Akut ve kronik Ecotoxicity test turkuaz Killifish Nothobranchius furzeri için iletişim kuralı
24 Nisan 2018
Bu çalışmada, akut, kronik ve multigenerational bir bioassay turkuaz killifish Nothobranchius furzeritek ve kombine stresler etkilerini çalışmaya açıklar. Bu iletişim kuralı hayat-Tarih özellikleri (ölüm, büyüme, verimlilik, ağırlık) ve kritik termal maksimum çalışma için tasarlanmıştır.
Bu deneyin genel amacı, toksik maddelerin turkuaz killifish Nothobranchius furzeri üzerindeki etkilerini incelemektir. Bu yöntem, stresörlerin önemli yaşam öyküsü özellikleri üzerindeki uzun vadeli etkileri, olgunlaşma süresi, büyüme veya doğurganlık gibi ekotoksikoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu deneyin temel avantajı, çok hızlı bir yaşam döngüsüne sahip bir omurgalı kullanmamızdır, bu da zaman ve maliyet açısından verimli deneylerle sonuçlanır.
Bu killifish, stres faktörlerinin uzun vadeli ve çok kuşaklı etkilerinin etkisini incelemek için ideal modellerdir. Sonuç olarak, toksik maddelerin çevresel etkilerinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunacaklardır. Bu yöntem, toksik maddelerin ve sıcaklığın birleşik etkileri hakkında yeni bilgiler sağlayabilse de, UV radyasyonu, gıda yoksunluğu ve PH değişiklikleri gibi diğer stres faktörlerine de uygulanabilir.
Killifish ile çalışmak zordur, çünkü ekotoksikolojide yeni bir model sistemdir ve birçok kirleticiye karşı hassasiyetleri hala bilinmemektedir. Bu deneysel yöntem fikrini, killifish'in olağanüstü kısa ömrünü ve rafta yıllarca saklanabilecek uykuda yumurta üretme kapasitelerini ilk öğrendiğimizde geliştirdik. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, deneyin türü ve bireylerin ele alınması sonuçları değiştirebileceğinden kritik öneme sahiptir.
Başlamak için, D3 aşamasında altın gözlerin varlığıyla tanınabilen gona ışını hayvanat bahçesini veya GRZ yumurtalarını seçin. Ve bunları iki litrelik plastik bir tanka nazikçe aktarmak için yumuşak bir cımbız kullanın. Kuluçka ortamının bir santimetresini 12 santigrat derecede ekleyin ve su sıcaklığının kademeli olarak oda sıcaklığına ayarlanmasına izin verin.
24 saat sonra, yavruları konsantre bir dozda taze yumurtadan çıkmış artemia nauplii ile besleyin ve balık ortamı ekleyerek su derinliğini beş santimetreye çıkarın. Yumurtadan çıktıktan 48 saat sonra, sağlıklı, yüzer larvaları, metin protokolünde açıklandığı gibi maruz kalma ortamı ve toksik madde konsantrasyonları olan ayrı kaplara aktarın. Her sabah ve akşam, balıkları ölüm, stres ve hastalık açısından kontrol edin ve metin protokolüne göre LC50 değerlerini hesaplayın.
Tek tek kapları doğru maruz kalma ortamıyla doldurarak kronik bir maruz kalma denemesi yapın ve kavanozu havalandırmak için bir hava tüpü ekleyin. Deneyin geri kalanı için balıkları kavanozlara aktarın. Kuluçkadan veya DPH'den iki ila 23 gün sonra, balık artemia nauplii'yi günde iki kez ad libitum ile besleyin.
Daha sonra, 37 DPH'ye kadar doğranmış chironomus larvaları ile takviye ettikten sonra, balıkları her gün günde iki kez ad libitum beslemek için donmuş chironomus larvalarını kullanın. Büyümeyi belirlemek için, balıkları rezervuardan ortamla doldurulmuş bir Petri kabına aktararak vücut büyüklüğünü haftalık olarak ölçün. Sabit bir yükseklikte balığın dört ila beş boyut kalibre edilmiş sırt görünümü resimlerini çekin.
Ve bunları dijital olarak analiz etmek için uzamsal bir ölçüm programı kullanın. 15 DPH'den itibaren, olgunlaşmayı belirlemek için erkek balığın renklenmesini görsel olarak inceleyin. Evlilik renklenmesinin ilk belirtileri için yüzgeçleri kontrol edin ve yumruk renginin göründüğü günü erkek olgunlaşma süresi için bir vekil olarak kullanın.
30 DPH'den itibaren, her tedavide olgun erkek ve dişi çift için bir litrelik bir yumurtlama tankı kurarak, erkeğin akvaryumundan maruz kalma ortamını kullanarak doğurganlığı kontrol edin ve yumurtlama substratı ile destekleyin. Hem erkeği hem de dişiyi yumurtlama tankına aktarın. Ve yumurtlama kaplarının etrafındaki insan aktivitesini veya rahatsızlığı en aza indirirken, iki saat boyunca yumurtlamalarına izin verin.
Daha sonra, yumurtlama substratındaki yumurtaları döndürecek olan suyu gereksiz yere karıştırmadan, balıkları nazikçe orijinal barınma kaplarına geri aktarın. Yumurtlama substratını 500 mikrometrelik bir ağ üzerine dökerek yumurtaları süzün. Yumurtaları sayın ve Petri kaplarındaki nemli turba yosununa aktarmak için bir pipet kullanın.
Ölü yumurtaları günlük olarak çıkarın. Bir hafta sonra, Petri kabını kapatmak için sızdırmazlık filmi kullanın. Ve D3 fazına hemen geçiş için 28 santigrat derecede, 14 ila 10 aydınlıktan karanlığa bir döngüyle sıcaklık kontrollü bir inkübatörde saklayın.
Uzun süreli koruma için, yumurtaları 17 santigrat derecede sabit karanlıkta saklayın, bunun üzerine yumurtalar uyku fazına girer ve birkaç yıl boyunca canlı kalır. Uyuyan yumurtalardan balık toplamak için, yumurtaları D3 fazına geçmelerine izin vermek için yaklaşık üç hafta boyunca 28 santigrat dereceye ve 14 ila 10 aydınlıktan koyuya bir döngüye aktarın. Yetişkin balıkların kritik termal maksimumunu veya CT max'ını ölçmek için, dakikada 0,33 santigrat derece sabit bir oranda ısıtılan, sürekli dolaşan bir su banyosu ile başlayın.
Her bir balık için birkaç litrelik akvaryum ekleyin. Su, balığın deneysel yetiştirme sıcaklığına ulaştığında, balığı akvaryuma ekleyerek parkura başlayın. CT max banyosunun bir litrelik akvaryumundaki sıcaklığı her beş dakikada bir izlemek için dijital bir termometre kullanın.
Balık dorsal ventral dik pozisyonunu koruyamadığında veya yoğun bir şekilde seğirmeye başladığında, kritik maksimum sıcaklık olan bir litrelik akvaryumdaki sıcaklığı ölçün. Ardından, balığı geri kazanım için deneysel yuvasına geri aktarın. Bu grafikte gösterildiği gibi, enfurzeri'nin farklı bakır konsantrasyonlarına akut maruziyeti, artan toksik madde konsantrasyonu ile mortalitede bir artışa neden olmuştur.
LC50 değerleri zamanla azalır, yani azalan konsantrasyonlarla, kopyaların %50'si ölmeden önce daha fazla zaman geçer. Kronik maruziyet tahlilinde, su bazlı bakır kullanılarak, test edilen en yüksek konsantrasyonda yetiştirildiğinde üç hafta sonra ölçülen balıkların uzunluğu daha kısadır. Su bazlı klorpirifos veya CPH kullanılarak yapılan bu deneyde, 28 santigrat derecede yükseltildiğinde, balıklar en yüksek CPF konsantrasyonuna maruz kaldıklarında daha az yumurta üretti, ancak 30 santigrat derecede, kontrol balıkları her iki CPF konsantrasyonuna maruz kalan balıklardan daha fazla yumurta üretti, bu da CPF kombinasyonunun ve sıcaklıktaki artışın doğurganlığı her bir stres etkeninden daha fazla etkilediğini gösterir.
Burada bildirilen, 28 ve 30 santigrat derecede CPF'ye maruz kalan enfurzeri erkeklerinde ilk renklenme belirtilerinin ortaya çıktığı ortalama yaştır. Bir litre CPF'ye dört mikrograma maruz kaldıktan sonra, erkek balığın olgunlaşması kontrol balığına göre %18 daha uzun sürdü. 24 veya 28 santigrat derecede yetiştirilen balıkların CT max'ının ölçülmesi ve kirletici 3, 4-DCA'ya maruz kalmanın düzensiz yüzme, artan operküler hareket ve dorsoventral olarak dik pozisyonda kalma yeteneğinin kaybı, balıklar 24 santigrat derecede yükseltildiğinde daha düşük bir sıcaklıkta meydana geldi.
Bir kez ustalaştıktan sonra, doğurganlık üzerindeki etkileri de dahil olmak üzere bu protokol iki ay içinde ölçülebilir. Tüm üreme dönemi ve hatta bir sonraki nesil üzerindeki etkileri ölçmek için protokol uzatılabilir, ancak yine de altı ay içinde gerçekleştirilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, stres faktörlerinin Turkuaz killifish, Nothobranchius furzeri üzerindeki etkilerini incelemek için bir biyolojik analiz sunmaktadır. Çalışma; mortalite, büyüme ve fekondite gibi yaşam öyküsü özelliklerine odaklanarak ekotoksikolojiye dair bilgiler sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Ekotoksikoloji
- Çevre Bilimi
- Balık Biyolojisi
Arka Plan
- Turkuaz killifish, stres faktörlerinin etkilerini incelemek için uygun olan hızlı bir yaşam döngüsüne sahiptir.
- Toksik maddelerin etkilerini anlamak, çevresel risklerin değerlendirilmesi açısından kritik öneme sahiptir.
- Bu çalışma, hem akut hem de kronik stres faktörü etkilerini ele almaktadır.
- Bu araştırmada çok kuşaklı etkiler de göz önünde bulundurulmuştur.
Çalışmanın Amacı
- Toksik maddelerin yaşam geçmişi özellikleri üzerindeki uzun vadeli etkilerini değerlendirmek.
- Birden fazla stresörün birleşik etkilerini belirlemek.
- Çevresel etkilerin sucul yaşam üzerindeki etkilerine dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Nothobranchius furzeri ile akut ve kronik biyolojik deneyler.
- Mortalite, büyüme ve fekonditenin değerlendirilmesi.
- Kritik termal maksimumun değerlendirilmesi.
- Yöntemin UV radyasyonu ve pH değişiklikleri dahil olmak üzere çeşitli stresörlere uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Toksik maddelerin büyüme ve üreme üzerindeki önemli etkilerinin belirlenmesi.
- Türün stres altındaki dayanıklılığına dair öngörüler.
- Killifish'lerin ekotoksikolojide model organizma olarak kullanımını destekleyen veriler.
- Stres faktörlerinin çok nesilli etkilerine dair kanıtlar.
Sonuçlar
- Çalışma, ekotoksikolojik araştırmalar için değerli bir çerçeve sunmaktadır.
- Sonuçlar, kirleticilerin çevresel etkilerinin anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
- Gelecekteki araştırmalar, ek stresörleri incelemek için bu bulgular üzerinden ilerleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Turkuaz killifish modeli, omurgalı yaşam döngüsü özellikleri üzerindeki toksikant etkilerinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak, çevresel sağlık araştırmalarında erken aşama hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Kısa yaşam döngüsü ve uyuyan yumurta depolama özelliği, bileşik güvenlik profillemesinde öngörücü güvenilirlik için maliyet etkin ve ölçeklenebilir taramalara imkan verir. Bu yaklaşım, alt akış geliştirmeleri öncesinde çevresel maruziyetlerle ilişkili biyolojik riskleri belirleyerek portföy önceliklendirmesine yardımcı olur.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Fizyolojik stresin fonksiyonel çıktıları olan olgunlaşma, büyüme ve doğurganlık üzerindeki etkileri nicelendirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Farklı konsantrasyonlar ve zaman dilimleri boyunca mortalite ve subletal sonlanım noktalarının standartlaştırılmış ölçümü yoluyla biyolojik risk azaltmayı sağlar.
- Öngörücü Değer: Kritik yaşam döngüsü süreçlerini bozan bileşiklerin belirlenmesiyle portföy önceliklendirmesini destekleyerek devam veya durdurma kararlarına temel oluşturur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Toksik madde maruziyeti için doz-yanıt ilişkileri kurarak, aşağı akış iş akışları için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Akut, kronik ve çok kuşaklı testler için tanımlanmış protokoller aracılığıyla analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Dormant yumurta alımı yoluyla tarama hazırlığını vurgular, sürekli yerinde kültür gereksinimini ortadan kaldırır ve platformun yeniden kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Toksik maddeler ve sıcaklık gibi kombine stresörlerin fekondite ve maturasyon üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi yoluyla hastalıkla olan ilgiyi tartışır.
- Preklinik Hizalama: Popülasyon düzeyindeki etkileri öngören yaşam öyküsü özelliklerini ölçerek, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği tanımlar.
- Riskten Arındırılmış İlerleme: Stresörlerin gelişim zamanlamasını ve üreme çıktılarını nasıl değiştirdiğini nicelleştirerek mekanistik risk azaltma konusunu ele alır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, stresörlerin korunan biyolojik süreçler üzerindeki etkisine dair omurgalı tabanlı kantitatif sonuçlar sağlayarak, hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Yöntemin; fizyolojik durumun bütünleştirici biyobelirteçleri olan olgunlaşma süresi, büyüme ve fekondite ölçümleri aracılığıyla hipotez testlerini, yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini veya biyolojik risk azaltma çalışmalarını nasıl desteklediğini açıklar.
- Tarama: Kontrollü maruziyet koşulları altında LC50 tayini, boyut kalibrasyonu ve yumurta sayımı yoluyla analiz hazır bulunuşluğunu, tekrarlanabilirliğini veya kantitatif çıktılarını tanımlar.
- Analitik: Fizyolojik eşikler için temsili olan kritik termal maksimum ve renklenme zamanlamısı da dahil olmak üzere, ekiplerin koşulları karşılaştırmasına yardımcı olan ölçümleri, okumaları veya istatistiksel çıktıları vurgular.
- Translasyonel Araştırma: Yaşam öyküsü bozulmalarını popülasyon uygunluğu ve çok kuşaklı sonuçlarla ilişkilendirerek yöntemi preklinik sürekliliğe veya biyobelirteç uyumuna bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Dormant yumurta bankacılığı ve stresörler arası protokol uyarlanabilirliği sayesinde yöntemi, tek seferlik bir teknikten ziyade yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçevelendirir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Omurgalı stres tepkisinde öngörücü güven, hedef doğrulaması ve mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış maruziyet ortamları, besleme rejimleri ve çevresel kontroller aracılığıyla standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Keşif aşamasının erken safhalarında tehlikelerin belirlenmesiyle daha iyi devam/durdur kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç aşama biyolojik riskleri.
- Portföy Etkisi: Mortalite, büyüme inhibisyonu ve fekondite azalması için nicel eşiklere dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Omurgalı hayvan bakımı, ekotoksikoloji ve yaşam döngüsü özelliği ölçümü konularında gerekli bilimsel uzmanlık.
- Enstrümantasyon ve analitik altyapı ihtiyaçları arasında sıcaklık kontrollü inkübatörler, boyut kalibrasyonu için görüntüleme sistemleri ve CT max analizleri için su banyoları yer almaktadır.
- Besleme programları, maruziyet ortamı hazırlığı ile olgunlaşma ve fekondite son noktalarının kör değerlendirilmesi için ekipler arası standardizasyon gereksinimleri.
- Elleçleme hassasiyeti, su kalitesi ve termal geçmiş dahil olmak üzere model sistemler arasındaki adaptasyon hususları.
- Kaynak materyallerle desteklenen pratik sınırlamalar: yeni bir model sistemle çalışmadaki zorluklar, birçok kirleticiye karşı bilinmeyen hassasiyet ve bireysel elleçleme veya çevresel dalgalanmaların neden olduğu değişkenlik.
