Name: Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Öğrenin, Pseudomonas aeruginosa PA14NR transposon mutant kütüphanesinin yüksek kaliteli kopyalarını üretme yöntemini. Bu protokol, kütüphane bütünlüğünü korurken kontaminasyon riskini azaltır ve mikrobiyoloji araştırmaları için değerli bir kaynak sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Veritabanı arama Lisa Philpotts MGH Treadwell sanal kütüphane onun rehberlik için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Kistik Fibrozis Vakfı (YONKER16G0 ve HURLEY16G0) ve NIH NIAID tarafından desteklenmiştir (BPH ve ADE: R01 A1095338).

Yazarlar hiçbir maddi çıkar çatışmaları rapor. Eliana Drenkard ve Frederick Ausubel oluşturulmasında PA14 nonredundant transposon mutant Kütüphane katıldı. Bryan Hurley ve Lael Yonker şu anda ev ve mutant Kütüphane Massachusetts General Hastanesi Pediatri bölümü bir parçası olarak dağıtın.

P. aeruginosa PA14NR ayarla bilimsel topluluk için değerli bir kaynaktır. Göre Şubat 2017 dataset Clarivate Analytics'in temel bilim göstergeler veritabanından, Liberati vd. (2006) PA14NR ayarla inşaatı açıklayan, 37, Mikrobiyoloji yayınlar üst % 1 sınıflanır. Google Akademik Liberati vd. , 600'den fazla alıntıları raporları aynı derecede-in Ağustos 2017 orijinal el yazması (2006). Kütüphanede P. aeruginosa patogenezinde temel mekanizmaları elucidating ...

Pseudomonas aeruginosa phenotypically ve genotypically farklı ve uyarlanabilir Ayagin Gram-negatif bakteri toprak, su ve en insani ortamlar, hem hem içinde cilt mikrofloranın mevcut olduğunu. Birçok bakteri türü için karşılaştırıldığında, P. aeruginosa 5,5-7 Mbp (65-%67) yüksek G + C içerik ile nispeten büyük bir genom vardır. Ayrıca, onun genleri önemli bir bölümünü metabolik adaptasyon katılmaktadırlar ve çevresel stres1yanıt olarak büyük esneklik için izin düzenleyici ağların bir parçasıdır. P. aeruginosa virülans faktörleri bir bolluk ifade eder, meyil formu biyofilmler için sergiler, birden çok çekirdek yolları algılama aracılığıyla yanıt koordine yeteneği sahip ve antibiyotik direnci geliştirmek için önemli bir kapasite görüntüler ve hoşgörü2,3,4,5,6,7,8. Bu öznitelikler P. aeruginosatarafından neden olduğu enfeksiyonların tedavisinde önemli sorunlar mevcut.
Kronik P. aeruginosa enfeksiyonlar çok sayıda hastalık durumlarında oluşabilir. Kistik fibroz (CF), Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR) gen mutasyon genetik bir hastalığı inspissated, enfekte sekresyonun solunum yolu içinde sonuçları ilerici bronşiektazi ve sonuçta, ölüm solunum yetmezliği9. Yetişkinlik, CF ile hastaların çoğu kronik morbidite ve mortalite ile bu hastalık10ilişkili anahtar bir rol oynayan P. aeruginosa, bulaşmış. Ayrıca, hastalar şiddetli Yanık yaraları11, tracheostomies12, eklem replasmanları13ya da kalıcı kateter14 ile P. aeruginosa enfeksiyon bakteri yeteneği oluşturmak için ilgili etkilenir biyofilmler ve kaçış ana bilgisayar inflamatuar yanıt-e doğru15. Ayrıca, çoklu antibiyotik dirençli ya da hoşgörülü nüfus geniş spektrumlu, sıralı antimikrobiyal tedavi12,16,17 seçildikten sonra kolonizasyon rekabet olmadan oluşur , 18. P. aeruginosa patogenezinde daha iyi anlamak için çok sayıda hastalık durumlarında önemli etkileri olacak.
Suşların PAO1, PA103, PA14 ve PAK, dahil olmak üzere birkaç P. aeruginosa klinik yalıtır P. aeruginosa Patogenez farklı özelliklerini araştırmak için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Soy PA14 en yaygın klonal gruplar dünya çapında19,20 birine ait olan ve yoğun laboratuvarda pasajlı değil bir klinik izole olduğunu. PA14is enfeksiyon, dikkate değer bir endotoksin ile omurgalı modellerinde son derece öldürücü profil21, pili yapısı22, patojen Adaları23, III salgı sistemi (TTSS) yazın, sitotoksisite doğru memeli hücreleri24 ve antibiyotik direnci ve sebat25profillerinde. Ayrıca, PA14 da çok sayıda ana bilgisayar-patojen modeli sistemlerinde son derece öldürücü, bitki yaprak da dahil olmak üzere26,27infiltrasyon modelleri,Caenorhabditis elegans enfeksiyon modeller28, 29, böcek modelleri30,31, hem de fare pnömoni modelleri32,33 ve cilt yanık modelleri34.
Genom çapında mutant kitaplıkları isogenic mutant gen işlevi analizini genomik bir ölçekte izin vererek bir organizma biyolojisi anlamak için çok güçlü araçlar teşkil önemli olmayan genlerdeki koleksiyonlarıdır. İki doygunluk yakınındaki transposon ekleme mutant kitaplıkları P. aeruginosa içinde inşa şu anda dağıtım için kullanılabilir. Transpozonlar ekleme siteleri her iki kütüphane için tespit edilmiştir. Bu sözde nonredundant kütüphaneler genom genelinde Çalışmalar bakteri suşlarının zamanı önemli ölçüde azaltarak kolaylaştırmak ve söz konusu olursa maliyet tarama uncharacterized rasgele transposon mutantlar. MPAO1 içinde inşa P. aeruginosa PAO1 transposon mutant Kütüphane, izole Transpozonlar IS kullanarak strain PAO1phoA/ hah velacZolduğunu / hah35, küratörlüğünü Manoil lab tarafından Washington Üniversitesi. Kütüphane koleksiyonunun geniş genom kapsama alanı sağlar ve çoğu genler36için iki mutantlar içeren bir sıra doğrulanmış 9,437 transposon mutant oluşur. P. aeruginosa PAO1 transposon mutant kitaplığı hakkında bilgi http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm, kamu, internet erişimli Manoil lab Web sitesinde mevcuttur. P. aeruginosa zorlanma Transpozonlar MAR2xT7 ve TnphoAkullanarak strain PA1437 yılında inşa nonredundant transposon ekleme mutant kitaplığı (PA14NR Set) şu anda Pediatri bölümü tarafından dağıtılan PA14 Hastane Massachusetts General. PA14NR ayarla tek transposon eklemeleri önemli olmayan genler37' den fazla 5,800 mutantlarla topluluğu oluşur. PA14NR ayarla inşaatı ile ilgili ayrıntılar da içeren çeşitli PA14NR kullanımını kolaylaştırmak için online arama araçları kamu, internet erişimli site http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB içinde açıklanan Ayarlayın.
Orijinal PA14NR ayarla 5,459 mutantlar, tüm tahmin edilen PA14 genler%3777 temsil eden 4,596 tahmin edilen PA14 genler için karşılık gelen yaklaşık 34.000 rasgele transposon ekleme mutantlar, kapsamlı kitaplığından seçilen oluşur. Kütüphane inşaatı 2006 yılında beri yeni mutantlar eklenmiş ve halen yaklaşık 4,600 PA14 genler temsil fazla 5,800 mutantlar38 PA14NR kümesi içerir. PA14 transposon mutantlar çoğunluğu vahşi türü arka plan37yılında üretildi. Detayları da dahil olmak üzere genetik arka plan, mutant kütüphanenin her üye ile ilgili çevrimiçi veritabanı arama yoluyla veya Nonredundant kütüphane elektronik tablo, her iki özellik (http:// PA14 Web sitesinde kullanılabilir indirme mevcuttur pa14.mgh.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Home.cgi). Mutantlar çoğunluğu MAR2xT7 kullanılarak oluşturulan TnPhoA (phoA) transposon37kullanılarak oluşturulan küçük bir set ile (MrT7) transposon. Her transposon gentamisin (MrT7) veya sefaloridin (phoA) kullanarak mutant seçim için izin verir bir antibiyotik direnci kaset var. Mutantlar PA14NR kümesi 63 96-şey levha depolanır ve kaplamalar, vahşi türü PA14 oluşur aşısını iki ek 96-şey denetimi içerir ve az wells bir hazır ayar deseni ara. Çevrimiçi arama araçları ile büyük ölçüde eşleştirilmiş 96-şey plaka biçimi kolayca mutant fenotipleri ile ilişkili genlerin tanımlamak, kullanıcıların deneyleri eleme özel geliştirme kolaylaştırır. Çevrimiçi arama araçları da arama ve seçim daha fazla çalışmalar için gerekli ek ilgili mutantların kolaylaştırmak.
PA14 ve PAO1 transposon mutant kitaplıklar bilimsel toplum için çok önemli küresel kaynaklar ve onlar birbirlerini tamamlayıcı bilinmeyen genlerin fonksiyonun ve yollar bu bakteriyel patojenin doğrulanıyor. Tesadüfen, PAO1 ve PA14 transposon mutasyon kitaplıklar inşaat beri PAO1 ve PA14 P. aeruginosa farklı büyük subclades için ait tam-genom DNA sıralama analizi birçok P. aeruginosa yalıtır göstermiştir phylogeny7,39,40,41. Klinik P. aeruginosa izole ediyor çünkü bulundu phylogeny PAO1 ve PA14 için farklı P. aeruginosa ait aslında boyunca dağıtılmış alt gruplar iki transposon mutasyon kitaplıkları için karşılaştırmalı değerini artırır çalışmalar.
İnşaat açıklayan ve P. aeruginosa kitaplıkları35,de dahil olmak üzere, bakteri mutasyona uğramış kütüphanelerin eleme yayınlar37,42, literatürde hazır. Ancak, bizim bilgi en iyi şekilde açıklayan ayrıntılı yordamlar ve çoğaltma için kullanılan teknikler hiçbir yayımlanmış bakım ve bakteri mutasyona uğramış kütüphanelerin doğrulama kullanılabilir iletişim kurallarıdır.
Bu yayında sıraladı metodoloji, kullanımı kolaylaştıran üç iletişim kuralları kümesi ve bakım PA14NR kümesi açıklar. İlk protokol çoğaltma Kütüphane PA14NR ayarla alıcıları için önerilen biçimde açıklamaktadır. İkinci Protokolü çizgiler, büyüyen ve bireysel mutant PA14NR ayarla kullanarak tanımlanan depolamak için yönergeler içerir. Kalite kontrol teknikleri, transposon mutantlar parçalardan amplifikasyon PCR ve mutant kimliğini onaylamak için sonraki sıralama dahil olmak üzere üçüncü protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralları kümesi de çoğaltma ve diğer bakteri mutasyona uğramış kitaplıkları veya koleksiyonları bakım için adapte olabilir. Bakteri mutasyona uğramış kitaplıkları veya koleksiyonları çoğaltılması son derece "ana kopya" bütünlüğünü korumak için tavsiye edilir (orijinal kopya aldı). Çoğaltma kümesinin PA14NR rutin laboratuvar kullanım için birkaç kopya ana kopya interwell bulaşma olasılığını en aza indirir.

<table><tbody><tr><td>Kütüphane Çoğaltma Malzemeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril 96 oyuklu Doku kültürü tedavi edilmiş, Fisher</td><td>Scientific</td><td></td> Steril 96 <td>Well</td> Clear</tr><tr><td>V-Bottom 2000&mu aracılığıyla 50 Corning Yaşam Bilimleri 353072 vakası; L Derin Kuyu Plakaları,</td><td>Fisher Scientific</td>Nunc OmniTray aracılığıyla 25 <td>Corning Life Sciences</td><td>3960</td></tr><tr><td>kasası (dikdörtgen plakalar), Fisher</td> Scientific Dikdörtgen Buz Tavası <td>aracılığıyla</td>60 <td>Thermo Scientific Rochester</td><td>242811</td> kutusu</tr><tr><td>, Midi (4L)</td> <td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>432104</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Secure-Gard Koni Maskesi aracılığıyla, Fisher aracılığıyla 300</td><td>Kardinal Sağlık</td><td>AT7509</td> kılıfı <td> Scientific</td></tr><tr><td>AluminaSeal,</td><td>Fisher Scientific</td>Breathe-Easy membran ile 100 <td>Çeşitlendirilmiş Biyoteknoloji</td><td>ALUM-100</td></tr><tr>paketi, <td>Sigma-Aldrich Steril ile</td><td>100</td><td>Çeşitlendirilmiş Biyoteknoloji</td><td>BEM-1</td> paketi</tr><tr><td>, ayrı ayrı paketlenmiş, 50 mL Çözelti Teknesi/Reaktif Rezervuarı,</td><td>Westnet Incorporated</td>Plaka silindiri VWR 60941-118 aracılığıyla 100 <td>Sorenson</td><td>S50100</td> kutusu</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>VWR</td></tr><tr><td>Cryo Lazer Etiketleri aracılığıyla - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", 16 yapraklık paket</td><td>GA International</td><td>RCL-11T1-WH</td><td>via Labtag.com (baskı şablonu Labtag.com'dan da temin edilebilir)</td></tr><tr><td>96 kuyulu çoğaltıcı</td><td>V & P Bilimsel A.Ş.</td><td>Özel 407C, 3,18 mm pim çapı, 57 mm uzunluğunda</td><td>V & P Bilimsel A.Ş.</td></tr><tr><td>Multitron Pro, 3mm Çalkalama inkübatörü</td><td>Infors HT</td><td>l10003P</td>, <td>Infors HT</td></tr><tr><td>Picus 12 Kanal 50-1200&mu aracılığıyla; L Elektronik Pipet</td><td>Sartorius</td><td>735491PR</td>, <td>Sartorius</td></tr><tr><td>Filtre Uçları 50-1200&mu; L,</td> Fisher Scientific aracılığıyla 960 <td>Biohit</td><td>14-559-512</td> paketi<td>; elektronik çok kanallı uyumlu uçları kullanın</td></tr><tr><td>Kuru Buz</td><td>Kullanıcıya özel satıcı<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>Bireysel Mutant Depolama için Malzemeler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Mikrosantrifüj Tüpleri: 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td>, <td>Fisher Scientific aracılığıyla</td></tr><tr><td>Pipetler (P1000, P200, P20, P2)</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>aracılığıyla Gilson</td></tr><tr><td>Kalite Kontrol Malzemeleri PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Mikrosantrifüj Tüpleri: 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td>, <td>Fisher Scientific</td>NanoDrop aracılığıyla</tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td>, <td>ThermoFisher</td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td> <td>aracılığıyla</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omnistrips Kubbeli kapaklı PCR Tüpleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0404</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>ART Bariyeri aracılığıyla Düşük Tutmalı Pipet Uçları (10 uL, 100 uL, 1000 uL)</td><td>Molecular BioProducts, Inc.</td><td>Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL)</td> <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Pipetleri (P1000, P20, P2)</td> <td>aracılığıylaGilson</td><td>F167370</td><td></td></tr><tr><td>Gilson Fisherbrand Premium Mikrosantrifüj Tüpleri aracılığıyla: 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td>, <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>MasterPure DNA Saflaştırma Kiti</td> aracılığıyla <td>Epicentre</td><td>MCD85201</td><td>aracılığıyla Epicentre Technologies Corp</td></tr><tr><td>.GeneRuler 1 kb Plus DNA Merdiveni, kullanıma hazır</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1333</td>, <td>ThermoFisher</td></tr><tr><td>RediLoad Yükleme Tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>aracılığıyla</td><td>750026 ThermoFisher</td></tr><tr><td>Chemicals</td><<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>Kütüphane ve Bireysel Mutant Depolama için Kimyasallar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gliserol MB Sınıfı, 1L</td><td>Sigma Aldrich</td> 1L dH2O Başına <td>Sigma-Aldrich</td>LB Suyu <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> aracılığıyla G5516<td>: 10g tripton, 5g maya özütü, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Moleküler Biyolojide Güncel Protokoller.&nbsp; Wiley, 1994.)</td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7293</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td> aracılığıyla <td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr> Sodyum <tr><td>Hidroksit</td> aracılığıyla <td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB & nbsp; agar</td><td></td><td></td><td>aracılığıyla Yukarıdaki hazırlığa bakın, 15g Bacto Agar ekleyin</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Gentamisin sülfat aracılığıyla, 10g</td><td>BioReagent</td><td>1405-41-0</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>Gibco</td><td>aracılığıyla</td><td>11815024 ThermoFisher Etanol aracılığıyla</td></tr><tr><td>, 190 kanıt</td><td>Decon</td><td>04-355-221</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Kalite Kontrol için Kimyasallar aracılığıyla PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Kullanıcı tarafından tercih edilen satıcı</td><td></td> <td>Tablo 3'te listelenen primerlere bakın</td></tr><tr><td>Corning cellgro Moleküler Biyoloji Sınıfı Su</td><td>Fisher Scientific</td>Taq Polimeraz Tamponu aracılığıyla <td>Corning</td><td>46000CV</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraz aracılığıyla 10342020, rekombinant</td><td>Invitrojen</td><td>10342020</td><td>aracılığıyla ThermoFisher</td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td></td><td>,</td> Sigma-Aldrich <td>aracılığıyla ThermoFisher</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr> aracılığıyla 10297018</tbody></table> canlandırıcı

sipariş edilmiş, pseudomonas aeruginosa baskı pa14 transposon ekleme mutantlar nonredundant kütüphane çoğaltılması

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa phenotypically ve genotypically farklı ve uyarlanabilir Ayagin Gram-negatif bakteri insan ortamlarda her yerde var. P. aeruginosa biyofilmler formu, antibiyotik direnci geliştirmek, virülans faktörleri üretmek ve hızla gelişmeye kronik bir enfeksiyon sırasında yapabiliyor. Böylece P. aeruginosa hem akut ve kronik, enfeksiyonları, tedavisi zor bazı hasta nüfus önemli morbidite sonuçlanan neden olabilir. P. aeruginosa yük PA14 çeşitli PA14 bu patojen çalışmak için çekici bir zorlanma yapma memeli ve nonvertebrate ana bilgisayarları bozar bir korunmuş genom yapısı ile bir insan klinik izole olduğunu. 2006 yılında 5,459 mutantlar 4,596 tahmin edilen PA14 genler için karşılık gelen içeren nonredundant transposon ekleme mutant bir kütüphane oluşturulmuştur. O zamandan beri PA14 Kütüphane dağılımı bireysel genlerin fonksiyonun ve P. aeruginosakarmaşık yollar daha iyi anlamak araştırma topluluğu izin verdi. Çoğaltma işlemi boyunca Kütüphane bütünlük bakımından uygun taşıma ve hassas teknikler gerektirir. Bu amaçla, bu el yazması ayrıntılı adımları Kütüphane çoğaltma, Kütüphane kalite kontrol ve bireysel mutant uygun depolama yer tarif iletişim kuralları sunar.

On iki yeni kopyalarını PA14NR ayarla ben ve üretilen yeni kopya bir kalite kontrol değerlendirme protokolü III kullanılarak gerçekleştirilmiştir protokolünü kullanarak çoğaltılmış.
PA14NR mutant plaka ile birlikte kontrol levha, vahşi türü PA14 oluşur aşılamaya ve hazır ayar deseni (şekil 4A) ara wells az, çoğaltılmış ayarla methology Protokolü ı. denetiminde açıklanan aşağıdaki levha dahildir PA14...

Pseudomonas aeruginosa enfeksiyon savunmasız konaklarda önemli morbidite neden olur. Nonredundant transposon ekleme mutant Kütüphane P. aeruginosa baskı PA14 PA14NR grubu olarak belirlenmiş, analiz çok sayıda süreçlerde gen işlevlerinin kolaylaştırır. Burada sunulan yüksek kaliteli PA14NR ayarla mutant kitaplığın kopyalarını oluşturmak üzere bir protokoldür.

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Bu protokolün genel amacı, PA14NR seti olarak adlandırılan Pseudomonas aeruginosa suşu PA14'ün sıralı, yedekli olmayan transpozon mutant kütüphanesinin yüksek kaliteli kopyalarını oluşturmaktır. Bu protokol, çoğaltma sırasında PA14NR setinin bütünlüğünü koruyarak bu kitaplığın yüksek kaliteli kopyalarını oluşturur. Bu protokolün ana avantajı, kütüphane çoğaltması, kalite kontrolü ve bireysel mutantların uygun şekilde depolanması ile ilgili tüm adımların ayrıntılı bir tanımını sağlamasıdır.Bu protokol P14NR setini kopyalamak için tasarlanmış olsa da, diğer bakteri kütüphanelerini çoğaltmak için uyarlanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, replikasyon işlemi sırasında kontaminasyon riski nedeniyle mücadele edecektir. Bu nedenle, bu protokol bu riski azaltmak için ayrıntılı adım adım talimatlar sağlar.Laboratuvarımız PA14NR setini küresel bilim camiasına dağıtmaktadır. Ve kitaplıkların son kullanıcı tarafından çoğaltılmasını öneririz. Rehberlik sağlamak için, kitaplığın yüksek kaliteli kopyalarının nasıl oluşturulacağını ayrıntılarıyla anlatan bir protokol sunuyoruz.Bu protokolün görsel gösterimi, özellikle çapraz kontaminasyonu önlemek için tasarlanmış adımlar kritik ön

replication-ordered-nonredundant-library-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Kazi, M.I., vd. al., Yüksek Verimli Dizileme için Gram-Negatif Bakterilerde Transpozon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, kanamisin direncine dayalı olarak transpozon eklemeleri taşıyan Gram-negatif alıcı bakterilerin seçimini, miktarını ve korunmasını göstermektedir.

Gram-Negatif Bakterilerin Genomik Transpozon Eklemeleri ile İzolasyonu

Burada, ekrana yüksek yoğunluklu ekleme mutant kütüphanesi oluşturmak için mini-transpozon himar1 mariner dolayımlı mutagenez kullanılarak bir protokol açıklar izole edilmesi ve prototipik Pseudomonas aeruginosa'nın PAO1 in yeni alginat regülatörleri belirlemek.

Alginat içinde üretimi ile ilişkili yeni genlerin tanımlanması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emKullanma&gt; Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon dolayımlı mutagenez

Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir.

Üretilmesi Enterobacter Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Burada, bir transposon-aracılı rasgele ekleme kodlamayan DNA öğesinin gücünü en iyi kromozom konumunu gidermek için kullanıldı.

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

Burada sunulan Escherichia coli veya bakteriyel konjugasyon kullanarak Shigella flexneri yüksek yoğunluklu transposon ekleme kütüphane oluşturmak için basit bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı bir transposon rastgele genomik ekleme tarafından bakterilerde benzersiz mutantlar, yüz binlerce topluluğu oluşturulmasına izin verir.

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Biz burada transposon mutagenesis tanımlamak ve transposon leptospiral mutantlar dokularda hamster bir meydan okuma sonra ölçmek için yüksek üretilen iş sıralama ile birleştirir bir tekniğini tanımlamak. Bu iletişim kuralı için hayatta kalma ve hayvanlar yayılmasında ekran mutantlar için kullanılabilir ve vitro çalışmalar için de uygulanabilir.

Yüksek üretilen iş paralel sıralama ölçü Fitness Leptospira interrogans Transposon ekleme mutantlar sırasında altın Suriye Hamster enfeksiyon için

Burada multicopy plazmid rolü antibiyotik direncinin evrime sınamak için deneysel bir yöntem mevcut.

Multicopy plazmid rolü antibiyotik direnci gelişimi test

Gram-negatif bakterilerde doymak üzere transpozon mutant kütüphaneleri oluşturmak ve daha sonra yüksek işlemli sıralama için DNA amplicon kütüphanelerinin hazırlanmasını tanımlayan bir yöntem. Örnek olarak, biz ESKAPE patojen, Acinetobacter baumanniiodaklanmak , ama bu protokol Gram-negatif organizmaların geniş bir yelpazede için münasip olduğunu.

Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa'da çeşitli motilite tiplerinde yer alan genetik faktörleri tanımlamak için hızlı ve etkili bir yöntem sunar.

Pseudomonas aeruginosa'da Motilite Fenotiplerini Gözlemlemek için Yüksek Verimli Yöntem

Protokolü Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) mikrobiyal biyofilm büyüyen ve analiz etmek için bir akış hücresi sistemi uygulama nitelendirdi.

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Öğrenin, Pseudomonas aeruginosa PA14NR transposon mutant kütüphanesinin yüksek kaliteli kopyalarını üretme yöntemini. Bu protokol, kütüphane bütünlüğünü korurken kontaminasyon riskini azaltır ve mikrobiyoloji araştırmaları için değerli bir kaynak sunar.

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Daha fazla video keşfet