Name: CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Öğrenin, CRISPR-Cas9 ve rahim içi elektroporasyon kullanarak serebellar granül hücrelerinde gen fonksiyonlarını nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, gelişimsel nörobilim ve beyin tümörü araştırmalarında hızlı sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laura Sieber, Anna Neuerburg, yasin Harim ve Petra Schroeter teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz Ayrıca Drs. K. Reifenberg, K. Dell ve P. Prückl DKFZ, hayvan deneyleri için yararlı yardım için teşekkür ederiz; Imaging Core tesislerinde DKFZ ve Carl Zeiss görüntüleme Merkezi DKFZ confocal mikroskobu görüntüleme için. Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (dk) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri hayvan refahı düzenlemelere göre yapılmıştır ve sorumlu yetkilileri tarafından onaylanmıştır (Regierungspräsidium Karlsruhe, onay numaraları: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 ve G133/14).
1. pU6-sgRNA-Cbh-Cre plazmid oluşturmak
<ol><li>Gen--ilgi çekici bir daha önce yayımlanmış Protokolü14göre hedefe sgRNA tasarım. Not: Bu deneyde iki sgRNAs fare Top2b gen ve bir sigara hedefli kontrol sgRNA (Tablo 1) hedeflemek için tasarlanmıştır. CRISPR teknolojisini kullanarak nakavt gene(s) için sgRNAs 5' bölgesinin kodlama dizisi ya da protein temel işlev etki alanı hedef için tasarlanmış olması gerekir. Bir uygun başlangıç noktası GeCKO v2 fare nakavt havuzu Kütüphane15 Zhang laboratuvar gibi kamuya önceden tasarlanmış sgRNA dizileri test etmektir. Alternatif olarak, sgRNAs aşağıdaki Web sitesi gibi kamu mevcut yazılım kullanarak dizayn edilebilir: crispr.mit.edu.</li>
	<li>SgRNAs pU6-sgRNA-Cbh-Cre vektör kopyalayın. Not: Bu çalışmada kullanılan pU6-sgRNA-Cbh-Cre vektör12 SpCas9 kodlama dizisi ile Cre recombinase yanında eski yerine koymak orijinal pX330 plazmid16 türetilmiştir.<ol>
<li>İki DNA oligos aşağıdaki gibi sentez. Anlamı: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisens: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'. Not: 20 N stand sgRNA sırası için yukarıda gösterdi.</li>
		<li>PU6-sgRNA-Cbh-Cre BbsI ile aşağıdaki reaktifler kullanarak 37 ° C'de 30 dk için sindirmek, sindirilmiş örnek % 1'özel jel için yük ve bir jel-ekstraksiyon kiti kullanarak onları arındırmak. 3 µg plazmid kullanın; 3 µL Bbsben; 1 µL FastAP; Sindirim arabellek x 5 µL 10; Toplam hacim için 50 µL getirmek için GKD2O ekleyin.</li>
		<li>Fazdan ve her çifti aşağıdaki reaktifleri (10 µL toplam hacim) kullanarak sgRNA oligos tavlamak: 1 µL özelleştirilmiş anlamda oligo (100 mM); 1 µL özelleştirilmiş antianlamlı oligo (100 mM); T4 ligasyonu arabellek x 1 µL 10; 6.5 µL GKD2O; 0.5 ΜL T4 PNK. Bir termo-cycler 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya ve 95 ° C ve 25 ° C 5 ° C/dk aşağı rampa 5 dak.</li>
		<li>Aşağıdaki ligasyonu tepki kadar ayarlayın ve oda sıcaklığında (10 µL toplam hacim) 10 min için kuluçkaya: plazmid sindirilmiş X µL Bbs(50 ng); 1 µL fosforile ve tavlanmış, oligo Dubleks (1: 200 seyreltme); Tüp ligasyonu arabellek x 5 µL 2; x µl GKD2O; 1 µL hızlı ligaz.</li>
		<li>Tüp ligasyonu ürünün 2 µL kimyasal olarak yetkili DH5α Escherichia coli hücreleri 50 µL ekleyin. Kuluçka buz üzerinde 30 dk sonra ısı şok 90 için örnek s 42 ° C'de ve buz üzerinde 2 min için kuluçkaya. LB orta 100 µL ekleyin ve 100 µg/mL ampisilin içeren bir LB tabağa plakası. Not: PU6-sgRNA-Cbh-Cre plazmid içine sgRNA sıra entegrasyonu pX330 plazmid14için klonlama adımları göre gerçekleştirilir.</li>
		<li>Her 2 ml LB orta 37 ° c 6 h, en az iki kolonileri aşılamak ve bir mini hazırlık DNA izolasyon bir seti kullanarak gerçekleştirebilirsiniz.</li>
		<li>Sanger hU6 ileri astar kullanarak mini hazırlık DNA dizisi ve koloniler sgRNAs doğru yerleştirilmesi ile 1.2.1 adımda gösterilen sıra ile hizalayarak tanımlar. Astar sıra Tablo 1' de gösterilen. Bu çalışmada kullanılan plazmid olarak pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre ve pU6-sgControl-Cbh-Cre seçilmiştir.</li>
		<li>Doğru tespit kolonileri aşılamak ve rahim içinde çoğalmasıyla bir kit, Örneğin, QIAGEN üzerinden kullanarak için endotoksin-Alerjik plazmid DNA arındırmak. DNA endotoksin-Alerjik TE-GKD2içinde O 1:10 (% 10 TE arabellek) seyreltilmiş arabellek ile elute. Plazmid DNA konsantrasyon 2 mg/mL yüksek olması gerekir. Not: normal bir maxi-hazırlık seti DNA hazırlık için kullanmayın. Plazmid-çözümleri için kısa süreli kullanım (4 hafta) veya aliquot 4 ° C'de yaklaşık 25 µL uygun bir hacmi depolamak ve uzun süreli depolama için-20 ° C'de tutun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. EGxxFP plazmid sistemi kullanarak sgRNAs etkinliğini test
Not: SgRNAs verimliliğini normalde Surveyor veya T7E1 tarafından test edilmiştir (T7 endonükleaz ben) deneyleri. Bu protokol için kolay ve verimli alternatif bir yaklaşım kullanılır. Bu yaklaşımın anahtar sitesi17hedefleme sgRNA içeren bir DNA dizisi tarafından ayrılmış örtüşen EGFP parçaları içeren pCAG-EGxxFP plazmid kullanmaktır. PCAG-EGxxFP ile birlikte sgRNA ve Cas9 transfected hücrelerdeki ifadesi, hangi EGFP ifade reconstitutes Çift Kişilik strand Cas9-aracılı ara (DSB) hedef ile endojen Homoloji-bağımlı mekanizmaları tarafından onarıldı kaset.
<ol><li>Astar sgRNA dizileri hedefleme merkezli genomik bölge yükseltmek için tasarım. PCR amplicon yaklaşık 500 olduğunu bp. Bu deneyde, bir DNA derleme PCR güçlendirilmiş bir parçası pCAG-EGxxFP plazmid clone uygulandı. Not: Alternatif olarak, 5' sonu PCR astar için uygun kısıtlama siteleri eklenebilir. Kullanılabilir kısıtlama pCAG-EGxxFP vektör BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI ve EcoRV sitelerdir.</li>
	<li>Genomik DNA PCR parametreleri aşağıdaki ve formu kullanarak tasarlanmış astar ile yükseltmek. Örnek yük (19,7 µL H2O; 0.3 10 µL ng/µL fare genomik DNA; 2.5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-F; 2.5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-R; 25 µL PCR ana mix X 2; 50 µL toplam hacim) % 1'özel üzerine jel ve jel bir jel-ekstraksiyon kiti kullanarak PCR parçaları arındırmak. Aşağıdaki reaksiyon koşulları: 95 ° C 3 dakikadır kullanın; o zaman 35 x devredir 98 ° c 20 s, 60 ° C 15 s, 72 ° C 20 s ve 72 ° C için 1 dk; 4 ° C, süresiz olarak. Not: Bu deneyde, bir bölgede Top2b exon 1 güçlendirilmiş; Tablo 1' de astar dizileri bulamadı.</li>
	<li>BamHI ve örnek % 1'özel üzerine yük EcoRI sonra 37 ° c 2 h enzimleri ile pCAG-EGxxFP vektör jel ve jel bir jel-ekstraksiyon kiti kullanarak vektör omurga arındırmak Digest. Aşağıdaki reaktifleri (50 µL toplam hacim) kullanın: X µL plazmid (3 µg); 2 µL BamHI; 2 µL EcoRI; 5 µL 10 x arabellek; x µl GKD2O.</li>
	<li>Üreticinin yönergelerine göre DNA derleme tepki18 ayarlayın ve DH5α yetkili E. colidönüşümü.</li>
	<li>İki kolonileri aşılamak, içinde her 2 mL LB orta 37 ° c 6 h, en az bir kit, Örneğin, QIAGEN, üzerinden kullanarak bir mini hazırlık DNA yalıtım yapmak ve doğru ekleme (bundan sonra pCAG-örneğin-Top2b-FP anılacaktır) ile kolonileri belirlemek Sanger kullanarak EGxxFP-Top2b-F astar ile sıralama.</li>
	<li>HEK293T hücre transfect.<ol>
<li>Tohum HEK293T hücrelere bir 24-şey plaka transfection önce 24 saat. Not: Hücreleri 37 ° C hücre kuluçka makinesine ile % 5 CO2, DMEM içinde glutamine ek %10 FBS ve % 1'i içeren kültürlü penisilin/streptomisin. Hücreleri transfection gününde % 60 birleşmesi olduğundan emin olun. Bu deneyde, pU6-sgRNA-Cbh-Cre sınamak için stabil SpCas9 ifade kendi kendine yapılan HEK293T hücreleri kullanılır. Ancak, wildtype HEK293T hücreleri bir SpCas9 ifade vektör varsa kullanılabilir.</li>
		<li>Polyethylenimine (PEI) reaktif kullanarak HEK293T hücre transfect. 120 ng/iyi pCAG-örneğin-Top2b-FP plazmid12 hücrelerle ve 120 ng/iyi pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre veya pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre bir 24-şey plaka transfect. Plazmid DNA'lar mix ve glutamin ile unsupplemented DMEM orta 80 µL PEI reaktif 1.8 µL ek ve oda sıcaklığında 15 dakika sonra vortexing kuluçkaya.</li>
		<li>6 h transfection sonra orta kaldırın ve taze orta ile değiştirin.</li>
		<li>20 x büyütme oranında bir floresan mikroskop kullanarak transfection sonra canlı GFP+ hücreleri 48 h varlığı izlemek. Not: SgRNA hedefleme verimliliğini GFP+ hücre sayısını gösterir. Etkin ve etkili-sgRNAs sonuçlarını (sgTop2b-1 ve sgTop2b-2, sırasıyla) Şekil 2Agösterilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. rahim içinde Elektroporasyon gerçekleştirmek
<ol><li>6-8-hafta-yaşlı fareler doğurmak ve araçları rahim içinde adım için hazır olun. Erkek homozigoz Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP çapraz kadın CD-1 fareler ile fareler. (E0.5) CD-1 fareler vajinal fişi günden itibaren gebelik algılanan süresi. Embriyo electroporated gün E13.5 vardır.<ol>
<li>Borosilikat cam kılcal çekin (iç çapı: 0,6-0,8 mm) ile bir micropipette çektirmenin. Aşağıdaki ayarları kullanın: P = 500, ısı 560, çekme = 150, Vel = = 75, saat = 250. Kapiller ucu enjeksiyon sırasında daha iyi görselleştirme için siyah mürekkep ile etiketleyin. Kapiller konik bir cetvel kullanarak bir stereomicroscope altında döşeme ve iğne cımbız keskin ve yaklaşık 6 mm uzunluğunda ucunda trim.</li>
		<li>Deneme tekrarlanabilir tutmak için kılcal birlik korumak. Tek taraflı eğimli kenarı bölünmesi sırasında oluşturun. Ucunu kolay nüfuz rahim duvarı ve embriyo doku hasarı önlemek için mümkün olduğunca gibi keskin olmalıdır. Not: Alternatif olarak, bir 35 ° açı19ayarlamak için bir mikro öğütücü kullanın. Kılcal 10 cm Petri kabına patojen-Alerjik koşullar altında oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.</li>
		<li>Otoklav cerrahi aletler.</li>
		<li>SgRNA-plazmid eşit parçaya pT2K-IRES-Luc için en az 1 µg/µL her plazmid ve renk için son bir konsantrasyon ile plazmid çözüm hızlı yeşil (son konsantrasyonu % 0.05) ile karıştırın. Distile su endotoksin-alerjik ve filtre ile hisse senedi çözüm %1 hızlı yeşil boya parçacıkları çözümden kaldırmak için 0,22 µm filtresi ile hazır olun. Not: Co transfection pT2K IRES-Luc isteğe bağlıdır ancak bioluminescence Imaging'i kullanma doğumdan sonra uygun electroporated hayvanların tanımlanması için sağlar. Adım 3.5 bakınız. Plazmid-mix yeterli miktarda ameliyat olmak için hamile fareler toplam sayısı için hazırlayın. Hakkında kullanın fare 15-20 µL mix (~ 12 embriyo). Hemen ameliyat ile devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Fareler ameliyat için hazırlayın.
	<ol>
<li>Hamile CD-1 fareler isoflurane ile anestezi. Anestezi kutusundaki metinle 3-4 vol % isoflurane teşvik (oksijen akış hızı: 1, 5 L/dak) ve burun konisi ile ameliyat sırasında 2 vol-% ile sürdürmek. Not: Tam cerrahi uzun almamalıdır 30 dk. azaltmak sayısından enjekte ve electroporated embriyo, gerekirse. Steril eldiven ameliyat için kullanın.</li>
		<li>Sırtında bir Isıtma yastık üzerinde fareyi getirin ve anestezi ayarlayın.</li>
		<li>Analjezik enjekte (Metamizol, 800 mg/kg vücut ağırlığı, subkutan (SC), 24 h depo). Not: Diğer yetkili analjezikler Metamizol daha kullanabilir.</li>
		<li>Ameliyat sırasında göz kuruluğu önlemek için göz merhem uygulamak.</li>
		<li>Bacaklarda bant ile düzeltmek ve karın bir dezenfektan ile sterilize. Fare sadece cerrahi alan maruz bırakarak gazlı bez ile kapak. % 70 etanol cerrahi alan ve gazlı bez yayıldı.</li>
		<li>Uzunluğu yaklaşık 2 cm cilt kesi yapmak ve boşluğu yavaşça skalpel makasla genişletmek. Bulun linea alba ve doku kullanarak periton ile biraz daha küçük bir ikinci giriş makas künt ucu ile yapmak.</li>
		<li>Açılan karın boşluğu önceden ısıtılmış steril 1 ile nemlendirin PBS x.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde rahim boynuzları halka forseps kullanarak Karın boşluğundan ayıklayın. İki komşu embriyo sarısı sacs arasındaki boşluğu sadece rahim duvarı tarafından kapma yavaşça çekin. Embriyo üzerinde herhangi bir baskı belgili tanımlık kesme kablolarıylaberaber kaçının. Belgili tanımlık kesme gerekirse büyütmek ve uterin arter yoluyla kan akışını sıkıştırmak değil iken karın üzerine rahim boynuzları konumlandırmak için ekstra dikkat. Not: bazı durumlarda, bu bir rahim boynuz teker teker ayıklamak ve ikinci rahim boynuz işlemine devam etmeden önce değiştirmek için tavsiye edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Enjeksiyon ve plazmid DNA'lar Elektroporasyon
	<ol>
<li>Yaklaşık 15 µL renkli plazmid-çözüm hazır cam kapiller ile Aspire edin. Bu işlem sırasında herhangi bir hava kabarcıkları kaçının. Not: Eğer onun konsantrasyonu yüksek plazmid çözüm ucu kolayca yapışmasına neden olabilir. Kılcal bazı DNA enjeksiyon önce serbest bırakarak sınayın.</li>
		<li>Yavaşça embriyo halka forseps ile tutun ve boyun bölgesi bulun. Not: embriyo enjekte etmek zor durumda ise, o atlayın ve sonraki embriyo için gidin. Artan embriyo yeniden konumlandırma onlara zarar şansını artırabilir.</li>
		<li>Yavaş yavaş dorsal arka beyin delici tarafından önceden hazırlanmış cam kapiller ucu ile dördüncü ventrikül işlemek ve daha sonra yaklaşık 1 µL plazmid karışımı enjekte. Boyalı DNA beyinden sızdırılmış değil ve bir elmas şeklindeki yapısı görülebilir emin olun. Not: isteğe bağlı olarak, 2.5-fold Büyüteç gözlük dördüncü ventrikül daha iyi görselleştirme için kullanın ve çevreleyen kan damarları. Sonra hemen enjeksiyon difüzyon plazmid çözümünün diğer ventrikül önlemek için elektrik darbeleri teslim.</li>
		<li>Elektrik kare bakliyat geçerlidir (5 Bakliyat, 32 mV, 50 ms-on, 950 ms-off) forseps benzeri platin cımbız (bkz: Malzemeler tablo) ile. Elektrotlar yanal kulak ve serebellar primordium rahim duvarı konumlandırılmış pozitif Kutbu kapsayan negatif kutup ile yer. 5 mm çapında elektrot plakaları E13.5 embriyo etkili Elektroporasyon için kullanın. Not: embriyo dam başına toplam sayısının 2/3'den azrd manipüle ederek kurtulma ve yavrularını artırın. Embriyo çok yakın rahim için kaçının. Manipüle, Doğum sırasında komplikasyonlara neden ve tüm çöp tehlikeye olabilir. Elektrotlar çok Eğer embriyo'nın kalbine yakın bu kalp krizine neden olabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Post-Elektroporasyon ve ameliyat sonrası bakım
	<ol>
<li>Dikkatli bir şekilde rahim boynuzları karın boşluğuna yerleştirin ve dolgu ile önceden steril 1 ısındı PBS x. Doğal bir pozisyon içine rahim boynuzları slayt izin.</li>
		<li>Ayrıca basit sürekli dikiş ile cilt Karın zarını kapatın. Not: rahim duvarı delip Karın zarını dikiş zaman değil ekstra dikkat.</li>
		<li>Anestezi kapatma ve hayvanın karın aşağı yeni bir kafesin içine yerleştirin.</li>
		<li>Hayvan uyanık faz ve 24 h sırasında tekrar ameliyattan sonra izlemek. Isıtma lambası altında belgili tanımlık kafes, titreyen içinde bir 15 dk zaman dilimi düzelmezse ve hayvan tımar başlamıyor koyun.</li>
		<li>Başarılı Elektroporasyon luciferase görüntüleme tarafından onaylayın.<ol>
<li>İşletilen barajlar anda (E19.5) embriyo bırakın emin olun. Not: Doğum tarihi için ertesi gün muhtemelen işlemi nedeniyle gecikebilir.</li>
			<li>Electroporated yavruları (P5-P7) % 2.5 isoflurane ile anestezi ve (mayi (IP)) D-biyoluminesans (3 mg/kg vücut ağırlığı) ile 5 dk önce görüntüleme enjekte.</li>
			<li>Luciferase sinyalleri bioluminescence Imager kullanarak electroporated pups içinde algılamak. Not: 1 dk pozlama süresi luciferase sinyal tespit etmek yeterli olur. Parlaklık (p/s/cm2/sr) olduğunu yaklaşık > 1 x 106.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>4. Electroporated Cerebella Cryosections hazırlamak
<ol><li>Electroporated P7 pups ötenazi ve beyincik incelemek. Not: Bir epifluorescent stereoscope kullanarak GFP sinyal görülebilmektedir.</li>
	<li>Cerebella gecede beyin % 4'lük başına 5 mL fix PFA PBS 4 ° C'de içinde</li>
	<li>Sabit cerebella geceleme 4 ° C'de % 30 sükroz PBS içinde beyin başına 10 mL transfer Not: Doku kuluçka sükroz çözümde sonra bir 15 mL tüp alt ulaştırılması gerekmektedir.</li>
	<li>Bir parça selüloz filtre kağıdı ile kalan sükroz çözüm iliklerine kadar sonra bir en uygun kesme sıcaklık (OCT) bir tek kullanımlık plastik kalıp içine bileşik beyincik bırakın ve kuru buza dondur. Kriyojenik blok kadar kullanmak-80 ° C'de muhafaza edilebilir. Not: Protokol burada duraklatılmış.</li>
	<li>Bir cryostat kullanarak kalınlığı 10 µm bölümlerle kriyojenik blok oyulmuş ve bölümleri-80 ° C'de kullanımda kadar devam. Not: Bir OKT PBS ile bileşik yıkama sonra GFP ifade, bölümlerde onaylayabilirsiniz.</li>
</ol>5. Cryosections Immunostaining
<ol><li>Slaytlar için 30 dk room temperature ve yıkama PBS 10 min için iki kez kuru.</li>
	<li>Bölümleri sıvı engelleyici kalemle daire ve engelleme bir çözüm bölümlerde kuluçkaya (% 10 normal eşek serum içinde % 0,1 içeren PBS Triton-X100) Oda sıcaklığında 1 h için.</li>
	<li>Birincil antikorlar karşı molekülleri (Örneğin, GFP ve topoizomeraz II beta (Top2B) Bu çalışmada) ilgi engelleme çözüm ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya Not: Tablo malzemelerkullanılan antikor konsantrasyonları ve adları listelenir. GFP sinyalleri geliştirmek için bir anti-GFP antikor isteğe bağlı olarak diğer antikorlar ile birlikte kullanılabilir.</li>
	<li>10 dk. Incubate için %0,1 PBST 3 X Triton içeren slaytlarla oda sıcaklığında 1 h için bölümleri bir fluorophore Birleşik ikincil antikor DAPI içeren engelleme çözümde seyreltilmiş yıkayın.</li>
	<li>PBS 3 X 10 dk. Mount için slaytları slaytlar yıkama ve 4 ° C'de görüntüleme kadar tutun. Not: Protokol burada duraklatılmış.</li>
</ol>6. görüntüleme ve çözümleme
<ol><li>20 x büyütme oranında confocal mikroskop kullanma bölümlerine görüntü.</li>
	<li>GFP pozitif hücrelerinin ifade hedef protein kaybetme saymak. Temsili resim Şekil 2Biçinde gösterilir.</li>
	<li>Üzerine ablasyon GNPs ve onların ettiklerinizden hedef genlerin moleküler fenotip immuostaining12ile kontrol edin.</li>
</ol>

<ol><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing.</a> Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).</li>
<li>Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+CRISPR%2FCas9-mediated+tumour+suppressor+disruption+enables+versatile+brain+tumour+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling.</a> Nat Commun. 6, 7391(2015).</li>
<li>Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+and+transforming+neocortical+progenitors+by+CRISPR%2FCas9+gene+targeting+and+piggyBac+transposase+lineage+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling.</a> Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+nucleogenesis+by+precerebellar+neurons%3A+involvement+of+ventricle-directed%2C+radial+fibre-associated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration.</a> Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).</li>
<li>Kawauchi, D., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+cascade+from+Math1+to+Mbh1+and+Mbh2+is+required+for+cerebellar+granule+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation.</a> Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).</li>
<li>Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+BarH1+confers+commissural+neuron+identity+on+dorsal+cells+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord.</a> Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).</li>
<li>Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+expression+in+postmitotic+neurons+by+an+in+vivo+electroporation-based+tetracycline+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system.</a> J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).</li>
<li>Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+MYC-driven+medulloblastoma+models+from+multiple+embryonic+cerebellar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells.</a> Oncogene. , (2017).</li>
<li>Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chd7+is+indispensable+for+mammalian+brain+development+through+activation+of+a+neuronal+differentiation+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme.</a> Nat Commun. 8, 14758(2017).</li>
<li>Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mutant+mice+by+pronuclear+injection+of+circular+plasmid+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA.</a> Scientific Reports. 3, 3355(2013).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex-%2C+Hippocampus-%2C+Thalamus-%2C+Hypothalamus-%2C+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL%2F6+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), e53303(2016).</li>
<li>Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+basis+of+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular basis of cerebellar development.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18(2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Exo utero Elektroporasyon kullanarak, daha önce Atoh1 in vivo siRNA tabanlı fonksiyonel analizleri serebellar granül erken bir aşamada farklılaşma8hücre bildirdin. SiRNA seyreltme/bozulma ve embriyoların rahim duvarı dışında maruz kalma nedeniyle, fenotipik analiz electroporated granül hücre embriyonik aşamada sınırlıydı. Ancak, geçerli yöntem postnatal hayvanların fenotip analizini etkin.
Bizim önceki çalışma tümör baskılayıcı Ptch1 rahim...

Beyin hastalıkları en korkunç ölümcül hastalıklardan biri vardır. Onlar genellikle genetik mutasyonlar ve sonraki bozukluk sonucu. Moleküler mekanizmalar beyin hastalıkları anlamak için şimdiye kadar süren çabaları insan hasta genleri deşifre için potansiyel sorumlu genlerin bir dizi keşfettim. Şimdiye kadar genetik olarak germline hayvan modelleri vivo içinde kazanç--fonksiyonu (GOF) ve işlev kaybı (LOF) analizleri gibi aday gen için kullanılan. Fonksiyonel doğrulama çalışmaları hızlandırılmış gelişimi nedeniyle, gen işlevi okuyan bir daha uygun ve esnek vivo içinde gen tahlil arzu edilen sistemdir.
Vivo Elektroporasyon tabanlı gen aktarım sistemi uygulamaya gelişmekte olan fare beyin bu amaç için uygundur. Aslında, rahim içinde Elektroporasyon kullanarak çeşitli çalışmalar gelişmekte olan beyin1,2,3fonksiyonel analizler yapmak için potansiyel göstermiştir. Aslında, fare beynin korteksinin4, retina5, diencephalon6, arka beyin7, beyincik8ve spinal kord9 gibi birden fazla bölge somatik gen teslim tarafından hedef almış yaklaşımlar, öylesine uzakta.
Nitekim, geçici gen ekspresyonu vivo içinde Elektroporasyon embriyonik fare beyin üzerinde tarafından uzun GOF analiz için kullanılmıştır. Son transposon dayalı genomik tümleştirme teknolojileri daha fazla gen işlevi sırasında kayma ve zamansal bir şekilde incelemek için avantajlı olan uzun vadeli ve/veya koşullu ifade faiz10,11, genlerin etkin geliştirme. GOF Analizi aksine, LOF analiz daha zor oldu. Çift ve shRNA taşıyan plazmidlerin geçici transfection gerçekleştirildi iken, genlerin LOF uzun vadeli etkileri plazmit ve dsRNAs gibi exogenously tanıttı nükleik asitleri nihai bozulması nedeniyle garanti edilmez. Ancak, LOF analizlerde aracılığıyla bir ara CRISPR/CA teknolojisi sağlar. Floresan proteinler (Örneğin, GFP) veya kollarındaki proteinler (Örneğin, ateş böceği luciferase) kodlama genler ile CRISPR-Cas9 ve sgRNAs CRISPR-Cas9-aracılı somatik mutasyon maruz hücreleri etiketlemek için ortak transfected. Eksojen marker gen seyreltilmiş ve uzun vadeli yayılması sonra bozulmuş beri bununla birlikte, bu yaklaşım sınırlamalar fonksiyonel çalışmalar Proliferasyona hücreleri üzerinde olabilir. Transfected hücreleri ve onların kızı hücreleri onların genleri CRISPR kaynaklı mutasyonların tabi iken, onların ayak izleri zamanla kayıp alabilirsiniz. Böylece, genetik etiketleme yaklaşımlar bu sorunu aşmak için uygun olacak.
Son zamanlarda onların farklılaşma12sırasında uzun vadeli yayılması geçmesi serebellar granül hücre CRISPR tabanlı LOF yönteminde geliştirdik. Transfected hücrelerin genetik olarak etiketlemek için bir sgRNA Cre ile birlikte taşıyan bir plazmid inşa ve plazmid rahim içinde Elektroporasyon kullanarak Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP fareler13 cerebella tanıttı. EGFP kodlama düzenli plazmid vektörel çizimler bu yaklaşım başarıyla nöron öncüleri (GNPs) transfected granül etiketli ve onların kızı hücreleri. Bu yöntem vivo içinde işlev ilgi normal beyin gelişimi ve tümör eğilimli bir arka plan Proliferasyona hücrelerinde genlerin anlamada büyük destek sağlar.

<table><tbody><tr><td>Alexa 488 Keçi anti-Tavuk</td><td>ThermoFisher</td><td>A11039</td><td>1:400 seyreltme</td></tr><tr><td>Alexa 568 Eşek Anti-Fare Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>A-10037</td><td>1:400 seyreltme</td></tr><tr><td>Alexa 594 Eşek anti-Tavşan</td><td>ThermoFisher</td><td>A21207</td><td>1:400 seyreltme</td></tr><tr><td>Alexa 647 Eşek anti-Tavşan Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td>A31573</td><td>1:400 seyreltme</td></tr><tr><td>Alkali Fosfataz (FastAP)</td><td>ThermoFisher</td><td>EF0654</td><td></td></tr><tr><td>Otoklav bandı</td><td>Kisker Biotech</td><td>150262</td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BbsI (FastDigest)</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1014</td><td></td></tr><tr><td>Selüloz Filtre Kağıdı (Whatman)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10347525</td><td></td></tr><tr><td>Bezi</td><td>Tork</td><td>530378</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>biovision</td><td>7903-1</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık plastik kalıplar (Tissue-Tek Cyromold)</td><td>VWR</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>31966047</td><td></td></tr><tr><td>Eşek serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI (HF)</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Elektro Kare Poratör</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>Endofree Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>Göz merhemi (Bepanthen)</td><td>Bayer</td><td>81552983</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil</td><td>Merck</td><td>104022</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10270-016</td><td></td></tr><tr><td>Filtre (0.22 & mikro; m)</td> <td>Merck</td><td>F8148</td><td></td></tr><tr><td>Floresan hücre görüntüleyici (ZOE)</td> <td>Biorad</td><td>1450031</td><td></td></tr><tr><td>Forseps düz</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Gazlı Bez (X100 ES-pedler 8f 10 x 10 cm)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15387311</td><td></td></tr><tr><td>GFP antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Filamentli Cam Kılcal</td><td>Narishige</td><td>GD1-2</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma Yastığı</td><td>ThermoLux</td><td>463265 / -67</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü İşleme yazılımı (ImageJ ve Fiji)</td><td></td>NIH-İnsülin <td></td><td></td></tr><tr><td>şırıngası (B. Braun OMNICAN U-100)</td><td>Carl Roth</td><td>AKP0.1</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Zoetis</td><td>TU061219</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina LT Serisi III Kaliper</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136331</td><td></td></tr><tr><td>Kalt Sütür İğneleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>12050-02</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HIFI HOTSTART HAZIR karışımı</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>Işık İşaretçisi</td><td>Fotonik</td><td>PL3000</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı engelleyici kalem</td><td>Kisker Biyoteknoloji</td><td>MKP-1</td><td></td></tr><tr><td>Metamizol</td><td>WDT-Mikroöğütücü</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Narishige</td><td>EG-45</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjektör</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop yazılımı ZEN</td><td></td> <td>Zeiss-Non-steril</td><td></td></tr> <tr><td>İpek Sütür İpliği (0.12 mm)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>OCT Bileşik (Doku-Tek)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>p27 antikoru</td><td>BD bioscience</td><td>610241</td><td>1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Roth</td><td>335.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS ( 1x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-EGxxFP</td><td>Addgene</td><td>50716</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>pX330 plazmid</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Ligasyon Kiti</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Halka Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Slaytlar (SuperFrost)</td><td>ThermoFisher</td><td>10417002</td><td></td></tr><tr><td>Biyoistatistik Yazılımı (Prizma 7)</td><td>GraphPad Yazılımı,</td> <td>Inc-Spitacid</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>EcoLab</td><td>3003840</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>C-PS</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Künt uçlu cerrahi makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Sütür (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))</td><td>SMI</td><td>220340</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasyon Tamponu</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Doku makası Künt (11,5 cm)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>TOP2B antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc13059</td><td>1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>Tripsin (%2,5)</td> <td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız, 5 mm ve Oslash ile; disk elektrotları Platinum</td><td>Xceltis GmbH</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Buharlaştırıcı</td><td>Dr&auml; gerwerk AG</td><td>GS186</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Beyin malformasyonu kez tarafından genetik mutasyonlar neden olur. Hasta elde edilen dokular mutasyonların deşifre olası etken faktörleri hastalıkları tespit etti. İşlev bozukluğu hastalığı geliştirme mutasyona uğramış genler katkısını doğrulamak için mutasyon taşıyan hayvan modellerin üretimi bir açık yaklaşım. Genetik olarak germline iken fare modelleri (GEMMs) popüler biyolojik araçlardır ve tekrarlanabilir sonuçlar sergi, zaman ve maliyeti ile sınırlıdır. Bu arada, Sigara germline GEMMs kez daha uygun bir şekilde keşfetmek gen işlevini etkinleştirin. Bazı beyin beri hastalıklar (Örn, beyin tümörleri) üzerinden somatik neden gibi görünüyor ama değil germline mutasyonlar, Sigara germline chimeric fare modelleri, hangi normal ve anormal hücreleri bir arada, hastalık ilgili analiz için yararlı olabilir. Bu çalışmada, beyincik bedensel mutasyonlar CRISPR-aracılı indüksiyon için bir yöntemi bildirin. Özellikle, hangi Cas9 ve GFP kronik aktif CAG (CMV artırıcı/tavuk β-aktin) düzenleyici tarafından Cresonra koşullu çakma fareler, kullanılan-aracılı rekombinasyon genom kopyası. Kendini tasarlanmış tek-Kılavuzu RNA'ların (sgRNAs) ve Cre recombinase sıra, hem bir tek plazmid yapı kodlanmış serebellar kök/progenitor hücre içine rahim içinde Elektroporasyon kullanarak bir embriyonik aşamada teslim edildi. Sonuç olarak, transfected hücreleri ve onların kızı hücreleri böylece daha fazla fenotipik analizleri kolaylaştırmak yeşil flüoresan protein ile (GFP), etiketli. Bu nedenle, bu yöntem sadece Elektroporasyon tabanlı gen teslim embriyonik serebellar hücrelere gösterilen ama ayrıca CRISPR-aracılı işlev kaybı fenotipleri değerlendirmek için yeni bir kantitatif yaklaşım öneriyor.

Vivo fonksiyonel analiz için eksojen gene(s) içine girmiştik hücrelerini tanımlamak için önemlidir. GFP sigara Proliferasyona hücrelerdeki uzun süre takip gibi bir işaretleyici ifade, sinyal sırayla Proliferasyona hücrelerde kayboluyor. Bu efekt bir çizimi Şekil 1' de gösterilmiştir. Ayak izi LOF analizlerde transfected hücrelerinin kaybetme aşmak için biz Elektroporasyon tabanlı gen teslim CRISPR/Cas9 teknoloji ile birleştirerek yeni bir yaklaşım ge...

Geleneksel işlev kaybı çalışmalar nakavt hayvanlar kullanarak genlerin kez pahalı ve zaman alıcı olmuştur. Somatik mutagenesis CRISPR-aracılı Elektroporasyon tabanlı gen içinde vivoişlevleri anlamak için güçlü bir araçtır. Burada, nakavt fenotipleri beyincik Proliferasyona hücrelerdeki analiz etmek için bir yöntem raporu.

CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Bu elektroporasyona dayalı in vivo gen transferi yaklaşımının genel amacı, CRISPR aracılı fonksiyon kaybı analizlerini kullanarak serebellar granül hücrelerinin farklılaşmasında ilgilenilen genlerin rollerini değerlendirmektir. Bu yöntem, normal serebellar gelişim ve beyin tümörü oluşumları için önemli olan moleküllerin tanımlanması gibi gelişimsel sinirbilim ve nöro-onkolojilerdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Rahim içi elektroporasyon prosedürü, Profesör Peter Lichter'in laboratuvarından bir doktora sonrası olan Dr.Lena Herbst tarafından gösterilecek ve daha sonra aşağıdaki immünohistokimya, Dr.Haikun Di'nin laboratuvarından bir doktora sonrası olan Dr.Weijun Feng tarafından gerçekleştirilecektir.Bu yöntemin temel avantajı, nakavt hayvanların kombinasyonunun üretilmesi yerine, CRISPR-cas9 teknolojilerini kullanarak serebellar hücrelerde ilgilenilen genleri fizibil bir şekilde devre dışı bırakmaya çalışmaktır. Bu yöntem, normal serebellar gelişim sırasında gen fonksiyonları hakkında fikir verebilse de, diğer fiziksel beyin bölgelerinin gelişimi ve beyin tümörü modellemesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bir borosilikat cam kılcal damarı bir mikropipet

crispr-mediated-loss-function-analysis-cerebellar-granule-cells-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Bu video, plazmid DNA'nın in utero elektroporasyon kullanılarak murin embriyolarının serebellar nöronal hücrelerine verilmesini göstermektedir. Bu yöntem, normal beyin gelişiminde genlerin in vivo fonksiyonunu ve tümör ilerlemesi sırasında nöron hücrelerinin gen ekspresyonundaki değişiklikleri anlamak için yararlıdır.

In Utero Elektroporasyona Dayalı Gen Dağıtımı: Murin Embriyolarının Embriyonik Serebellar Hücrelerine Plazmid DNA Enjekte Etme Tekniği

Bu videoda civciv embriyo serebellum dilimlerinin raportör gen plazmitleri ile elektroporasyonunu gerçekleştiriyoruz. Teknik, granül tabaka oluşturmak için granül hücre öncülerinin gelişiminin ve göçünün görselleştirilmesini kolaylaştırır.

Civciv Embriyo Serebellar Dilimlerinin Ex Vivo Elektroporasyonu: Granüler Hücre Gelişimini Görselleştirmek için Yeşil Floresan Proteini Kodlayan Plazmid DNA'yı Tanıtma Yöntemi

Nöronal morfogenezine ve göç doğru beyin gelişimi altında yatan çok önemli olaylardır. Burada, genetik olarak kültürlenmiş nöronlar ve serebellar granül morfolojisi ve nöronların göç özelliklerinin değerlendirilmesi için gelişmekte olan beyincik işlemek için yöntemleri tarif eder.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Nöron göçü, çok sayıda hücre otonom ve hücre dışı otonom faktör tarafından düzenlenir.  Bu protokol, transgenik bir faredeki bir fenotipin bir hücre içsel mekanizmasının bozulmasından mı yoksa nöron ile çevresi arasındaki etkileşimin bozulmasından mı kaynaklandığını belirlemek için utero elektroporasyonun nasıl kullanılabileceğini gösterir.

Protein silinmesi indüksiyonu yoluyla In Utero Elektroporasyon Transgenik Modelleri Nöronal Göç Açıkları tanımlayın

Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

Periventriküler Nodüler Heterotopya (PNH) malformasyonu kortikal gelişim (MCD) en sık görülen yetişkinlikte ama genetik temeli en dağınık durumda bilinmeyen kalır. Biz son zamanlarda roman aday genler MCD'ler için tanımlamak için ve doğrudan kendi etken rol içinde vivoonaylamak için bir strateji geliştirdik.

Dizi-CGH, Bütün exome sıralama ve rahim içinde elektroporasyon Rodents beyin malformasyonlar için sorumlu genlerin tanımlamak için birleştirerek yeni bir strateji

Gen beyinde hücre-otonom fonksiyonları kaybı inducing tarafından okudu ya da seyrek nüfus hücre işlevinin kazanmak. Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase işlev içinde vivokaybına neden için floxed genler ile kortikal nöronlar geliştirme seyrek nüfus sunmak için açıklamak.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Burada, fare beyinciğindeki granül nöronların sinaptogenezini, doğum sonrası beyin gelişiminin zaman boyunca, bu hücreler sinaptik yapılarını rafine ettiklerinde ve kendilerini genel beyin devresine entegre etmek için sinapslar oluşturduklarında görselleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Serebellar Granül Nöron Morfolojisi ve Sinaps Gelişimini Incelemek için In Vivo Postnatal Elektroporasyonun Kullanılması

Burada, CRISPR RNP Zygotes Elektroporasyonu (CRISPR-EZ) adı verilen genetiği değiştirilmiş farelerin verimli bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış basit bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, elektroporasyon yoluyla düzenleme reaktiflerini embriyolara %100'e yaklaşan bir verimlilikle teslim eder. Bu protokol, memeli embriyolarındaki nokta mutasyonları, küçük genomik eklemeler ve delesyonlar için etkilidir.

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

Öğrenin, CRISPR-Cas9 ve rahim içi elektroporasyon kullanarak serebellar granül hücrelerinde gen fonksiyonlarını nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, gelişimsel nörobilim ve beyin tümörü araştırmalarında hızlı sonuçlar sağlar.

CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Daha fazla video keşfet