1,10 dokuz kez daha tekrarlayın ve lavaj sıvı havuz. Bu akciğer kapasitesini aşan ve onun kopmalara neden flush, başına 1 mL arabellek fazla olamaz.</li>
	<li>Fare ile CO2 doz onaylanan IACUC protokolü tarafından ötenazi.</li>
	<li>10 mL BAL sıvısı 250 x g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet BAL hücreler içeriyor. Uyarı: Pelet olabilir çok küçük, çok süpernatant aspirating zaman dikkatli olun.</li>
	<li>Akışı sıralama/arabellek (PBS + % 2 inaktive ısı fetal sığır serum (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic asit (HEPES)) 100 μL BAL hücrelerinde resuspend.</li>
	<li>Fc reseptör nonspesifik antikor bağlanma fare Fc blok ekleyerek engellemek (Klon 2.4G2, 10 μg/mL) ve 20 dakika boyunca buzda kuluçka.</li>
	<li>Floresans eksi bir (FMO) birlikte boyama antikor gerçekleştirmek ve tek-leke11,25denetler. BAL değerlendirmek hücreleri hücre Çözümleyicisi tarafından uygun analiz yazılımı tarafından tek hücreli Akış Sitometresi Analizi ile takip ( Tablo malzemelerigörmek) ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>AMs izole bir floresan aktif hücre tarafından sıralayıcısı ( Tablo malzemelerigörmek) doğrudan 1 mL MOUSE'um kültür orta AMs içinde vitro kültür ve in vivo için amaçlanan hücre aktarımı. Alternatif olarak, sıralama 1 mL lizis arabellek AMs ( Tablo malzemelerigörmek) ile 10 μL/mL β-Mercaptoethanol RNA çıkarılması için takıma.</li>
</ol>2. fare akciğer, tek hücreli süspansiyon gelen AMs yalıtım
<ol><li>Bir sekiz haftalık C57BL/6 fare ile ketamin (87,5 mg/kg vücut ağırlığı) ve xylazine (12.5 mg/kg vücut ağırlığı) mayi bir enjeksiyon kokteyl uyuşturan. Cerrahi anestezi Reflekslerin kaybı ve kas gevşeme ile fare attains devam.</li>
	<li>Fareyi bir diseksiyon yüzeye ventral yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Oftalmik veteriner merhem gözleri su kaybı önlemek ve dezenfekte için % 70 isopropanol ile doymuş steril alkol yastıkları ile fare tüm menfez yüzey silmek için uygulayın.</li>
	<li>Fare ölçülü tüm dört ayaklı bağlayın.</li>
	<li>Yavaşça karın boşluğu ile mikro diseksiyon Araçlar'ı açın. Herhangi bir visseral organlara zarar verme ya da çıkıntılı doku oluşturma olmadan mümkün olduğu kadar alan açmak için özen göstermelidir.</li>
	<li>Yavaşça göğüs boşluğuna yavaş yavaş mediasten aracılığıyla göğüs kafesi incising tarafından açın. İdeal olarak, göğüs kafesinin yan tarafına eksize. Aşırı akciğerler plevra göğüs boşluğuna açılırken değil incitmek özen göstermelidir.</li>
	<li>İnferior vena kava bulun ve fare kanamaya bir kesi yapmak. Kan emmek için emici pamuk tamponlarla kullanabilirsiniz.</li>
	<li>10 mL buz gibi PBS dolaşımdaki kan hücreleri temizlemek için (10 mL şırınga ve 25 G iğne kullanarak) sağ ventrikül enjekte. Tamamen periosteum sonra akciğerler beyazlatılmış görünür ve hasat için hazırız.</li>
	<li>5 mL soğuk bir 15 mL konik boru içine nefes borusu, kan damarları ve kasları kesilmesinin tarafından ciğerlerini parçalayıp Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM). Sonraki adım kadar buza korumak.</li>
	<li>Fare ile CO2 doz onaylanan IACUC protokolü tarafından ötenazi.</li>
	<li>Perfused akciğer 3 mL DMEM ile steril ve pyrogen Ücretsiz 60 mm kültür çanak içine aktarın. Anatomi forseps yardımıyla varsa solunum yolları ve diğer sabit olmayan Akciğer doku malzeme alay. Bir neşter ile Akciğer doku kıyma < 1 mm boyut.</li>
	<li>300 µg/mL Liberase TL ve 5 U/mL ekleyin Dnaz ben, mix pipetting tarafından ve bir kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya 25 dakikadır. Karışımı yavaşça bir kez 10 dakika sonra pipetting.</li>
	<li>50 mL konik tüp üzerinde yüklü bir 100 µm hücre süzgeç Disosiye akciğerlere geçer. Bir dalgıç arkasından 1 mL şırınga mash up hücre kümeleri filtresini kullanın. 20 mL yıkama arabellek filtresiyle yıkayın (PBS + % 2 ısı Inaktif FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Vasıl 500 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve hücre Pelet 20 mL yıkama arabellekte resuspend.</li>
	<li>2.12 ve iki kez, 2.13 filtre ve tüp her zaman değişen adımları yineleyin. Beş dakikadan fazla yıkama arabellekte filtre önceden iliklerine kadar AM verim artar. 100 ekleyerek tek hücre süspansiyon hazırlamak akışı sıralama/hücre Pelet arabelleğe μL.</li>
	<li>Fc reseptör nonspesifik antikor bağlanma fare Fc blok ekleyerek engellemek (Klon 2.4G2, 10 μg/mL) ve 20 dakika boyunca buzda kuluçka.</li>
	<li>Antikor FMO ve tek-leke denetimleri11,25ile birlikte boyama gerçekleştirmek. Akciğer değerlendirmek hücreleri hücre Çözümleyicisi tarafından yazılım tek hücreli Akış Sitometresi Analizi analiz tarafından takip ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Sıralama AMs hücre sıralayıcısı tarafından ( Tablo malzemelerigörmek) doğrudan 1 mL MOUSE'um kültür orta AMs içinde vitro kültür ve in vivo için amaçlanan hücre aktarımı. Alternatif olarak, AMs 1 mL 10 μL/mL β-Mercaptoethanol RNA çıkarılması için ile takıma lizis arabellek içine sıralayın.</li>
</ol>3. insan BAL sıvısı üzerinden AMs yalıtım
<ol><li>Klinik laboratuvar 4 ° C'de insan BAL sıvı göndermek</li>
	<li>BAL sıvısı (10-50 mL) 250 x g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet BAL hücreleri11içerir.</li>
	<li>Pelet 20 mL yıkama arabelleği ile yıkayın (PBS + % 2 ısı Inaktif FBS + 2 mM EDTA) ve santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.</li>
	<li>Resuspend BAL hücrelerdir 100 μL akışı/arabellek sıralama (PBS + % 2 ısı Inaktif FBS + 1 mM EDTA + 25 mM HEPES).</li>
	<li>İnsan Fc blok (Klon Fc1.3070, 25 μg/mL) ekleyip 20 dakika boyunca buzda kuluçka Fc reseptör nonspesifik antikor bağlanma engelleyin.</li>
	<li>Antikor FMO ve tek-leke denetimleri11,24ile birlikte boyama gerçekleştirmek. BAL değerlendirmek hücreleri hücre Çözümleyicisi tarafından yazılım tek hücreli Akış Sitometresi Analizi analiz tarafından takip ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Sıralama AMs hücre sıralayıcısı tarafından ( Tablo malzemelerigörmek) doğrudan 1 mL insan AM kültür orta veya 1 mL lizis arabellek 10 μL/mL β-Mercaptoethanol ile desteklenmiştir.</li>
</ol>4. vitro kültür AMs
<ol><li>Hücre sıralama aşağıdaki hücreleri 250 x g 10 dk 4 ° c de centrifuging tarafından hasat.</li>
	<li>1 mL insan AM kültür orta [Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) % 10 ile desteklenmiş 1640 FBS, % 20 L-929 kültür (kaynağı makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF), 100 U/mL nihai toplama olarak), süpernatant insan AMs resuspend 1 mM sodyum pyruvate, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic asit (HEPES) ve 1 x penisilin/streptomisin (isteğe bağlı)]. Benzer şekilde, fare AMs 1 mL fare AM kültür orta [%10 FBS, % 20 L-929 kültür süpernatant (bir kaynak olarak M-CSF, 100 U/mL nihai toplama), 1 mM sodyum Pyruvate, 10 mM HEPES ve 1 x penisilin/streptomisin (isteğe bağlı DMEM resuspend )].</li>
	<li>Trypan mavi hariç hücrelerin hücre sayacı tarafından numaralandırmak ve 1 x 106/mL uygun hücre konsantrasyonu ayarlayın. Not: İdeal olarak, yukarı 5 x 10 için5 AMs 8-10 hafta eski bir C57BL/6 erkek fare toplanan BAL sıvısı üzerinden ayrılmış olabilir. Fare akciğer Özet dan AM verim değişkendir ve biraz daha az fare BAL sıvısı bundan olabilir. BAL sıvısı, lavaj ve hastanın klinik durumu kullanılan tuz çözeltisi hacmi hacmi AM verim insan BAL sıvısı üzerinden bağlıdır.</li>
	<li>Verim ve deneysel gerekliliği üzerinde bağlı olarak, hücre odası slaytlar, kültür yemekleri veya kültür şişeler tohum. İdeal olarak, 1 x 105/mL T25 doku kültürü şişeye 10 mL orta ile AMs tohum.</li>
	<li>37 ° C oksijen kuluçka %5 CO2 atmosfere sahip hücreleri kuluçkaya. Not: AMs yapışık hücreleri olarak büyüyecek ve son derece yavaş büyüyen vardır (zaman iki katına > 7 gün).</li>
	<li>24 saat sonrası Ekim tarihi, AMs olmalıdır yapışık ve kültür orta hafif bir değişiklik tarafından müstakil değil. Orta aspirasyon bir ucundan kaldırmak ve 37 ° C'ye önceden sıcak taze orta ile doldurmak Not: Hücreleri şimdi AM Fizyoloji veya uyaranlara etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. AMs odası slaytları yetiştirilen uygun uygun antikorlar ile Boyanabilen ve mikroskobik görselleştirme için idealdir. Akış sitometrik değerlendirme için AMs kuluçka tarafından çözüm dissociating enzimatik olmayan hücre ile hasat.</li>
	<li>Kültür orta Aspire edin ve kültür yüzey (T25 şişe başına yaklaşık 2 mL) kapak ve 37 ° C'de 5-10 dakika için kuluçkaya dissociating çözüm için yeterince ekleyin. Hiçbir kazıma gerekli olacak ve bu hücreleri mekanik kazımak için tavsiye edilmez. Kenarları hafifçe dokunun, 1-2 mL akışı/arabellek sıralama ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı yapışık hücreleri çoğunluğu ayırmak için pipet.</li>
	<li>RNA çalışmaları için kültür çanak üzerinde doğrudan hücre lizis arabelleği ekleyerek parçalayıcı.</li>
</ol>

<ol><li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li>
<li>Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+prevent+lethal+influenza+pneumonia+by+inhibiting+infection+of+type-1+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells.</a> PLoS Pathog. 13 (1), e1006140(2017).</li>
<li>Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+alveolar+macrophages+during+influenza+infection+facilitates+bacterial+superinfections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections.</a> J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).</li>
<li>MacLean, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+inhaled+particulate+antigens+by+lung+phagocytes.+A+mechanism+for+the+effective+inhibition+of+pulmonary+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity.</a> Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+alveolar+macrophages+by+clodronate-liposomes+aggravates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung.</a> J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).</li>
<li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+essential+for+protection+from+respiratory+failure+and+associated+morbidity+following+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004053(2014).</li>
<li>Pribul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+a+major+determinant+of+early+responses+to+viral+lung+infection+but+do+not+influence+subsequent+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development.</a> J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).</li>
<li>Macdonald, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+alveolar+macrophages+for+sustained+mucosal+T-cell+recall+confers+long-term+protection+to+mice+against+lethal+influenza+challenge+without+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).</li>
<li>Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+alveolar+macrophage+depletion+on+liposomal+vaccine+protection+against+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).</li>
<li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+donor+alveolar+macrophages+in+human+lung+transplant+recipients+that+influences+donor+specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses.</a> Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).</li>
<li>Sekine, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+passenger+leukocytes+in+allograft+rejection%3A+effect+of+depletion+of+donor+alveolar+macrophages+on+the+local+production+of+TNF-alpha%2C+T+helper+1%2FT+helper+2+cytokines%2C+IgG+subclasses%2C+and+pathology+in+a+rat+model+of+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation.</a> J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).</li>
<li>Borie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+Rev%22%5BJournal%5D)">Pulmonary alveolar proteinosis.</a> Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).</li>
<li>Greenhill, S. R., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+alveolar+proteinosis%3A+a+bench-to-bedside+story+of+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction.</a> Chest. 136 (2), 571-577 (2009).</li>
<li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113(2014).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li>
<li>Hashimoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+self-maintain+locally+throughout+adult+life+with+minimal+contribution+from+circulating+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes.</a> Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).</li>
<li>Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prolonged+life-span+of+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The prolonged life-span of alveolar macrophages.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).</li>
<li>Maus, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+alveolar+macrophages+are+replaced+by+recruited+monocytes+in+response+to+endotoxin-induced+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).</li>
<li>Perdiguero, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li>
<li>Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophage+replication.+One+mechanism+for+the+expansion+of+the+mononuclear+phagocyte+population+in+the+chronically+inflamed+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung.</a> J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).</li>
<li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> J Exp Med. , (2017).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+pulmonary+intravascular+nonclassical+monocytes+recruit+recipient+neutrophils+and+mediate+primary+lung+allograft+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction.</a> Sci Transl Med. 9 (394), (2017).</li>
<li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li>
<li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li>
<li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.

AMs doğumda başlayan ve tüm yaşam süresi26üzerinde kalıcı ciğerleri doldurmak uzun yaşam akciğer yerleşik makrofajlar vardır. Pulmoner Fizyoloji7 ve patoloji12 ve pulmoner otoimmünite24 toplam tahmin etmek için potansiyel rolleri kabul edilmiştir. AMs akciğerler11,27 ' uzun vadeli bir durum olduğundan ve harekete geçirmek ve bağışıklık yanıtı11<...

Akciğer microenvironment bir ayrıntılı hava kanalı ve damarlara ile benzersiz olarak karmaşık bir ekosistem var. İnhale hava nefes borusunu delip geçmiş çok sayıda şube bronchioles ve bronşlar kan-hava gaz değişimi oluştuğu alveoller ulaşmadan önce geçecek. Atmosferi ile doğrudan etkileşim nedeniyle solunum yüzey havadaki parçacıklar ve kirleticilerin zararlı etkilerinden koruma gerektirir. Fiziksel, kimyasal ve immünolojik engeller bir takım akciğer korumak. Özellikle, solunum yüzeyde fagositler dağıtımını bir önemli ilk satır savunma sistemi hizmet vermektedir. Alveoler makrofajlar (AMs) akciğer yerleşik fagositler bir türdür ve akciğer makrofaj havuzu büyük çoğunluğu kadar yapıyorlar. Onların adından da anlaşılacağı gibi AMs öncelikle alveoler Lümen yerelleştirilmiştir ve sürekli ortam atmosfer örnek ve alveoler epitel1ile iletişim kuran sesil hücreler olarak ortaya çikmaktadir. Kararlı duruma akciğerlerde AMs2olan kompozisyon iltihap, enfeksiyon ya da kronik kirleticiler maruz nedeniyle değiştirebilir, alveoler uzayda fagositler % 95'den fazla vardır.
AMs geniş bir akciğerlere yerel olabilir fonksiyonların ve/veya sistemik önemli alanda katılmak. Örneğin, AMs geliştirme ve en uygun akciğerler işleyişi ve gereklidir; immün gözetim; ve hücresel enkaz patojenler ve inhale parçacıklar3,4,5,6,7istila, boşluk. AMs hedeflenen tükenmesi izni solunum virüs ve bakteri4,8zarar olduğu bilinmektedir. Fagositler ve pulmoner homeostazı ilk satır savunucuları olarak onların rol yanı sıra, AMs alabilme T antijen sunan hücreler bağışıklık9, hücre gibi çalışmaya burunici aşı10 etkinliğini potentiating bilinen ve Akciğer tarafından kısıtlanmış otoimmünite akciğer nakli11,12sonra etkileyen. Eksikliği AM işlevindeki pulmoner alveoler proteinosis (PAP), bir genetik mutasyon, malignite veya pulmoner yüzey aktif maddeleri13,14Gümrükleme bozar enfeksiyon kaynaklanan bir durum bağlı. AMs nakli şimdi PAP 15,16tedavisi için bir tedavi yaklaşımı olarak keşfedilmeden.
AMs embriyogenez sırasında kaynaklanan ve hayatı boyunca akciğerlerde lökosit2,17dolaşan tarafından değiştirilen olmadan kalıcı olması için bilinir. AM ciro homeostatik akciğerlerde tespit edilemez olmasına rağmen çeşitli düzeylerde AM ciro enfeksiyon da dahil olmak üzere bazı klinik koşullarda bildirilmiştir grip virüsü4, myeloablative ışınlama18, endotoksin maruz 19ve yaşlılık20. AMs via düşük dereceli nükleer silahların yayılmasına karşı17,21kendini yenilemek inanılıyor, ama bazı yeni çalışmalar monosit intravasküler akciğer makrofajlar22,23 altında bir nüfusa çıkmasına neden olabilir olduğunu iddia Ama bu yeni dönüştürülmüş pulmoner makrofajlar işlevselliğini deneysel koşullar henüz akciğer hastalıklarında tanımlanması gerekir. Ayrıca, AM etkinleştirme içeriğinde uyarıcı eşik anlama akciğer iltihabi sinyalleri ve immunoregulatory makine arasında bir denge korumak çalışır gibi potansiyel olarak ilginç bir alan olduğunu.
Bağışıklık yönetmelik kaybına yol fizyolojik veya patolojik değişiklikler çeşitli klinik ayarları (Örneğin, solunum yolu enfeksiyonları, inflamatuar akciğer hastalığı ve fibrotik akciğer hastalığı) değerlendirmek önemlidir. Yine de, AMs giderek göstergeleri veya hatta akciğer sağlığı11,24belirleyicileri kabul edilmektedir. Şu anda, hasat, karakterize, ve/veya bakımını AMs insanlar ve preklinik fare modelleri için kullanılabilir birleştirilmiş iletişim kuralı vardır. AM öncüleri ve fenotipleri üzerinde bir fikir birliği olmaması ve detaylı bir metodoloji yokluğu AM deşifre rolleri büyük barikat akciğer sağlığı ve hastalıkları olmuştu. Aşağıdaki iletişim kuralı kesin kimlik, yalıtım ve büyük ölçüde AM davranış anlayışı ilerletmek ve tanı ve tedavi edici çalışmalar AM hedefli kolaylaştırmak vitro kültür strateji sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Enzimatik olmayan hücre ayrıştırıcı çözelti</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Merhem</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G Kateter ve nbsp;</td><td>Terumo Medikal Ürünler</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Emilmeyen ipek örgülü sütür&nbsp;</td><td>Kent Bilimsel</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' S Fosfat Tamponlu Salin&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Fare Fc bloğu&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Lizis tamponu (PureLink RNA Kiti)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-Merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II hücre sıralayıcı&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin&nbsp; (Ketattezi)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin ve nbsp; (AnaSed)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liferaz TL&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&mu; M hücre süzgeci&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Fc bloğu</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Kontes II Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>Tripan Mavi Çözelti</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>L-929 hücre hattı</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>ATCC,&nbsp; CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin&nbsp;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 Doku kültürü şişesi</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>156367 60 mm kültür kabı&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konik tüp&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik tüp&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa hücre analizörü</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FlowJo</td><td>FlowJo v10.4</td><td>Analiz Yazılımı</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Fare)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Klon I3/2.3, FITC konjuge</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Fare)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Klon M1/70, PerCP/Cy5.5 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Fare)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Klon N418, BV 421 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (Fare)</td> <td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Klon AF6-120.1, PE / Cy7 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (Fare)</td> <td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Klon E50-2440, PE-CF594 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (Fare)</td> <td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Klon 551, PE konjuge</td></tr><tr><td>Anti-F4 / 80 (Fare) Biyoefsane</td><td></td><td>123118</td><td>Klon BM8, APC/Cy7 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (Fare)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Klon HK1.4, BV605 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-CD64 (Fare)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Klonu X54-5/7.1, BV711 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (Fare)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Klon M1/69, BV510 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Fare)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>Klon OX-62, BV650 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-CD317 (Fare)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>Klon 927, APC konjuge</td></tr><tr><td>Anti-CXCR1 (Fare)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>Klon SA011F11, BV785 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (İnsan)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Klon HI30, AF488 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (İnsan)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Klon M1/70, PE/Cy7 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (İnsan)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Klonu L243, APC/Cy7 konjuge</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (İnsan)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Klonu 7-239, APC konjuge</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (İnsan)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Klonu 15-2, PE konjuge</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (İnsan)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Klonu GHI/61, BV421 konjuge</td></tr></tbody></table>

yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar vitro kültürü

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveoler makrofajlar ölümcül farklılaştırılmış, akciğer yerleşik makrofajlar doğum öncesi kökeni vardır. Alveoler makrofajlar onların uzun ömürlü ve akciğerleri ve işlev yanı sıra onların akciğer lokalize yanıt enfeksiyon ve inflamasyon onların önemli rol içinde benzersizdir. Bugüne kadar tanıma, yalıtım ve alveoler makrofajlar insan ve fare kullanımı birleştirilmiş yöntem bulunmaktadır. Böyle bir yöntem çalışmaları bu önemli doğuştan gelen bağışıklık hücreleri üzerinde yapılan çeşitli deneysel ayarları için gereklidir. Alveoler makrofajlar bronchoalveolar lavaj sıvı veya Akciğer doku hasat ve onları içinde vitrokorumak için kolayca herhangi bir laboratuvar tarafından kabul edilebilir, burada açıklanan yöntemi basitleştirilmiş bir yaklaşımdır. Alveoler makrofajlar öncelikle alveoller yapışık hücreleri olarak meydana çünkü bu yöntemin önce hasat ve kimlik kekii üzerinde odaklanmıştır. Akciğer son derece bozukluklarına bir organdır ve çeşitli hücre tiplerinin myeloid ve lenfoid kökenli yaşamak, etkileşim ve akciğer microenvironment tarafından etkilenmiştir. Burada açıklanan yüzey işaretlerinin kümesini kullanarak, araştırmacılar kolayca belirsizliğe yer bırakmadan alveoler makrofajlar diğer lökositler tanımlanması, ayrıştırılması ve onları aşağı akım uygulamalarda arındırmak. Burada geliştirilen kültür yöntemi her iki insan destekler ve alveoler makrofajlar içinde vitro büyüme için fare ve hücresel ve moleküler çalışmalar ile uyumludur.

Fare AMs tanımlamak için akış sitometrik yaklaşım şekil 1' de gösterilen. Bu yüzey işaretlerinin diğer akciğer yerleşik veya akciğer infiltre fagositler AMs ayrım gerekli en az set analizini içerir. Fark analiz olumlu interstisyel makrofajlar, dendritik hücreler, nötrofiller, monosit ve akciğerlerde oluşan monosit kaynaklı akciğer makrofajlar üzerinden AMs tanımlamak için gereklidir. Yüzey işaretlerinin aşağıdaki düzeni bu hücre türleri birbirinden AM...

Bu iletişim metodolojisi yalıtım ve kültür insanlardan alveoler makrofajlar ve deneysel amaçlar için fare modelleri açıklar.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Bu prosedürün genel amacı, insan ve fare alveolar makrofajlarını akciğerlerden ve bronkoalveoler lavaj sıvısından izole etmek ve in vitro kültürleri için yöntem geliştirmektir. Bu yöntem, alveolar makrofajların solunum yolu enfeksiyonu, inflamasyon ve otoimmünitedeki rolü gibi pulmono immünolojisi alanındaki bazı önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, alveolar makrofajları diğer akciğer lökositlerinden ayırt edebilmek ve deneysel amaçlar için yüksek oranda saflaştırılmış alveolar makrofaj popülasyonu elde edebilmektir.Anestezi uygulanmış bir fareyi ventral tarafı yukarı bakacak şekilde bir diseksiyon yüzeyine yerleştirin. Dehidrasyonu önlemek için gözlere oftalmik veteriner merhemi sürün. Dezenfekte etmek için farenin tüm ventral yüzeyini %70 izopropanol ile doyurulmuş steril alkol hazırlama pedleriyle silin.Fareyi dört bacağı da korunmuş şekilde monte edin. Karın boşluğunu mikro diseksiyon aletleriyle nazikçe açın. Herhangi bir iç organa zarar vermeden veya sarkan doku oluşturmadan mümkün olduğunca fazla alan açmaya özen gösterilmelidir.Göğüs kafesini mediastenden yavaşça keserek göğüs boşluğunu nazikçe açın. İdeal olarak, göğüs kafesi bir yandan diğer yana eksize edilebilir. Göğüs boşluğunu açarken akciğerlerin akciğer zarına zarar vermemek için son derece dikkatli olunmalıdır.İnferior vena kava'yı bulun ve farenin kanını almak için bir kesi yapın. Kanı emmek için emici pamuklu pedler kullanın. Dolaşımdaki kan hücrelerini temizlemek için sağ ventriküle 10 mililitre buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin enjekte edin.Emici pamuklu pedlerle kan akışını emdirin. Tamamen perfüze edildikten sonra, akciğerler beyazlamış görünecek ve daha sonra lavaj için hazır hale gelecektir. Hava yolunu ortaya çıkarmak için boyundaki cildi ve kasları nazikçe kesin.Trakeaya zarar vermeden bitişik kasları, kıkırdakları ve yağ dokularını dikkatlice çıkarın. Daha sonra, trakea üzerinde, gırtlağın arkasında küçük bir kesi yapın. Bu kesi, trakea hala gırtlağa bağlıyken içine bir kateter yerleştirmek için yeterli olmalıdır.BAL sıvısının toplanmasındaki en kritik adım, lavaj sırasında sızıntıları en aza indirecek bir kateterin trakeaya güvenli bir şekilde bağlanmasıdır. Trakeaya akciğerlere doğru iğnesiz bir inç 22 gauge kateter yerleştirin. Kateteri ipek örgülü bir sütür ve kare bir düğüm ile sabitleyin.Sağlam ellere sahip olmak ve bu adımı takip etmek için yavaş ve nazikçe soluk borusu ve akciğerlerin yırtılmasını önler. Katetere buz gibi soğuk BAL tamponu ile doldurulmuş bir mililitrelik bir şırınga takın ve tamponu yavaşça akciğerlere aşılayın. Bu akciğerleri şişirir.Şırıngayı katetere beş saniye bağlı tutun ve ardından pistonu hafifçe çekerek lavaj sıvısını aspire edin. Bu akciğerleri söndürür. Sıvıyı, buzun üzerine yerleştirilmiş 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.Şişirme ve söndürmeyi dokuz kez daha tekrarlayın ve lavaj sıvısını bir araya getirin. Yıkama başına bir mililitre tamponu aşmayın, çünkü bu akciğer kapasitesini aşabilir ve yırtılmasına neden olabilir. 10 mililitre BAL sıvısını 250 kez g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.Hücre peleti BAL hücreleri içerir. BAL hücrelerini 100 mikrolitre akış sıralama tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri metin protokolünde açıklandığı gibi boyamaya ve sıralamaya devam edin.Diseksiyon için anestezi uygulanmış bir fare hazırlayın, insizyonlar yapın ve fareyi daha önce olduğu gibi kanayın. Dolaşımdaki kan hücrelerini temizlemek için sağ ventriküle 10 mililitre buz gibi PBS enjekte edin. Tamamen perfüze edildikten sonra, akciğerler beyazlamış görünecek ve hasada hazır hale gelecektir.Trakeayı, kan damarlarını ve bağları beş mililitre soğuk DMEM ile 15 mililitrelik konik bir tüpe keserek akciğerleri inceleyin. Bir sonraki adıma kadar buz üzerinde tutun. Perfüze akciğerleri, üç mililitre DMEM içeren steril ve pirojen içermeyen 60 milimetrelik bir kültür kabına aktarın.Diseksiyon forsepslerinin yardımıyla, varsa hava yollarını ve diğer sert akciğer dışı doku materyallerini çıkarın. Akciğer dokusunu bir neşter ile bir milimetreden daha küçük boyutta doğrayın. Liberase TL'nin mililitresi başına 300 mikrogram ve DNA'nın mililitresi başına beş birim ekleyin.Pipetleme ile karıştırın ve 37 santigrat derecede bir inkübatörde 25 dakika inkübe edin. 10 dakika sonra, pipetleme ile bir kez hafifçe karıştırın. Ayrışmış akciğerleri 50 mililitrelik konik bir tüp üzerine monte edilmiş 100 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin.Filtredeki hücre kümelerini karıştırmak için bir mililitrelik şırıngadan bir pistonun arkasını kullanın. Filtreyi 20 mililitre yıkama tamponu ile yıkayın. Beş dakika boyunca 500 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.Süpernatanı atın ve hücre peletini 20 mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Süzme ve santrifüjleme adımlarını iki kez tekrarlayın, her seferinde filtreyi ve tüpü değiştirin. Son olarak, hücre peletine 100 mikrolitre akış ayırma tamponu ekleyerek tek hücreli süspansiyonu hazırlayın.Metin protokolünde açıklandığı gibi antikor boyama ve hücre sıralama gerçekleştirin. Hücre tasnifinin ardından, hücreleri 10 dakika boyunca 250 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyerek hasat edin. Fare'lerini bir mililitre fare kültür ortamında yeniden süspanse edin.Verime ve deneysel gerekliliğe bağlı olarak, hücreleri hazne slaytlarına, kültür kaplarına veya kültür şişelerine tohumlayın. İdeal olarak,'leri bir T 25 doku kültürü şişesinde 10 mililitre ortam ile mililitre başına 100.000'de tohumlayın. Hücreleri% 5 karbondioksit atmosferi ile 37 derece nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.Tohumlamadan 24 saat sonra,'ler yapışık olmalı ve kültür ortamının hafif bir değişikliği ile ayrılmayacaktır. Ortamı bir ucundan aspirasyon ile çıkarın ve önceden 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış taze ortam ile doldurun. Son olarak, şişeyi ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin.Fare bronş alveoler lavaj sıvısında alveoler makrofajların akış sitometrik değerlendirmesi gösterilmiştir. Alveoler makrofajlar CD45 pozitif, CD11c pozitif ve Siglec-F pozitif hücreler olarak tanımlanır. Burada gösterilen, 24 saat boyunca in vitro kültürlenen fare alveolar makrofajlarının temsili bir sonucudur.Hücreler yapışık hale gelmiştir ve kültür ortamının yumuşak bir şekilde değiştirilmesi onları ayırmaz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık iki saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, fare ve insan alveolar makrofajlarını diğer akciğer hücrelerinden nasıl ayırt edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.Ayrıca, aşağı akış deneyleri için güzel bir alveolar makrofaj popülasyonu elde etme prosedürleri olarak. Bu prosedürü denerken, tüm akciğerde yerleşik makrofajların veya fagositlerin alveolar makrofajlar olmadığını hatırlamak önemlidir. Alveoler makrofajlar, doğumdan itibaren akciğerlerde bulunan bir tür özel hücredir.Alveoler makrofajların izolasyonu için, alveolar mikro ortamdan uygulanabilir ekstraksiyon yöntemlerine odaklanılmalıdır. Burada geliştirilen in vitro kültür yöntemi, moleküler ve hücresel analizlerde kullanılabilecek bir laboratuvar koşulunda alveolar makrofajların büyümesini desteklemektedir. Bu işlemi takiben, alveoler makrofajların biyolojisi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için adoptif hücre transferi, antijen sunumu ve inflamatuar uyaranlara yanıtın değerlendirilmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yazıda, akciğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ikamet ve polianhidrid nanopartiküller ile ko-kültür tepki olarak aktivasyon inceleyerek murin alveoler makrofaj, hasat için protokoller açıklanmaktadır.

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Konfokal mikroskopi tarafından fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol için izole edilmiş fare alveolar makrofaj yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

Burada murin peritoneal makrofajları izole etmek için basit bir protokolü açıklıyoruz. Bu prosedürü, Toll benzeri reseptörlerin uyarılması üzerine gen ekspresyon analizi yapmak için RNA ekstraksiyonu takip eder.

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

Granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile kültürlenen kemik iliği hücreleri, makrofajlar ve dendritik hücreler (DC'ler) içeren heterojen bir kültür oluşturur. Bu yöntem, makrofajları GM-CSF kültüründeki DC'lerden ayırt etmek için MHCII ve hyaluronan (HA) bağlanmasının kullanılmasını vurgular. Bu kültürdeki makrofajlar, alveolar makrofajlarla birçok benzerliğe sahiptir.

Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşmış insan monosit türevi makrofajların hücre kültürü için bir protokol sunulmuştur. Protokol, monositlerin makrofajlara toplu farklılaşması ile birlikte dondurularak saklanmasını kullanır. Daha sonra hasat edilen makrofajlar daha sonra deneyler yapmak için gerekli hücre yoğunluklarında kültür kuyularına ekilebilir.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

Burada fare alveoler makrofajlar ve akciğer üzerinden bakteriyel Temizleme fagositik işlevi analiz etmek için ortak yöntemleri raporu. Bu yöntemler floresein isothiocyanate boncuk tüp bebek fagositoz ve Pseudomonas aeruginosa yeşil flüoresan protein içinde vivo fagositoz çalışma. Biz de P. aeruginosa farelerde temizlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde

Biz Bronkoalveoler Lavaj sıvısı işleme için bir yöntem tarif ve pulmoner HıV rezervuarları değerlendirmek için antiretroviral tedavi kronik HıV enfekte bireylerin periferik kan eşleşen. Bu yöntemler, son derece saf CD4 T hücrelerinin satın alınması ve daha sonra ultrason polimeraz zincir reaksiyonu ile immünofenotipleme ve HIV DNA/RNA ölçülerinde kullanılabilir alveoler makrofajlar sonuçlanır.

Alveoler Makrophaj ve CD4+ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi

Burada sunulan izole etmek için optimize edilmiş bir protokoldür, culturing, transfecting, ve HIV enfekte bireyler ve sağlıklı kontroller insan birincil monositayırt.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Burada sunulan birincil insan kanı monosit izolasyon yanı sıra makrofajlar ve dendritik hücreler ve çok hücreli insan akciğer modeli içine epitel hücreleri ile montaj içine farklılaşma için bir protokoldür. Proinflamatuar uyaranlara maruz kalındığında, taze izole edilmiş veya çözülmüş monositlerden farklı bağışıklık hücrelerinden oluşan kokültürlerin biyolojik yanıtları karşılaştırılır.

Tehlike Değerlendirmesi İçin Epitel Hücreleri ve Primer İmmün Hücrelerden Oluşan Çok Hücreli İnsan Alveoler Modeli

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Öğrenin fare ve insan alveoler makrofajlarını izole etme ve in vitro kültür yöntemlerini. Bu teknik, pulmoner immünolojide solunum hastalıkları ve enfeksiyonları araştırmak için yüksek saflıkta hücre popülasyonu sağlar.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Daha fazla video keşfet