CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Bu elektroporasyona dayalı in vivo gen transferi yaklaşımının genel amacı, CRISPR aracılı fonksiyon kaybı analizlerini kullanarak serebellar granül hücrelerinin farklılaşmasında ilgilenilen genlerin rollerini değerlendirmektir. Bu yöntem, normal serebellar gelişim ve beyin tümörü oluşumları için önemli olan moleküllerin tanımlanması gibi gelişimsel sinirbilim ve nöro-onkolojilerdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Rahim içi elektroporasyon prosedürü, Profesör Peter Lichter'in laboratuvarından bir doktora sonrası olan Dr.Lena Herbst tarafından gösterilecek ve daha sonra aşağıdaki immünohistokimya, Dr.Haikun Di'nin laboratuvarından bir doktora sonrası olan Dr.Weijun Feng tarafından gerçekleştirilecektir.

Bu yöntemin temel avantajı, nakavt hayvanların kombinasyonunun üretilmesi yerine, CRISPR-cas9 teknolojilerini kullanarak serebellar hücrelerde ilgilenilen genleri fizibil bir şekilde devre dışı bırakmaya çalışmaktır. Bu yöntem, normal serebellar gelişim sırasında gen fonksiyonları hakkında fikir verebilse de, diğer fiziksel beyin bölgelerinin gelişimi ve beyin tümörü modellemesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bir borosilikat cam kılcal damarı bir mikropipet çekiciye yükleyerek ve ince bir uç oluşturmak için çekerek başlayın.

Enjeksiyon sırasında daha iyi görselleştirme için kılcal ucu siyah mürekkeple etiketleyin ve camın üzerine bir ölçek çizin. Stereomikroskop altında çalışarak, ucu yaklaşık altı milimetre uzunluğa kadar kesmek ve keskin, tek taraflı eğimli bir kenar oluşturmak için bir cetvel ve keskin iğne cımbızı kullanın. Çözeltiden boya parçacıklarını çıkarmak için sıfır noktası, 22 mikronluk bir filtreden %1 hızlı bir yeşil stok çözeltisini filtreleyin.

Tek kılavuzlu RNA plazmitlerini, her plazmit için mililitre başına en az bir mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar lusiferaz raportör plazmidi ile eşit parçalar halinde karıştırın. Plazmid solüsyonunu %0,5'lik son konsantrasyonda hızlı yeşil ile renklendirinHamile bir CD-1 fareyi izofluran ile uyuşturduktan sonra, fareyi bir ısıtma yastığının üzerine sırt üstü koyun ve analjezik uygulayın. Ameliyat sırasında göz kuruluğunu önlemek için göz merhemi sürün.

Lensi bantla sabitleyin ve karnı bir dezenfektanla sterilize edin. Fareyi gazlı bezle örtün ve yalnızca cerrahi alanı açıkta bırakın. Yaklaşık iki santimetre uzunluğunda bir cilt kesisi yaptıktan sonra, linea alba'yı bulun ve peritondan biraz daha küçük ikinci bir kesi yapmak için künt uçlu doku makası kullanın.

Açılan karın boşluğunu önceden ısıtılmış steril PBS ile nemlendirin. Daha sonra, uterus boynuzlarını karın boşluğundan dikkatlice çıkarmak için halka forseps kullanın. İki komşu embriyonun yumurta sarısı keseleri arasındaki boşlukta uterus duvarını kavrayın ve hafifçe çekin.

Embriyoyu kesiden çekerken üzerine herhangi bir baskı uygulamaktan kaçının. Rahim boynuzları çıkarıldıktan sonra, hazırlanan cam kılcal damar ile yaklaşık 10 ila 15 mikrolitre renkli plazmit solüsyonu aspire edin. Bu işlem sırasında herhangi bir hava kabarcığından kaçının.

Embriyoyu halka forseps ile nazikçe tutun ve boyun bölgesini bulun. Cam kılcal damarın ucuyla dorsal arka beyne yavaşça nüfuz edin ve dördüncü ventriküle doğru hareket edin. Plazmit karışımının yaklaşık bir mikrolitresini enjekte edin.

Boyanmış DNA'nın beyinden sızmadığını ve elmas şeklinde bir yapı olarak görünür olduğunu doğrulayın. Burada, dördüncü ventrikülün tüm bölgesini plazmit çözeltisi ile doldurmak, DNA'yı serebellar primordiumun distal kısmına da iletmek çok önemlidir. Aynı zamanda, bu işlem sırasında herhangi bir kanamaya neden olmadığınızdan emin olun.

Beş milimetre çapında elektrot plakaları ile donatılmış platin cımbızı, negatif kutup kulağı kaplayacak ve pozitif kutup rahim duvarı üzerindeki serebellar primordiumda konumlandırılacak şekilde embriyonun başının üzerine yanal olarak yerleştirin ve elektrikli kare darbeler uygulayın. Tüm embriyolar elektroporasyona tabi tutulduğunda, uterus boynuzlarını dikkatlice karın boşluğuna geri yerleştirin ve steril PBS ile doldurun. Rahim boynuzlarının doğal bir pozisyona kaymasına izin verin.

Anesteziyi kapatın ve iyileşmesi için hayvanı göbeği aşağı gelecek şekilde yeni bir kafese koyun. Kriyoseksiyondan önce, serebellayı gece boyunca dört santigrat derecede beyin başına PBS'de beş mililitre% 4 PFA ile sabitleyin. Ertesi gün, sabit serebellayı beyin başına PBS'de on mililitre% 30 sükroza aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, doku tüpün dibine battıktan sonra, beyinleri sakarozdan çıkarın ve kalan sakaroz solüsyonunu bir parça selüloz filtre kağıdı ile emdirin. Daha sonra, her bir beyinciği tek kullanımlık bir plastik kalıba optimum kesme sıcaklığı bileşiğine daldırın ve kuru buz üzerinde dondurun. Kriyojenik bloğu bir kriyostat kullanarak 10 mikron kalınlığında bölümler halinde kesin ve kullanana kadar bölümleri eksi 80 santigrat derecede tutun.

İmmün boyamaya devam etmeye hazır olduğunuzda, slaytları önce oda sıcaklığında 30 dakika kurutun ve ardından PBS'de her seferinde 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. Bölümleri bir sıvı engelleyici kalemle daire içine alın ve bölümleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici solüsyonda inkübe edin. Bloke edici çözeltideki ilgili moleküllere karşı birincil antikorlar ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Slaytları PBS içeren %0,1 Triton ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra, DAPI içeren bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş florofor konjuge ikincil antikoru ekleyin ve bölümleri karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Slaytları PBS-T'de her seferinde 10 dakika boyunca üç kez yıkayın, ardından slaytları monte edin ve görüntülemeye kadar dört santigrat derecede tutun.

streptococcus pyogenes cas9'u stabil bir şekilde eksprese eden hek293T hücreleri, plazmitleri eksprese eden ve hedefleyen sgRNA ile transfekte edildi. Canlı hücrelerde GFP ekspresyonu, transfeksiyondan 48 saat sonra bir floresan hücre görüntüleyici kullanılarak izlendi. Bu görüntü, GFP ekspresyonuna dayalı olarak etkilenen bir sgRNA dizisini göstermektedir.

Bu görüntü, etkili olmayan bir sgRNA dizisinden kaynaklanan GFP ekspresyonunun eksikliğini göstermektedir. Bu görüntüler, E13.5'te elektroporasyona tabi tutulan, floxed stop kaseti ve aşağı akış bisiztronik cas9 ve EGFP dizilerine sahip bir p7-rosa26-LSL-cas9 knock-in fareden serebelladaki GFP, Ki67 ve p27'nin immün boyamasını göstermektedir. Bölüm, DAPI ile karşı boyanmıştır.

Ki67 ile işaretlenmiş dış granül hücre katmanındaki GFP eksprese eden hücrelere dikkat edin. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu ameliyat fare başına 30 dakikadan daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, embriyoyu çok dikkatli bir şekilde tutmayı, her zaman keskin uçlu kılcal damarlar kullanmayı ve elektrik darbelerinin dördüncü ventrikülün çatısına iletilmesini sağlamak için elektrotları kesin açıda konumlandırmayı unutmamak önemlidir.

Geliştirilmesinden sonra bu teknik, tıp bilimleri alanındaki araştırmacıların, fare beyinciğindeki beyin tümörleri de dahil olmak üzere nörolojik bozuklukların nedensel faktörlerini keşfetmelerinin yolunu açtı.