Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen

Bu modelin genel amacı, birden fazla deneysel koşul altında devam eden yaralanmanın verimli ve eşzamanlı karşılaştırmasını kolaylaştırmak için 96 oyuklu bir formatta klinik olarak anlamlı bir nörotravma fenotipi oluşturmaktır. Bu modelin birincil amacı, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi nöron ile nörotravmada yüksek içerikli fenotipik ilaç keşif ekranlarını mümkün kılmaktır. Bu modelde kullanılan plakalar, endüstri standardı 96 oyuklu plaka geometrisini koruyarak, robotik kollar ve otomatik mikroskoplar gibi mevcut yüksek içerikli tarama makineleriyle uyumluluklarını korur.

Başlamak için, yüksek güçte 60 saniye boyunca 200 watt'lık bir plazma temizleyicinin içine dipsiz 96 oyuklu bir plakanın alt tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Daha sonra, plakayı 200 mililitre taze hazırlanmış %1.5 APTES'in içine deiyonize suda, alt tarafı aşağı bakacak şekilde 20 dakika çeker ocakta yerleştirin. İnkübasyona 10 dakika kala, plazma ile işlenmiş bir silikon zarı 7,5 x 11 santimetrelik bir parşömen kağıdı dikdörtgeninin üzerine yerleştirmek için forseps kullanın ve 7,5 x 11,05 santimetrelik bir alüminyum levhayı plaka imalat kelepçesinin alt kısmına hizalayın.

Ardından silikon zarı ve parşömen kağıdını alüminyum levha üzerine hizalamak için forseps kullanın. Kaplama süresinin sonunda, dipsiz plakayı APTES banyosundan çıkarın ve fazla çözeltiyi silkeleyin. Dipsiz plakayı, her daldırmada beş saniye boyunca iki ardışık 200 mililitre deiyonize su banyosuna batırın ve fazla suyu silkeleyin.

Basınçlı hava ile tamamen kuruduktan sonra, altsız plakayı plaka imalat kelepçesinin üst kısmına yerleştirin ve altsız plakayı ve silikonu birbirine bastırmak için kelepçeyi yavaşça kapatın. Girinti bloğunu hizalamak için, plakayı canlı beslemeli bir kamera altında germe cihazının s'sine sabitlemek için sahne kelepçelerini kullanın ve cihazın üzerine bir kubbe ışığı yerleştirin. Yaralanma cihazına bağlı bilgisayarda cihaz kontrol yazılımını başlatın ve in vitro nörotravma projesini çalıştırmak için Başlat penceresine tıklayın.

Proje penceresinden, Hareket Kontrolü ve konum izleyici sanal cihazlarına çift tıklayın. Yaralanma cihazını çevreleyen kafesi kapatın ve aleti çalıştırmak için hareket kontrolü sanal aletindeki oka tıklayın. Sahneyi girintilerle temas edecek şekilde iki milimetre mesafeye indirmek için alt kısma yakın bir yere tıklayın, ardından sanal enstrümanı durdurmak için durdur'a tıklayın.

Proje penceresinde Axis One'a sağ tıklayın ve Etkileşimli Test Paneli'ne tıklayın. Adım boyutunu 50 mikrometre olarak ayarlamak için açılan pencerede yer alan Target Position (Hedef Konum) alanına 500 birim girin. Ardından, plaka herhangi bir girintiyle ilk kez temas edene kadar art arda Git'e tıklayın ve kamera tarafından görüntülenen canlı görüntüde temas olup olmadığını kontrol edin.

Dikey aşama konumu, etkileşimli test paneli penceresinin sol üst köşesinde bildirilecektir. Her kuyucuk girintilerle temas edene kadar plakayı daha da indirin, kamerayı hareket ettirin ve s'yi hareket ettirin.tage tüm plakayı görüntülemek için gerektiği gibi. Tüm direkler temas halindeyken bildirilen dikey aşama konumuna dikkat edin ve etkileşimli test panelini kapatın.

Ardından, hareket kontrolü sanal enstrümanını çalıştırın ve sahne alanı konumundayken sanal enstrümanı durdurmak için durdur düğmesini kullanarak sahneyi yükseltmek için Üst'e tıklayın. Cihazı devre dışı bırakmak için kapıyı açın, ardından köşeyi alçaltmak için ilk temas eden köşedeki seth vidasını gevşetin ve en son temas eden köşeyi kaldırmak için karşı vidayı sıkın. Plaka tüm girintilerle aynı anda temas edene kadar blok indirmeyi, gözlemlemeyi ve ayarlamayı tekrarlayın.

Girinti bloğunun dikkatli bir şekilde hizalanması, plakanın tüm oyukları boyunca düzgün bir yaralanma elde etmek için önemlidir. Cihazı tekrar devre dışı bırakmak için kapıyı açın ve bağlama vidalarını girinti bloğundaki deliklerine yerleştirin. Ardından vidaları yerine sıkın ve plaka temas ettiğinde etkileşimli test paneli tarafından bildirilen s'ye dikkat edin.

Plakayı uzatmak için, sanal enstrümanı kontrol etme konumundaki Dosya Yolu alanındaki dosya adını benzersiz bir dosya adıyla değiştirin ve Çalıştır okuna tıklayın. Girintinin derinliğini ve süresini ve hareket kontrol paneli sanal enstrümanındaki Yaralanma ve Yaralanma Süresi alanlarını ayarlayın. Plaka sıfır konumundayken, hareket kontrol paneli sanal enstrümanını çalıştırın ve plakayı girintilemek için Yarala'ya tıklayın.

Sahneyi yukarı taşımak için Üst'e tıklayın, plaka en üst konumdayken durdur'a tıklayın ve yaralanma cihazını devre dışı bırakmak için kapıyı açın. Ardından, belirtilen maksimum yer değiştirmenin uygulandığını doğrulamak için konum izleyici sanal cihazında sunulan aşamanın yer değiştirme geçmişini inceleyin ve verileri uygun bir elektronik tablo programına aktarın. Silikon zarın gerilmesini değerlendirmek için, plazma işleminden sonra, plakayı yumuşak bir yüzeye yerleştirin ve küçük çıkıntıyı kalıcı bir işaretleyici kalemden gelen mürekkeple bir damga üzerine astarlayın.

Damgayı test edilecek ilk kuyucuğa yerleştirin ve iyi bir mürekkep aktarımı sağlamak için hafifçe vurun. Tüm kuyular damgalandığında, yüksek hızlı kamerayı, görüş alanı üçe dört ızgarada 12 girinti içerecek şekilde, lens en küçük numaralı F-stop'a ayarlanmış durumda, yaralanma cihazının üzerindeki bir bom standına yerleştirin. Yer sıfır noktası konumundayken, kamera yazılımındaki kayıt düğmesine bir kez tıklayın, böylece tetiği okuyun ve parlak dağınık eksenel ışığı açın.

Ardından plakayı az önce gösterildiği gibi girintileyin ve eksenel ışığı kapatın. Bir hücre kültürüne zarar vermek için, plazma ile muamele edilmiş plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre laminin ile muamele edilmiş, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi nöronlar ekleyin ve hücrelerin plaka tabanına 15 dakika boyunca plaka tabanına yapışmasına izin verin. İki ila üç günlük kültürden sonra, plakayı yaralanma cihazı aşamasına sıkıştırın ve kültürleri ortam havasına maruz bırakmadan plakayı sabitlemek için kapağın konumunu ayarlayın.

Ardından, plaka sıfır noktası konumundayken, plakayı az önce gösterildiği gibi girintileyin. Optimal bir yaralanmamış kültür, beşten fazla hücreden oluşan herhangi bir küme varsa çok az olacaktır ve nöritler, çok az boncuklanma ile veya hiç boncuklanma olmadan bireysel, uzun, ince ve kavisli olacaktır. İdeal koşullar altında, kültürlerin canlılığı, üreticinin veri sayfasında belirtilen canlılığa çok yakın olmalı ve silikon üzerindeki kültürler, geleneksel sert kültür substratları üzerinde tutulanlara benzemelidir.

Hücre yoğunluğunun arttırılması, kültürde oluşan kümelerin sayısını ve boyutunu arttırırken, laminin konsantrasyonunun arttırılması tipik olarak bu etkiye karşı koyar. % 57'lik bir tepe suş ile yaralanan kültürlerde, yaralanmadan dört saat sonra, nöritler kısalır veya kaybolur ve bazılarında kalan canlı hücreler tarafından gösterilen topaklanma ile boncuklar bulunur. Özellikle, daha yüksek doz laminin tedavileri, daha yüksek doz laminin ile muamele edilen kültürlerde nörit uzunluğundaki ve hücre canlılığındaki artışlarla kanıtlandığı gibi, hücre kültürlerine verilen hasarın şiddetini konsantrasyona bağlı bir şekilde azaltır.

Bu prosedürü denerken, teslim sürelerini göz önünde bulundurmak önemlidir. Örneğin, membran detoksifikasyonu üç gün sürer ve üretilen plakalar kullanımdan önce gece boyunca kürlenmelidir. Yaralanma cihazının hareketini sürdürmek için güçlü bir ses bobini içerdiğini ve aktif olduğunda cihazdan her zaman uzak durulması gerektiğini ve cihazı yalnızca sahne hareketinin en üst noktasındayken kapatmanız gerektiğini unutmayın.