Name: Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Öğrenin, insan iPS hücre kaynaklı nöronlarda 96-kuyu formatında yüksek hızlı streç yaralanma modeli oluşturmayı. Bu yöntem, nörotravma araştırmalarında yüksek içerikli fenotipik ilke keşfi taramalarını hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser kısmen bir hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21NS098129) tarafından desteklenmektedir. SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng ve tasarlayan ve bu el yazması açıklanan yüksek hızlı görüntüleme deneyler sırasında kullanılan ışıklar desteklemek için bir yapı inşa Feng Yuan Bu mükemmel teknik yardım kabul etmek istiyoruz .

<ol><li>Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaul%2C+M+%22Traumatic+brain+injury+in+the+United+States%3A+emergency+department+visits%2C+hospitalizations%2C+and+deaths%2C+2002-2006%22">Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006</a>. , (2010).</li>
<li>Kabadi, S. V., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+strategies+for+traumatic+brain+injury%3A+improving+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).</li>
<li>Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+disrupted+in+human+ALS+motor+neurons+identified+through+genetic+correction+of+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+tolerance+and+delayed+elastic+response+of+cultured+axons+to+dynamic+stretch+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury.</a> J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).</li>
<li>Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+axonal+injury+induces+calcium+influx+modulated+by+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).</li>
<li>Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acute+calcium+influx+after+mechanical+stretch+injury+in+vitro+on+the+viability+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons.</a> J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).</li>
<li>Magou, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+high+throughput+axon+injury+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Engineering a high throughput axon injury system.</a> J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).</li>
<li>Morrison, B. 3rd, Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+traumatic+brain+injury+utilising+two-dimensional+stretch+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures.</a> J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).</li>
<li>Cater, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+reproduces+in+vivo+post-traumatic+neurodegeneration%3A+role+of+glutamate+receptors+and+voltage-dependent+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels.</a> J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).</li>
<li>Kang, W. H., Morrison, B. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tolerance+to+mechanical+deformation+developed+from+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech+Model+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures.</a> Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).</li>
<li>Sherman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+Injury+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Neurons+in+a+96+Well+Format%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format.</a> Sci Rep. 6, 34097(2016).</li>
<li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Head+Injury+Mechanisms+Using+Neutral+Density+Technology+and+High-Speed+Biplanar+X-ray%5BTitle%5D)+AND+%22Stapp+Car+Crash+J%22%5BJournal%5D)">Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray.</a> Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).</li>
<li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+response+of+the+human+cadaver+head+to+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Stapp+Car+Crash+J%22%5BJournal%5D)">A study of the response of the human cadaver head to impact.</a> Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).</li>
<li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+room+temperature+bonding+of+thermoplastics+and+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane).</a> Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).</li>
<li>Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22285252">Axonal pathology in traumatic brain injury.</a> Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).</li>
<li>Lacour, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+and+stretchable+micro-electrodes+for+in+vitro+and+in+vivo+neural+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces.</a> Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).</li>
<li>Yu, Z., Morrison, B. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+mild+traumatic+brain+injury+induces+functional+alteration+of+the+developing+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus.</a> J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).</li>
<li>Tcw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Platform+for+Astrocyte+Differentiation+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).</li>
<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Tutarlı bir elde etmek için anahtar, bu modelde biofidelic fenotip tutarlı biofidelic mekanik hakaret uyguluyor. Bu modeli darbe süreleri kısa 10-15 ms, kadavra deneyler12,13göre insan kafa etkileri için darbe süreleri benzer olarak oluşturabilir. Bu hakaret tutarlılığını uç blok ile plaka hizalamasını ve tutarlı yağlama indenters bağlıdır. Uç blok de hizalandığında var. hiçbir eğilim uygulanan gerilim satırlar veya sütunlar (şekil 2C) arasında İnce bir tabaka yağ genellikle daha az sürtünme daha kalın bir tabaka oluşturur ve çünkü onlar silikon faul ve ışık geçirilmesi sırasında mikroskobu engel viskoz Gresler tavsiye edilmez. Gerçek sahne deplasman genlik önemli ölçüde zaman birçok indenters kullanılır ve öngörülen sahne deplasman genlik büyük (> 3 mm) reçete deplasman genlik kısa düşebilir. Ancak, gerçek öteleme büyük genlikleri de öngörülen deplasman daha az olmakla birlikte, yinelenebilir (şekil 2B) kalır. Bu nedenle, büyük, gerçek talebiyle genlikleri güvenilir bir şekilde istediğiniz değeri aşan öngörülen bir değer girerek elde edilebilir. Sadece doğrudan patoloji indükler mekanik hakaret ölçer tepe membran zorlanma için kolayca kaydedilen bir proxy olduğu için deplasman genlik önemli değil. Bu nedenle, membran zorlanma sahne deplasman dan belirlemek için açıklanan yordamı önemlidir. Bu işlem herhangi bir önemli değişiklik plaka ve indenters farklı olması durumunda örneğin arasındaki etkileşimi etkileyen sistem için yapılır yinelenmelidir çapı indenters farklı uç malzemede veya kaplama veya silikon farklı türleri kaynatıp plaka kullanılır. Uç blok yeniden ve sıfır konumu belirleme işlemi her denemenin başlangıcında yinelenmelidir. Germe cihazın bir şematik Resim 1' de gösterilen. Aygıtı yeniden oluşturmak için gerekli CAD modellerini tamamlayıcı malzemesi olarak sağlanır: ' yaralanma aygıt - tam derleme - genel 3D. ADIM '; ilişkili ürün reçetesi sağlanan olarakek tablo 1: özel cihazlar - BOM.xlsx inşa. Ayrıca ek tablo 2 96 de plaka _loader - Bağlantı Diagram.xlsx kablolamasistemleri çeşitli bileşenleri bağlama kablo bağlantıları açıklar, bkz. 'Interconnector_circuit_board.dip' ara bağlantı kabloları bir devre kartı açıklar.
Devre dışı bırakıldı-sahnenin ortasına doğru seyahat ile yaylı olduğundan güç kesilir sonra sahne alanı taşır. Güç sağlandığında, geri besleme döngüsü son bilinen öngörülen pozisyonu ve gerçek pozisyon arasında büyük bir fark algılar. Bu aygıt devre dışı zaman oldu konumuna aniden taşımak için sahne neden olur. Ne zaman sadece bu onun beslemesiz pozisyon onun seyahat üstündeki dinleniyor aygıtı devre dışı bırakmak için dikkat edilmelidir böylece bu ani hareket kodlayıcı, çıktıda hatalara neden olabilir.
İmalat kelepçe plaka alt vücut ve silikon birlikte en iyi bağ sağlar bir şekilde getirmek için tasarlanmıştır. Bu amaçla, orada ek dosyanın içinde sunulan tasarımında üç temel özellikleri nelerdir "basın Die - Genel 3D. ADIM '. İlk olarak, kelepçe plaka vücut sahibi silikon yukarıdan aşağıya doğru paralel değildir. Bu düzgün oluşturulduysa, herhangi bir düzeltme sonra ilk kurulum gerektirir. İkincisi, kelepçe kapatıldığında tamamen katı bir sistem teorik olarak sonsuz sıkma gücü sıfır sıkma gücü bir ani artış deneyim olarak kelepçe Köpük kauçuk katman uyumluluğu altında plaka, az miktarda sağlar. Kol demiri konumunu ve kelepçe set vida ayarlanabilir böylece kelepçe iki kenarı arasındaki uzaklığı ince ayar olabilir.
Her türlü çabayı nokta arkasında parlak, beyaz bir arka plan üzerinde iyi alt soy karakterizasyonu deneyler sırasında sağlamak için yapılmalıdır. Daha iyi kontrast bu Albümdeki kolay yükseklik ve genişlik büyük bir deneme analiz insan bir operatör için sıkıcı olabilir nokta ölçme işlemini otomatikleştirmek için olur. Çünkü duvarlar iyi gölge eğilimi bir 96-şey plaka bir kuyunun yüksek hızlı videografisi sorunlar sunar. Bir kubbe ışık veya kameranın görüş hattı görüntü engel olmadan aydınlatmak diffüz Aksiyel ışık gölgeler veya geleneksel bir ışık kaynağı ile ortaya çıkacak aynasal yansımaları ortadan kaldırır. Parlak aydınlatma görüntüleri ile kısa maruz kalma süresi elde edilebilir için izin verdiği için kullanılabilir en parlak ışık kaynağı kullanılmalıdır. Kısa pozlama süreleri Hareket Bulanıklığı en aza indirmek. Diffüz Aksiyel ışık ışık yayan diyotlar (LED'ler) yükseltme yüksek hızlı video alma sırasında kısa maruz kalma süreleri sağlar. LED'ler diffüz Aksiyel ışık açarak stok LED kaldırma yükseltilebilir, 4 yüksek güç montaj LED LED sahipleri kullanarak, onlara sabit bir geçerli elektrik şebekesine bağlanması ve diffüz Aksiyel ışık (bakınız tablo ile yeniden toplama arka bölmesine diziler Malzemeler Katalog numaraları için). LED'ler yükseltme pasif soğutmalı LED'ler aşırı ısınma riski nedeniyle bir kaç saniye için tutulması cant dezavantajdır. Bu nedenle, farklı bir ışık sonrası blok ve kamera düzeltmesi hizalama için gereklidir.
Membran üzerinde damgalı bir nokta dilatasyon ölçerek membran yük miktarının sunulan yöntem nispeten ham, ama o sağlam bir şekilde birden fazla wells için büyütmek. İyi alt soy tarlada dijital görüntü korelasyon kullanarak daha ayrıntılı olarak karakterize edilebilir. Benekli bir desen üssün kuyunun üzerine püskürtme ve bunda Imaging bu tekniği içerir deformasyon sırasında yüksek hızlı. Ticari yazılım daha sonra benekli desen evrimi takip ederek zorlanma görüntüdeki her noktasında ölçmek için kullanılabilir.
Bu iletişim kuralı bir çok yönlü, klinik, streç yaralanma fenotip hiPSCNs içinde üretir. Hücre ölümü, neurite dejenerasyon ve neurite boncuk Tby iyi belgelenmiş sekel insanlarda ve hayvan15modelleri. Bu modelde başarının anahtarı oluşturmaktan ve bakımını yapmaktan sağlıklı kültürler. Genel olarak, geleneksel sert plakalar ile geliştirilen bir hücre kültür gerilebilir plaka kültür için değerli bir başlangıç noktası protokoldür. Ancak, söz konusu hücre silikon üzerinde farklı şekilde yanıt verebilir olasılığı her zaman dikkate alınmalıdır. Bu özellikle kültür koşulları için çok hassas hiPSCNs doğrudur. Bazı örnekler hücre yoğunluğu ve laminin toplama en iyi duruma getirme (şekil 3, şekil 4) Temsilcisi sonuçları bölümünde sağlanır. Silikon plazma tedavisi ile aktivasyonu hayati önem taşımaktadır. Silikon hidrofobik ve tepkisizdir. doğal haliyle bu laminin veya hücre eki tanıtmak için kullanılan diğer molekülleri bağlamak değil. Plazma tedavi yüzey hidrofilik işler ve reaktif grupları gösterir. Bu değişiklikler için silikon bağlamak ve hücre eki tanıtmak adezyon molekülleri izin. Plazma tedavi etkisi yüzey sıvı içinde sular altında sürece ve aktif yüzey kurutma ilgili yordamlar kısa zamanda gerçekleştirilmesi gereken bu yüzden birkaç dakika içinde kalır unutmamak gerekir. Plazma tedavisinin etkisi yıpranmış Eğer kontrol etmek için basit bir yol yüzeyinde bir damlacık su yerleştirmektir. Bu yayar tedavi plazma silikon üzerinde ise tedavi edilmezse silikon üzerinde yukarı damlacığı boncuk. Biz kullanılan hiPSCNs ile (bkz. Tablo reçetesi) Üretici önerir laminin öncesi kaplama yerine hücre süspansiyon ile ekleme. Bu iletişim kuralı bu yaklaşım başarılı bir şekilde birleştirmiştir. Segmentasyon teorik olarak, açık kaynak yazılım veya genel amaçlı programlama dilleri ile gerçekleştirilebilir iken bu araçları yeterlilik yüksek derecede iyi sonuçlar elde etmek için gereklidir. Neurites sık sık çok ince oldukları için arka plan sinyalini ayırt etmek zordur. Bu nedenle, varsa özel ölçü birimi için segmentasyon ve nöronların, miktar ile yüksek içerik mikroskobu şirketler tarafından dağıtılmış ticari yazılım araçları kullanmanızı tavsiye ederiz. Hatta ticari yazılım ile görsel olarak doğruluğunu doğrulamak için ayrılmasını görüntüleri dışa aktarmak akıllıca olacaktır.
Gerilebilir plakaları ile geleneksel, sert plakalar çalışmaya göre çalışma ile ilgili bazı sınırlamalar vardır. Gerilebilir plakaları hava hedefleri ile normal olarak yansıması. Ancak, görüntüleme daldırma hedefleri ile çok zordur. Objektif petrol silikon zarar verebilir. Buna ek olarak, yukarı doğru hareket ederken amacı silikon membran üzerinde basınç uygular. Bu basınç membran dikey olarak, örnek odak haline getirmek üzere displaces. Şu anda plakaları imalatı kullanılan silikon membran yaklaşık 250 µm kalınlığında vardır. Bu kalınlık çok yüksek güç, daldırma hedefleri odak mesafesini aşıyor. Membranlar mükemmel düz mikroskopi için gerekli düzlemsellik ulaşmak için sıkma önce koymak için özel bakım alınması gerekir. Otofokus sistemleri için sapmaların bir dereceye kadar bitmiş plaka düzlemsellik telafi edebilirsiniz. Düzlük sağlamak için levhadanoluşan üst gümrüklü önce Protokolü'nün gelecek sürümlerinde önceden membran gerginlik. Silikon membran plaka üst14 bağlar yapıştırıcı-Alerjik yordamı geçerli Protokolü'nün önemli bir güç olarak kabul edilir. Düzlük üniform olmayan yapışkan tabaka kalınlığı nedeniyle içinde nörotoksisite yapıştırıcı yanı sıra herhangi bir sapma riskini ortadan kaldırır.
Çoklu elektrot dizilerin onların olgunluk ve işlevselliğini değerlendirmek için sık hiPSCNs ile deneyler kullanılır. Hücre kültür substrat sert olduğu için ne yazık ki, bu sistemler bu model ile uyumlu değildir. Gerilebilir çoklu elektrot dizi oluşturur, bu defa yalnızca tek bir de gösterilmiştir, ancak16,17format mümkündür. Böylece bazı kuyular değil girintilidir ve Şems hizmet verebilir indenters tek tek uç bloğundan kaldırılabilmesi için unutmayın. Uç kaldırma girinti engeller, ancak tamamen beri hala atalet hareket sıvı Wells sahne hareket ediyor ise mekanik yükleme ortadan kaldırmaz. Bu sıvı hareket herhangi bir patolojik etkisini ölçmek için asla sahne hareket tabi vardı plakalar wells için Bu kuyu karşılaştırılarak değer. Ayrıca, blok indenters dizi bisymmetric (önden arkaya simetrik ve yan yana) olmalıdır. Bu önlem, böylece sahne yana doğru eğimli değil ve kendi yatakları bağlamak çubuklar neden plaka eşit girinti sırasında yüklenir sağlar.
Neurotrauma tedavi edici yenilik için birincil zorluklardan biri karmaşıklığı ve heterojen durumu var. Travma Multi-Modal stres her hücre tipi santral sinir sistemi içinde aynı anda uygulanır. Nöronlar güvenilir İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (hiPSCs) oluşturulan ve şimdi ticari satıcıları tarafından yaygın olarak mevcuttur. Yenilik bu alanda hızlı bir şekilde ilerliyor, ve diğer sinir hücre tipleri gibi astrocytes18 ve microglia19 da hiPSCs türetilmiştir. Yakında hücre özerk yanıt travma vitro ve sonra ortak kültür farklı hücre tipleri travmadan sonra nasıl iletişim kuruyorlar anlamak için bu hücre türlerinin her biri izole etmek mümkün olabilir. Bu şekilde, sonuçta iyice bir insan sistemi anlamaya kadar alt klinik meydan yeniden oluşturmak mümkün olabilir. Bu yaklaşım kemirgen modellerde güvenerek geleneksel yaklaşım ayrıdır ve bu ortak, yıkıcı ve zorlu durum için ilk tedavi neden roman anlayışı oluşturmak için bir potansiyele sahiptir.

Tby civarında 52,000 ölümler ve 275,000 olabilecek her yıl1neden bir önemli mortalite ve morbidite Amerika Birleşik Devletleri'nde nedenidir. 30'dan fazla klinik aday therapeutics Tby için tek başarı2olmadan yapılmıştır. Bu üniforma başarısızlık insan özel işlemler sık kullanılan önceden klinik kemirgen modellerinde gözlenen patofizyolojisi insan Tby ayrı öneriyor.
HiPSCNs gelişiyle neurotrauma bir insan vitro modelde eğitim için bir fırsat yarattı. HiPSCN tabanlı modeller ile eleme uyuşturucu kemirgen hücreleri istihdam modelleri klinik başarısı daha akıllı sonuçlar. Ayrıca, hiPSCNs genetik olarak ayırmak ve bireysel insan genetik varyantların etkisi patoloji3çalışma için manipüle edilebilir.
Bu el yazması açıklanan yöntemi hiPSCN tabanlı hastalığı neurotrauma için modelleme benzersiz avantajları getirmek için tasarlanmıştır. Vitro streç yaralanma neurotrauma iyi kurulmuş4,5,6 birincil kemirgen hücreleri ve insan sinir kanser hücre hatları ile modellerdir. Bu modellerin çoğu streç pnömatik silikon membran yükleyerek oluşturmak. Bu yaklaşım tek bir iyi biçimde etkilidir ama çok iyi biçim7toplanmakta zor kanıtlamıştır. Sonuç olarak, bir yüksek üretilen iş ekran streç yaralı nöronlar tedavisi aracıları için olmamıştı.
Bu modelde, membran altında sert bir uç ile girinti nedeniyle uzanır. Bu yaklaşımı art arda klinik patoloji vitro tek iyi sistemleri8,9,10' oluşturmak gösterilmiştir. Son çalışmalarımız bu kolayca bir 96-şey formatını hangi etki alanının baş etkisi olaylar12,13kapalı zamanı darbe süreleri milisaniye11, onlarca sırasını koruyarak ölçekler olduğunu göstermiştir.
Özetle, 96-şey biçimi, hiPSCNs kullanımı ve klinik saat alan hakaret bu vitro yaralanma modeli anahtar avantajları bulunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>.010 "Silikon Levha</td><td>Özel İmalat, Inc</td><td>#70P001200010</td><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) levha</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>#043204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 256665</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td># 12-565-600</td><td>Dipsiz 96 Kuyulu Plaka</td></tr><tr><td>Kim Mendil</td><td>ULINE</td><td>S-8115</td><td></td></tr><tr><td>Plazma Temizleyici</td><td>Harrick Plazma</td> <td>#PDC-001-HC</td><td></td></tr> <tr><td>(3-Aminopropil) trietoksisilan</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># 440140</td><td>APTES</td></tr><tr><td>Parşömen Kağıdı</td><td>Reynolds</td><td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Kubbe Işık</td><td>CCS inc</td><td>LFX2-100SW</td><td></td></tr><tr><td>Dome Işık Güç Kaynağı</td><td>CCS inc</td><td>PSB-1024VB</td><td></td></tr><tr><td>Eksenel Dağınık Aydınlatma Ünitesi&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Siemens</td><td>Nerlite DOAL-75-LED</td><td>Dağınık eksenel ışık</td></tr><tr><td>Yüksek Güçlü LED Dizisi&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CREE</td><td>XLamp CXA2540</td><td>Yüksek Güçlü LED Dizisi&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>LED tutucu</td><td>Molex</td><td>1807200001</td><td>LED Tutucu&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>LED güç kaynağı</td><td>Ortalama Kuyu</td><td>HLG-320H-36B</td><td>Sabit Akım Güç Kaynağı&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>FastCam Viewer yazılımı&nbsp;</td><td>Photron</td><td></td><td>kamera yazılımı</td></tr><tr><td>Fastcam Mini UX50</td><td>Photron</td><td>N/A</td><td>Yüksek Hızlı Kamera</td></tr><tr><td>Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td><td>Nikon</td> <td># 1455</td><td>Yüksek Hızlı Kamera Lensi</td></tr><tr><td>0.1 mg / mL Poli-L-Ornitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4597</td><td></td></tr><tr><td>iCells</td><td>Hücresel Dinamikler Uluslararası</td><td>#NRC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>iCell ortamı</td><td>Hücresel Dinamik Uluslararası</td><td>#NRM-100-121-001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>iCell takviyesi</td><td>Hücresel Dinamik Uluslararası</td><td>#NRM-100-031-001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>#H3570</tr><tr><td>Calcein</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>#C3099</tr><tr><td>Ses Bobini Aktüatörü&nbsp;</td><td>BEI Kimco</td><td>LA43-67-000A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Optik Lineer Kodlayıcı&nbsp;</td><td>Renishaw</td><td>T1031-30A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>servo sürücü</td><td>Copley Kontrolleri</td><td>Xenus XTL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Denetleyici</td><td>Ulusal Aletler</td><td>cRIO 9024 Gerçek Zamanlı PowerPC Kontrol Cihazı&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cRIO şasi</td><td>National Instruments</td><td>cRIO 9113</td><td></td></tr><tr><td>dijital giriş modülü</td><td>National Instruments</td><td>NI 9411</td><td></td></tr><tr><td>veri edinme şasisi</td><td>National Instruments</td><td>NI 9113</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>cihaz kontrol yazılımı</td></tr><tr><td>hiPSCNs</td><td>Cellular Dynamics International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Travmatik beyin hasarı (TBY) Yüksek morbidite ve mortalite ile büyük bir klinik sorun olduğunu. Önceden klinik araştırmalar yılların rağmen hiçbir kanıtlanmış tedaviler Tby için geliştirilmiştir. Bu kağıt varolan önceden klinik modelleri tamamlamak amacıyla önceden klinik neurotrauma araştırma için yeni bir yöntem sunuyor. İnsan patofizyolojisi İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlar (hiPSCNs) aracılığıyla sunar. Yükleme darbe elde süre yükleme süreleri klinik için benzer kapalı kafa etkisi yaralanma. Yüksek işlem hacmi deneyler kolaylaştırır ve pahalı hücreleri ve kültür Kimyasalları verimli kullanır bir 96-şey biçimi kullanır. Silikon membran Nörotoksik iyileşmemiş polimer kaldırmak için ilk tedavi ve gerilebilir 96-şey tabak oluşturmak için ticari 96-şey plaka vücuduna bağlanmış. Özel olarak oluşturulmuş bir cihaz mekanik hücre kültür Wells yaralı equibiaxial mekanik zorlanma inducing bazılarını veya tümünü altında iyi dipleri girinti oluşturmak için kullanılır. Girinti derinlik ve mekanik zorlanma arasındaki ilişkiyi ampirik olarak yüksek hızlı videografisi iyi dipleri, girinti sırasında kullanılarak belirlenir. Hücreleri, hiPSCNs, dahil olmak üzere geleneksel hücre kültür protokolleri değiştirilmiş sürümlerini kullanarak bu silikon membran kültürlü. Hücre kültürleri floresan mikroskobik görüntülerini elde ve yaralanma yaralanma her iyi düzeyini ölçmek için yarı otomatik bir moda sonra analiz. Sunulan model hiPSCNs için en iyi duruma getirilmiş ancak teorik olarak diğer hücre tipleri için uygulanabilir.

Sedye aygıt sahne darbe süresi 10-15 ms kısa olan repeatably (şekil 2A) darbe genlik bağlı olarak hareket yeteneğine sahip. Nabız genlikleri son derece yinelenebilir ancak darbe süresi yaklaşık 1 tarafından değişir ms yinelemeleri arasındaki. Çok sayıda wells yüklenir ve öngörülen genlik yüksek olduğunda reçete darbe genlik gerçek darbe genlik ıraksar (bkz. şekil 2B). Sahne deplasman genliği 3 mm arttıkça, gerçek öteleme genlik giderek reçete deplasman genlik kısa düşüyor (bkz. şekil 2B). Dikkatli yazı blok hizalaması membran zorlanma herhangi bir eğilim satırları veya sütunları (şekil 2C) boyunca ortadan kaldırır. Girintili 52 wells ile sahne deplasman genlik (3,3 mm gerçek öteleme genlik) reçete 3.5 mm tüm iyi konumlar arasında ortalama Lagrangian zorlanma 0.451 yapıldı (Standart sapma anlamına gelir tüm konumlar için 0.051, standart sapmalar ortalaması = tüm konumlar için 0,065, n = 5 ölçümleri iyi ücret =). Bazıları zaten bildirilen11olmasına rağmen bu sonuçlar burada bütünlüğü için sunulmuştur.
Optimal, zarar görmemiş bir kültür 5'ten fazla hücre az varsa kümeleri olacaktır. Neurites tek tek, uzun, ince ve eğri ile gerginlik ya da boncuk (şekil 3A) az veya hiç iz olacak. İdeal koşullarda canlılığı kültürlerin yakından üreticinin bilgi formu (genellikle 60-p) belirtilen canlılığı yaklaşım gerektiğini ve kültürler üzerinde silikon bu geleneksel katı kültür yüzeylerde ( tutulan benzemelidir Şekil 3B). Neurites olabilir veya bir düşük güç parlak alan mikroskobunun görünür olmayabilir. Laminin konsantrasyon ve hücre yoğunluğu kültürler temel ve yaralanma sonra etkiler. Hücre yoğunluğu artan kültürde oluşan kümeleri boyutunu ve sayısını arttı. Laminin konsantrasyon kez artan bu etkisi (şekil 3A) etkisiz. Ancak, laminin artan konsantrasyon çok fazla yaralanma (şekil 4) kültürler duyarlılığını kör. Zarar görmemiş kültürler için en uygun laminin konsantrasyonu 50 µg/mL laminin (şekil 3) yapıldı ama sahte ve streç yaralı nüfus arasında en iyi ayrılık 10 µg/mL laminin (şekil 4) elde edildi. Daha yüksek laminin konsantrasyonları yaralanma kısa sürede noktalarda (şekil 4), aynı zamanda gelişmiş temel hücre canlılığı (örneğin, 7 gün) uzun zaman noktalarda kültürlerin duyarlılık azalır. Özetle, laminin konsantrasyon deneysel her senaryo için en iyi duruma getirmek için faydalıdır.
Membran zorlanma, sonrası yaralanma görüntüleme süresi noktası, laminin konsantrasyon ve hücre yoğunluğu tüm sarf neurite uzunluğu hücre başına son derece istatistiksel olarak anlamlı bir ana etkisi (ANOVA, p &lt; 0.001). Membran üzerinde büyük yük neurite uzunluğu hücre başına etkisi sonrası yaralanma görüntüleme saat noktası ve laminin konsantrasyon ile son derece istatistiksel olarak anlamlı etkileşimler vardı (ANOVA, p &lt; 0.001) ve hücre istatistiksel olarak anlamlı bir etkileşim Yoğunluk (ANOVA, p &lt; 0,05). Benzer şekilde, membran zorlanma, sonrası yaralanma süresi noktası Imaging hücre yoğunluğu ve laminin konsantrasyon tüm sarf hücre canlılığı üzerinde son derece istatistiksel olarak anlamlı bir ana etkisi (ANOVA, p &lt; 0.001). Hücre canlılığı membran strain etkisini sonrası yaralanma görüntüleme süresi noktası son derece istatistiksel olarak anlamlı bir etkileşim vardı (ANOVA, p &lt; 0.001) ve hücre yoğunluğu (ANOVA, p ile istatistiksel olarak anlamlı bir etkileşim &lt; 0,05). Bu sonuçlar her dikkatli bir şekilde optimize edilmelidir böylece zamanlama, hücre yoğunluğu ve laminin konsantrasyon uygulanan hakaret ve deneysel sonuçlar arasındaki ilişki üzerinde önemli bir etkisi uygulamak kanıtlamak.
Düşük hücre canlılığı ve boncuklu neurites, bodur neurite büyüme, birlikte gelen uygun olmayan şekilde ortaya çıkabilir toksik kültür koşulları silikon hazırlanan gösterir. Atlama veya su emmek veya kuru fırın kısaltmak yapabilirsiniz absorbe etanol veya membran, sırasıyla, hangi medya içine diffüz ve hücreleri stres su. İyi yaralı kültürler hücre canlılığı, kısaltılmış veya eksik neurites, boncuklu neurites ve gergin veya gerilmiş görünüyorsun neurites indirimli. Yaralanma iyi dağınık öncesi yaralanma olan hücre kültürleri topaklanma neden olabilir. Büyük kümeleri morfolojik analiz yıkmak. Öyle ki göze çarpan değişiklikler oluşur, ancak hala bazı neurites ile mevcut hücrelerdir morfolojik analiz için yaralanma düzeyini şekilde ayarlanmış.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> Resim 1 : A etiketli yaralanma cihazın şematik. Üstten Görünüm(a), (B) izometrik görünümü, (C) ön görünüm, (D) sağ tarafta görünümü. Ölçek çubuğu ortografik görünümler (A, B ve D) için geçerlidir. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> Resim 2 : Kinematik mekanik hakaret. (A) sahne deplasman geçmişleri öngörülen genlikleri (reçete genlikleri göstergede listelenen) mesafeden 5 bakliyat üzerinde hiçbir kuyu yüklendiğinde. (B) sahne deplasman geçmişleri öngörülen genlikleri (reçete genlikleri göstergede listelenen) mesafeden 10 bakliyat üzerinde 52 wells yüklendiğinde. (C) her iyi sahne deplasman genlik 3,3 mm ile ortalama zorlanma (n = 5 ölçümleri şey, standart hata iyi başına ortalama 0.029 =). C4-F4 ve C9-F9 uzatılmamış denetim kuyuları olduğunu unutmayın. Bu rakam Sherman ve ark. değiştirildi 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> Şekil 3 : Optimizasyon kültür koşulları üzerinde silikon. (A) değişen hücre yoğunluğu ve laminin konsantrasyon hiPSCN kültürler silikon üzerinde etkisi. Hücre yoğunluğu artan ve azalan laminin konsantrasyonu artar clumping. Hücre yoğunluğu ve laminin konsantrasyon mono dağınık kültürler elde etmek için optimize edilmiş olması gerekir. Mono-dağınık kültürler miktar sırasında eserler daha az güvenlik açığından etkilenir. Not dinamik alan neurites görselleştirme optimize etmek için ayarlandı. Sonuç olarak, çok daha parlak soma doymuş. Bu sunuyu kameranın dinamik alanı ile ilgili çok kısık neurites neredeyse görünmez render soma, en iyi duruma getirme alternatif için tercih edilir. Kızıl meydan tarafından vurgulanan koşulu vitro streç yaralanma deneyleri için uygun kabul edildi. (B) optimal koşullar altında kültürler silikon membran üzerinde benzer kültürler geleneksel sert yüzeyler üzerinde görünür. Sol panelde 33,750 hücreler/cm2 laminin (hücre kültür substrat doku kültürü tedavi döngüsel olefin kopolimer 's) bir tabakta klasik, katı 96-şey 3,3 µg/mL ile kültürlü hiPSCNs gösterir. Doğru kapı aynası (a) kırmızı özetlenen paneli üretir. Ölçek çubukları 100 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> Şekil 4 : Yaralanma fenotip ve laminin konsantrasyon olan bağımlılığını. (A)sağlıklı kültür, 10 µg/mL laminin ve 67,500 hücreler/cm2kullanarak. Neurites kadar hiçbir boncuk ile vardır. Kaç ölü çekirdekleri ve kaç kümeleri vardır. (B) kültür aynı kültür koşul % 57 en yüksek gerilme ile yaralı ve 4 h Neurites kısaltılmış sonra yansıma ya da eksik, kullanma ve bazı boncuk (oklarla gösterilen) var. Daha az Calcein AM-pozitif hücreler ve daha fazla Calcein AM-negatif (Yani, ölü) çekirdeği vardır. Yaralanma arasında hayatta kalan hücreleri topaklanma artmıştır. (C) yaralanma sonra 4 h, neurite uzunluğu hücre başına zorlanma laminin konsantre bağlı bir şekilde artan ile azalır. (D) 4 h yaralanma sonra hücre canlılığı zorlanma laminin konsantre bağlı bir şekilde artan ile azalır. (E) yaralanma sonra 24 saat, neurite uzunluğu hücre başına zorlanma laminin konsantre bağlı bir şekilde artan ile azalır. (F) 24 h yaralanma sonra hücre canlılığı zorlanma laminin konsantre bağlı bir şekilde artan ile azalır. (n = 4 bar, hata çubukları ± 1 Standart sapma, ölçek çubukları olduğu gibi başına 100 µm =). Gerilim değerleri üzerinden bir önceki yayın verilerini kullanarak sahne deplasman Sherman ve ark. tarafından çıkarılabilir 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek şekil 1: teknik uç çizim. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 1: özel inşa aygıtları. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 2:96 iyi plaka-yükleyici bağlantı diyagramı kablolama. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 1: bilgisayar destekli tasarım çizimleri yaralanma cihazın. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 2: bilgisayar destekli tasarım çizimleri plaka imalat kelepçe. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 3: 3D damga geometri, bir 3D printerlere harcama maddeler ile kullanıma uygun gösterimini. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 4: SubVI motion_control.vi için bir SubVI olduğunu MuStLiMo_si_initialize.vi için. İletişim kutularındaki girişleri hareket parametrelerini dönüştürür. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 5: birden çok düz çizgi Moves_simplified.vi, motion_control.vi için bir SubVI olduğu için SubVI. İletişim kutularındaki girişleri hareket parametrelerini dönüştürür. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 6: SubVI position_tracker.vi için. Sayaç parça deplasman doğrusal kodlayıcıdan girdi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 7: temel LabVIEW proje. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 8: üst düzey VI bu cihazın taşır. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 9: SubVI motion_control.vi için. Plaka uzanır hızlı deplasman yürütür. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 10: SubVI motion_control.vi için. Sahne hamle yavaş deplasman yürütür. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 11: SubVI motion_control.vi için. Motion_control.vi Denetim Masası'ndaki (genellikle örneklenen) deplasman geçmiş grafiğini çizer. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 12: Top deplasman geçmişini kaydeder düzey VI. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 13: motion_control.vi ile position_tracker.vi arasındaki iletişimi sağlayan içeren Variable2,. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 14: baskılı devre kartı için şematik. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı kod dosyası 15: baskılı devre kartı için düzen. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Burada bir 96-iyi biçimde travma etkisi ilgili bir zaman ölçeği üzerindeki insan vitro manken streç yaralanma için bir yöntem mevcut. Bu mekanik hakaret, kültür ve hücreleri yaralanmasına, görüntü ve yaralanma ölçmek için yüksek içerik analizi miktarının gerilebilir tabak imalatı için yöntemler içerir.

Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Bu modelin genel amacı, birden fazla deneysel koşul altında devam eden yaralanmanın verimli ve eşzamanlı karşılaştırmasını kolaylaştırmak için 96 oyuklu bir formatta klinik olarak anlamlı bir nörotravma fenotipi oluşturmaktır. Bu modelin birincil amacı, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi nöron ile nörotravmada yüksek içerikli fenotipik ilaç keşif ekranlarını mümkün kılmaktır. Bu modelde kullanılan plakalar, endüstri standardı 96 oyuklu plaka geometrisini koruyarak, robotik kollar ve otomatik mikroskoplar gibi mevcut yüksek içerikli tarama makineleriyle uyumluluklarını korur.Başlamak için, yüksek güçte 60 saniye boyunca 200 watt'lık bir plazma temizleyicinin içine dipsiz 96 oyuklu bir plakanın alt tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Daha sonra, plakayı 200 mililitre taze hazırlanmış %1.5 APTES'in içine deiyonize suda, alt tarafı aşağı bakacak şekilde 20 dakika çeker ocakta yerleştirin. İnkübasyona 10 dakika kala, plazma ile işlenmiş bir silikon zarı 7,5 x 11 santimetrelik bir parşömen kağıdı dikdörtgeninin üzerine yerleştirmek için forseps kullanın ve 7,5 x 11,05 santimetrelik bir alüminyum levhayı plaka imalat kelepçesinin alt kısmına hizalayın.Ardından silikon zarı ve parşömen kağıdını alüminyum levha üzerine hizalamak için forseps kullanın. Kaplama süresinin sonunda, dipsiz plakayı APTES banyosundan çıkarın ve fazla çözeltiyi silkeleyin. Dipsiz plakayı, her daldırmada beş saniye boyunca iki ardışık 200 mililitre deiyonize su banyosuna batırın ve fazla suyu silkeleyin.Basınçlı hava ile tamamen kuruduktan sonra, altsız plakayı plaka imalat kelepçesinin üst kısmına yerleştirin ve altsız plakayı ve silikonu birbirine bastırmak için kelepçeyi yavaşça kapatın. Girinti bloğunu hizalamak için, plakayı canlı beslemeli bir kamera altında germe cihazının s'sine sabitlemek için sahne kelepçelerini kullanın ve cihazın üzerine bir kubbe ışığı yerleştirin. Yaralanma cihazına bağlı bilgisayarda cihaz kontrol yazılımını başlatın ve in vitro nörotravma projesini çalıştırmak için Başlat penceresine tıklayın.Proje penceresinden, Hareket Kontrolü ve konum izleyici sanal cihazlarına çift tıklayın. Yaralanma cihazını çevreleyen kafesi kapatın ve aleti çalıştırmak için hareket kontrolü sanal aletindeki oka tıklayın. Sahneyi girintilerle temas edecek şekilde iki milimetre mesafeye indirmek için alt kısma yakın bir yere tıklayın, ardından sanal enstrümanı durdurmak için durdur'a tıklayın.Proje penceresinde Axis One'a sağ tıklayın ve Etkileşimli Test Paneli'ne tıklayın. Adım boyutunu 50 mikrometre olarak ayarlamak için açılan pencerede yer alan Target Position (Hedef Konum) alanına 500 birim girin. Ardından, plaka herhangi bir girintiyle ilk kez temas edene kadar art arda Git'e tıklayın ve kamera tarafından görüntülenen canlı görüntüde temas olup olmadığını kontrol edin.Dikey aşama konumu, etkileşimli test paneli penceresinin sol üst köşesinde bildirilecektir. Her kuyucuk girintilerle temas edene kadar plakayı daha da indirin, kamerayı hareket ettirin ve s'yi hareket ettirin.tage tüm plakayı görüntülemek için gerektiği gibi. Tüm direkler temas halindeyken bildirilen dikey aşama konumuna dikkat edin ve etkileşimli test panelini kapatın.Ardından, hareket kontrolü sanal enstrümanını çalıştırın ve sahne alanı konumundayken sanal enstrümanı durdurmak için durdur düğmesini kullanarak sahneyi yükseltmek için Üst'e tıklayın. Cihazı devre dışı bırakmak için kapıyı açın, ardından köşeyi alçaltmak için ilk temas eden köşedeki seth vidasını gevşetin ve en son temas eden köşeyi kaldırmak için karşı vidayı sıkın. Plaka tüm girintilerle aynı anda temas edene kadar blok indirmeyi, gözlemlemeyi ve ayarlamayı tekrarlayın.Girinti bloğunun dikkatli bir şekilde hizalanması, plakanın tüm oyukları boyunca düzgün bir yaralanma elde etmek için önemlidir. Cihazı tekrar devre dışı bırakmak için kapıyı açın ve bağlama vidalarını girinti bloğundaki deliklerine yerleştirin. Ardından vidaları yerine sıkın ve plaka temas ettiğinde etkileşimli test paneli tarafından bildirilen s'ye dikkat edin.Plakayı uzatmak için, sanal enstrümanı kontrol etme konumundaki Dosya Yolu alanındaki dosya adını benzersiz bir dosya adıyla değiştirin ve Çalıştır okuna tıklayın. Girintinin derinliğini ve süresini ve hareket kontrol paneli sanal enstrümanındaki Yaralanma ve Yaralanma Süresi alanlarını ayarlayın. Plaka sıfır konumundayken, hareket kontrol paneli sanal enstrümanını çalıştırın ve plakayı girintilemek için Yarala'ya tıklayın.Sahneyi yukarı taşımak için Üst'e tıklayın, plaka en üst konumdayken durdur'a tıklayın ve yaralanma cihazını devre dışı bırakmak için kapıyı açın. Ardından, belirtilen maksimum yer değiştirmenin uygulandığını doğrulamak için konum izleyici sanal cihazında sunulan aşamanın yer değiştirme geçmişini inceleyin ve verileri uygun bir elektronik tablo programına aktarın. Silikon zarın gerilmesini değerlendirmek için, plazma işleminden sonra, plakayı yumuşak bir yüzeye yerleştirin ve küçük çıkıntıyı kalıcı bir işaretleyici kalemden gelen mürekkeple bir damga üzerine astarlayın.Damgayı test edilecek ilk kuyucuğa yerleştirin ve iyi bir mürekkep aktarımı sağlamak için hafifçe vurun. Tüm kuyular damgalandığında, yüksek hızlı kamerayı, görüş alanı üçe dört ızgarada 12 girinti içerecek şekilde, lens en küçük numaralı F-stop'a ayarlanmış durumda, yaralanma cihazının üzerindeki bir bom standına yerleştirin. Yer sıfır noktası konumundayken, kamera yazılımındaki kayıt düğmesine bir kez tıklayın, böylece tetiği okuyun ve parlak dağınık eksenel ışığı açın.Ardından plakayı az önce gösterildiği gibi girintileyin ve eksenel ışığı kapatın. Bir hücre kültürüne zarar vermek için, plazma ile muamele edilmiş plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre laminin ile muamele edilmiş, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi nöronlar ekleyin ve hücrelerin plaka tabanına 15 dakika boyunca plaka tabanına yapışmasına izin verin. İki ila üç günlük kültürden sonra, plakayı yaralanma cihazı aşamasına sıkıştırın ve kültürleri ortam havasına maruz bırakmadan plakayı sabitlemek için kapağın konumunu ayarlayın.Ardından, plaka sıfır noktası konumundayken, plakayı az önce gösterildiği gibi girintileyin. Optimal bir yaralanmamış kültür, beşten fazla hücreden oluşan herhangi bir küme varsa çok az olacaktır ve nöritler, çok az boncuklanma ile veya hiç boncuklanma olmadan bireysel, uzun, ince ve kavisli olacaktır. İdeal koşullar altında, kültürlerin canlılığı, üreticinin veri sayfasında belirtilen canlılığa çok yakın olmalı ve silikon üzerindeki kültürler, geleneksel sert kültür substratları üzerinde tutulanlara benzemelidir.Hücre yoğunluğunun arttırılması, kültürde oluşan kümelerin sayısını ve boyutunu arttırırken, laminin konsantrasyonunun arttırılması tipik olarak bu etkiye karşı koyar. % 57'lik bir tepe suş ile yaralanan kültürlerde, yaralanmadan dört saat sonra, nöritler kısalır veya kaybolur ve bazılarında kalan canlı hücreler tarafından gösterilen topaklanma ile boncuklar bulunur. Özellikle, daha yüksek doz laminin tedavileri, daha yüksek doz laminin ile muamele edilen kültürlerde nörit uzunluğundaki ve hücre canlılığındaki artışlarla kanıtlandığı gibi, hücre kültürlerine verilen hasarın şiddetini konsantrasyona bağlı bir şekilde azaltır.Bu prosedürü denerken, teslim sürelerini göz önünde bulundurmak önemlidir. Örneğin, membran detoksifikasyonu üç gün sürer ve üretilen plakalar kullanımdan önce gece boyunca kürlenmelidir. Yaralanma cihazının hareketini sürdürmek için güçlü bir ses bobini içerdiğini ve aktif olduğunda cihazdan her zaman uzak durulması gerektiğini ve cihazı yalnızca sahne hareketinin en üst noktasındayken kapatmanız gerektiğini unutmayın.

method-for-high-speed-stretch-injury-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Pluripotent insan kök hücrelerinin nöronal farklılaşma (hPSCs) için Protokoller genellikle zaman alıcı ve önemli hücre kültürü becerileri gerektirir. Burada, kontrollü bir şekilde insan nöronlarının, basit, hızlı ve verimli üretimi sağlayan bir multititre plaka biçiminde küçük bir moleküldür tabanlı farklılaşma prosedürü adapte var.

Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Video, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) uyarıcı kortikal nöronlar üretmek için bir yöntem göstermektedir. Doksisiklin indüksiyonu üzerine, hiPSC'ler nöral spesifik bir transkripsiyon faktörü olan nörogenin-2'yi aşırı eksprese eder. Bu süreç, belirli ortamlar kullanarak ve astrositlerle birlikte kültürlenerek, hiPSC'lerin sinaptik bağlantıları olan nöronlara farklılaşmasını kolaylaştırır.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mikro Elektrot Dizileri Üzerinde Nöronlara Farklılaşması

Bu video, insan kaynaklı nöronların (iN'ler) ve indüklenmiş oligodendrosit öncü hücrelerinin (iOPC'ler) bir ko-kültürünün kurulmasını göstermektedir. iN'ler bir ko-kültürde iOPC'lerle karıştırılır ve daha sonra her iki iN'nin nöronlara ve iOPC'lerin oligodendrositlere olgunlaşmasını desteklemek için inkübe edilir. Nöronlar, diğer nöronlar ve oligodendrositlerle sinaptik bağlantılar oluştururken, oligodendrositler, nöronların aksonlarının etrafında miyelin kılıfları geliştirir.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Bir Ko-Kültür Yöntemi

Bu video, insan iPSC'lerini motor nöronlara ayırma sürecini göstermektedir. Gerekçe, belirli transkripsiyon faktörlerini ifade etmek için genetik olarak değiştirilmiş iPSC'lerin kullanılmasını içerir. Doksisiklin içeren bir ortamda kültürlendiğinde, bu antibiyotik transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu tetikler, böylece motor nöron progenitörlerine iPSC farklılaşmasını teşvik eder. Nihayetinde, progenitörler, olgun ve işlevsel motor nöronlar elde etmek için nöronal bir ortamda kültürlenir.

Tasarlanmış İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Fonksiyonel Motor Nöronlara Farklılaşması

Bu video, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli nöronlarda (hiPSCN'ler) gerilme yaralanmasını indükleme sürecini göstermektedir. Hücreler, silikon bir zar takılı dipsiz, çok kuyulu bir plakaya alınır. Hücre iskeleti bozulmasını ve hücre zarı hasarını indüklemek için zar üzerine kontrollü mekanik stres uygulanır ve hücrelerde gerilme yaralanması fenotipine neden olur.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda İn Vitro Gerilme Yaralanması Modeli

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC), ilaç ve kimyasal tarama için ve nörotoksisiteyi de içeren toksisite testi için yeni in vitro modellerin geliştirilmesi için güçlü bir araç olarak düşünülür. Burada, hiPSC'lerin nöronlara ve glia'ya diferansiyelleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol anlatılmıştır.

Nörotoksisite Testi İçin İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Nöronlar ve Glia Karışık Kültürlerine Ayrıştırılması Protokolü

Bu protokol, daha önce birden fazla hafta boyunca in vitro nöral atalardan farklılaşmış insan kök hücre türetilmiş nöronlar resucan ve kültür için ayrıntılı bir prosedür açıklar. Prosedür, ışık mikroskobu ve yüksek içerikli tarama ile uyumlu bir formatta nöritler, sinapslar ve geç ifade nöronal belirteçlerin görüntüleme tabanlı tahlilleri kolaylaştırır.

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

Gelecekteki hastalığı modelleme uygulamaları olan kimyasal olarak tanımlanan koşullarda, burada İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre farklılaşma içine her somite türev (myotome, sclerotome, dermatome ve syndetome) için bir iletişim kuralı mevcut ve Ortopedik cerrahi hücre tabanlı terapiler.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

Bu makale, bir lentiviral vektör ve bir 2D biyoreaktör aracılığıyla tek eksenli germe kullanarak Skleraxis'in kombine aşırı ekspresyonu ile iPSC'den türetilmiş mezenkimal stromal hücreler üreterek iTenositler üretme prosedürünü açıklamaktadır.

Kombine skleraksi aşırı ekspresyonu ve 2D tek eksenli gerilim yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı iTenositlerin üretilmesi

Bu protokol, in vitro epilepsiyi modellemek için dorsal-ventral kaynaşmış asembloidleri çoklu elektrot dizileri üzerinde stabil bir şekilde plakalamayı amaçlamaktadır.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Topluluklarını Kullanarak Epilepsiyi Modellemek için Çok Elektrotlu Bir Dizi Platformu

Öğrenin, insan iPS hücre kaynaklı nöronlarda 96-kuyu formatında yüksek hızlı streç yaralanma modeli oluşturmayı. Bu yöntem, nörotravma araştırmalarında yüksek içerikli fenotipik ilke keşfi taramalarını hızlandırır.

Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen

Daha fazla video keşfet