Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Bu protokolün genel amacı, PA14NR seti olarak adlandırılan Pseudomonas aeruginosa suşu PA14'ün sıralı, yedekli olmayan transpozon mutant kütüphanesinin yüksek kaliteli kopyalarını oluşturmaktır. Bu protokol, çoğaltma sırasında PA14NR setinin bütünlüğünü koruyarak bu kitaplığın yüksek kaliteli kopyalarını oluşturur. Bu protokolün ana avantajı, kütüphane çoğaltması, kalite kontrolü ve bireysel mutantların uygun şekilde depolanması ile ilgili tüm adımların ayrıntılı bir tanımını sağlamasıdır.

Bu protokol P14NR setini kopyalamak için tasarlanmış olsa da, diğer bakteri kütüphanelerini çoğaltmak için uyarlanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, replikasyon işlemi sırasında kontaminasyon riski nedeniyle mücadele edecektir. Bu nedenle, bu protokol bu riski azaltmak için ayrıntılı adım adım talimatlar sağlar.

Laboratuvarımız PA14NR setini küresel bilim camiasına dağıtmaktadır. Ve kitaplıkların son kullanıcı tarafından çoğaltılmasını öneririz. Rehberlik sağlamak için, kitaplığın yüksek kaliteli kopyalarının nasıl oluşturulacağını ayrıntılarıyla anlatan bir protokol sunuyoruz.

Bu protokolün görsel gösterimi, özellikle çapraz kontaminasyonu önlemek için tasarlanmış adımlar kritik öneme sahiptir. Kendini korumanın yanı sıra bakteri kültürlerinin korunması için, PA14NR seti olarak adlandırılan P aeruginosa suşu PA14'ün yedekli olmayan transpozon yerleştirme mutant kütüphanesini tutarken her zaman bir laboratuvar önlüğü, eldiven ve maske giyilmelidir. Yaklaşık 60 mililitre erimiş LB agar'ı dikdörtgen plakalara dökerek LB Agar plakalarını hazırlayın.

Plakaları kullanmadan önce yaklaşık bir saat steril bir kapüşonda kurutun. Etanol ile silinmiş bir tezgah üzerinde bunsen brülörü ile steril bir alan oluşturun. Ve çoğaltıcı pim sterilizasyonu için uygun solüsyonlara sahip kaplar oluşturun.

Eksi 80 santigrat derece dondurucudan bir PA14NR set masterplate'i çıkarın ve 4 litrelik bir buz tavasında kuru buzun üzerine yerleştirin. Kuru buzdan kopyalanacak 96 kuyulu masterplate'i alın ve kısa bir çözülmeye izin vermek için tezgahın üzerine yerleştirin. Ana plakayı ve agar plakasını sol üst köşedeki her iki plakanın A1 koordinatı ile hizalayın.

Dikdörtgen agar plakası üzerinde A1 koordinatının konumunu işaretleyin. Çoğaltıcı pimleri sterilize etmek için, pimleri 30 saniye boyunca 250 mililitre %0,3 ila 0,5 sodyum hipoklorit içine daldırın. Fazla sıvıyı çıkarmak için çoğaltıcıya hafifçe vurun ve pimleri 10 saniye boyunca 250 mililitre steril ultra saf suya, ardından 30 saniye boyunca 250 mililitre %70 etanole ve iki dakika boyunca 250 mililitre %95 etanole batırın.

Çoğaltıcıyı bunsen brülör alevine dik olarak tutarak, etanol tutuşana kadar aleve yavaşça yaklaşarak ve ardından hemen alevden çekerek çoğaltıcı pimleri alevle sterilize edin. Tüm etanol yandığında alev sönecektir. Steril LB agar içeren kullanılmayan dikdörtgen bir plakaya 30 saniye boyunca sabitleyerek pimleri soğutun.

Çoğaltıcı pimler soğurken, PA14NR set masterplate'deki alüminyum contayı elinizle kısa bir süre ısıtın ve ardından contanın plakaya temas etmediğinden emin olarak dikkatlice soyun. Alüminyum contanın kalıntılarını soymak için cımbız kullanın. Pimlerin 96 kuyucuğun her birindeki donmuş bakteri kültürleriyle temas etmesini sağlamak için çoğaltıcıyı dört yönde de hafifçe iterek ve sallayarak çoğaltıcı pimleri ana plakaya yerleştirin.

Plakanın kenarında bulunan oyuklardaki donmuş kültürlere karşı çoğaltıcı pimleri iterek plakanın dış kenarında bulunan kuyucuklara daha fazla dikkat edin. Çoğaltıcı pimleri agar plakalarının yüzeyine nazikçe yerleştirin. Her mutant suş için yaklaşık dört ila beş milimetrelik birçok çim oluşturmak için çoğaltıcıyı hafif dairesel hareketlerle hareket ettirin.

PA14NR set masterplate'i yeni bir steril alüminyum conta ile kapatın. Her bir oyuğun ve plakanın kenarlarının tamamen kapatıldığından emin olmak için bir plaka silindiri kullanın. 96 kuyulu masterplate'i kuru buza geri koyun.

PA14NR setini kullandıktan sonra tüm çalışma yüzeylerini %70 etanol ile silin. Çoğaltılmış agar plakasını 37 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarın ve gece boyunca inkübe edin. Bu prosedüre başlamadan önce, laminer akış başlığının gereksiz ekipmanlardan arınmış olduğundan emin olun ve davlumbaz üfleyiciyi en az 10 dakika açık tutun.

Davlumbaz yüzeylerini ve davlumbazın içine yerleştirilen tüm öğeleri %70 etanol kullanarak silin. 50 ila 1200 mikrolitrelik 12 kanallı bir elektronik pipet kullanarak, 12 mililitre derinliğinde bir kuyu bloğunun her bir kuyusunu uygun antibiyotikler içeren 525 mikrolitre LB sıvı et suyu ile doldurun. Ardından, laminer akış başlığından çıkarmadan önce derin kuyu bloğunu kapatın.

Ardından, medya dolu derin kuyu bloğunu etanol ile silinmiş bir tezgaha aktarın. Tezgah üzerinde bunsen brülörü ile steril bir alan oluşturun ve çoğaltıcı pin sterilizasyonu için uygun solüsyonlara sahip kaplar kurun. Çoğaltıcı pimlerini daha önce gösterildiği gibi her çözeltiye daldırın.

Çoğaltıcı pimleri alevle sterilize edin. Ardından, 30 saniye boyunca LB agar içeren kullanılmayan dikdörtgen bir plakaya sabitleyerek pimleri soğutun. Çoğaltıcı pimleri, yetişkin mutant suşları içeren agar plakasına nazikçe yerleştirin ve pimlerin agar plakasındaki 96 mutantın tümü ile temas halinde olduğunu kontrol edin.

Daha sonra pimleri beş ila 10 saniye boyunca LB sıvı suyu içeren derin kuyulara daldırın. Kuyuların kenarlarına pimlerle dokunmaktan kaçının. Derin kuyu bloğunu steril, nefes alabilen bir sızdırmazlık membranı ile kapatın.

Her bir kuyunun düzgün şekilde kapatıldığından emin olmak için bir plaka silindiri kullanın. PA70NR setini kullandıktan sonra tüm çalışma yüzeylerini %14 etanol ile silin. Aşılanmış sıvı kültürleri 37 santigrat derece ve 950 rpm'de 15 ila 16 saat boyunca yüksek hızlı bir çalkalayıcıda büyütün.

Laminer akış başlığını temizleyerek ve davlumbaz üfleyiciyi en az 10 dakika açarak başlayın. Tüm davlumbaz yüzeylerini ve davlumbaza yerleştirilen tüm öğeleri %70 etanol ile silin. 96 kuyulu plakayı plastik sargıdan çıkarın.

Her plaka için plaka etiketini soyun ve hedef plakanın A1 ila H1 kuyularına en yakın plakanın kenarı boyunca yerleştirin. Hedef plakanın kapağını hafifçe kaldırın ve plaka bir kapakla kapatıldığında etiketi görüntülemek için etiketi alt kenara yerleştirin. Derin kuyu bloğunu yüksek hızlı çalkalayıcıdan çıkarın ve bloğu steril laminer akış başlığına aktarın.

Nefes alabilen sızdırmazlık membranını dikkatlice çıkarın ve alüminyum conta ile değiştirin. Yoğuşmayı toplamak için derin kuyu bloğunu çok düşük hızda döndürün. Kültürlerin hedef plakalara aktarılması, potansiyel kuyular arası kontaminasyon için en büyük riski oluşturduğundan, steriliteyi korumak için tüm prosedürleri dikkatli bir şekilde takip etmek çok önemlidir.

Derin kuyu bloğunu steril davlumbaza geri koyun. 50 ila 1200 mikrolitrelik 12 kanallı elektronik pipet ve steril filtreli uçlar kullanarak, her oyuğa 525 mikrolitre gliserol LB sıvı et suyu karışımı ekleyin. Elektronik pipet ile 300 mikrolitreyi üç kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek karıştırın.

Damlamayı önlemek için uçları enjekte etmeden önce uçları kuyuların yan tarafına dokunun. Pipeti yeni steril filtreli uçlarla yeniden yükleyin ve bir sonraki kuyucuk sırasını gliserol LB sıvı et suyu karışımı ile doldurun. Tüm kuyucuklar gliserol LB sıvı et suyu karışımı ile doldurulduktan sonra, derin kuyu bloğunun her sırasından 900 mikrolitre gliserol mutant kültür karışımını çekmek için 12 kanallı elektronik pipet ve filtrelenmiş uçları kullanın ve 150 mikrolitreyi kütüphane plakasının altı kopyasını oluşturmak için hedef plakalardaki ilgili sıranın kuyucuklarına dağıtın.

Her 96 kuyulu hedef plakayı kaplamak için steril alüminyum contayı kullanın ve plaka kenarlarını ve tüm kuyucukları tamamen kapatmak için bir plaka silindiri kullanın. Etiket tanımlayıcısını alüminyum conta ile kapatmadığınızdan emin olun. Mühürlü plakaları davlumbazdan çıkarın ve eksi 80 santigrat derece dondurucuda düz ve düz bir yüzeye yerleştirin.

Kitaplığı kullandıktan sonra tüm çalışma yüzeylerini %70 etanol ile silin. Bu videoda gösterilen protokol kullanılarak, önceden ayarlanmış bir modelde interkalasyona tabi tutulmuş kuyu tipi PA14 aşılanmış ve aşılanmamış kuyucuklardan oluşan kontrol plakaları dahil olmak üzere PA14NR setinin 12 kopyası çoğaltıldı. Kontrol plakaları, beklenen büyüme modellerinin varlığından emin olmak için LB agar plakaları üzerinde replikasyondan sonra görsel olarak incelendi.

PA14NR setinin yeni oluşturulan kopyalarından birinden rastgele 38 mutant suş seçildi ve transpozon mutantlarının kimliğini doğrulamak için keyfi primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirildi. DNA parçalarının daha sonraki dizilimi, test edilen 38 mutantın 35'i için mutant kimliğini doğruladı. Ana kopya oluşturulduktan sonra, tüm kitaplığın çoğaltılması yaklaşık 80 saat sürer.

Bu protokolü kullanırken, çalışma alanının sterilliğine her zaman dikkat etmek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, P14NR setinin veya diğer bakteri kitaplıklarının yüksek kaliteli kopyalarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Unutmayın, Pseudomonas ile çalışmak tehlikeli olabilir ve bu protokolü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.

Bu protokol, yalnızca yüksek verimli tarama için değil, aynı zamanda çoğu Pseudomonas aeruginosa genindeki bireysel mutasyonlar için bir kaynak olarak önemli bir kaynak olmaya devam eden Pseudomonas aeruginosa PA14 yedeksiz mutant kütüphanesini korur.