Jel-seq: DNA ve RNA hidrojel matrisleri kullanarak eşzamanlı sıralama kitaplığı hazırlanması için bir yöntem

Bu deneyin genel amacı, numuneyi herhangi bir noktada bölmeden küçük hücre popülasyonlarının hem DNA'sından hem de RNA'sından yeni nesil dizileme kütüphaneleri oluşturmaktır. Bu yöntem, araştırmacılara DNA'nın genlerin ekspresyonu üzerindeki yapısal varyasyonlarını incelemek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır. Gel-seq'i ilk düşündüğümüzde, aynı örnekten hem DNA'yı hem de RNA'yı aynı anda dizilemek için hiçbir protokol yoktu.

Neyse ki, şu anda bu sorunu çözen üç yayınlanmış yaklaşım var. Bu tekniğin temel avantajı, hem genomik hem de transkriptomik bilginin aynı hücre setinden ihmal edilebilir bir ek maliyetle elde edilebilmesidir. Gel-seq başlangıçta dik kasetlerle geliştirilmiştir, ancak bu protokol herhangi bir standart jel elektroforez kaseti ile çalışacak şekilde uyarlanabilir.

Dolgu maddesini, yüksek yoğunluklu ve düşük yoğunluklu öncü karışımları üç tüpte hazırlayın. Reaktifleri açıklanan sırayla ekleyin ve karışımı girdaplayın. APS veya Temed'i zamanından önce eklemeyin.

Yönlendirilene kadar bekleyin. Daha sonra, önce kapaktan bir iğne sokarak her bir jel monomer çözeltisinin gazını alın. Daha sonra iğneyi bir ev vakum hattına bağlayın ve bu düzeneği ultra sonik bir banyoya daldırın.

Sıvıdan daha fazla kabarcık çıkmayana kadar yaklaşık bir dakika bekleyin. Ardından, dolgu öncü karışımına Temed ve APS'yi ekleyin ve kısaca girdap yapın. Üç dakika içinde, dökülmeden her bir jel kasetine altı milimetre eklemek için bir milimetrelik bir pipet kullanın.

Kasetleri düz bir masa üzerinde dik olarak konumlandırarak sıvının düz olduğundan emin olun. Ardından, polimerize edici karışımın su ile karışmasını en aza indirmeye dikkat ederek kasetleri yavaş yavaş gazı alınmış, iyonize su ile doldurun. Ardından, polimerin bir saatten gece boyunca kürlenmesine izin verin.

Polimer sertleştikten sonra, su tabakasını boşaltın ve jelin yüzeyini kurutmak için altı inç uzaklıktan hafif bir basınçlı hava akışı kullanın. Ardından, yüksek yoğunluklu jel öncüsüne Temed ve APS ekleyin ve kısaca girdaplayın. Üç dakika içinde her kasete 320 mikrolitre aktarın ve kaseti birkaç kez ileri geri sallayarak dolgu jeli tabakasının üzerine yayın.

Ardından, kasetleri deiyonize edilmiş, gazı alınmış su ile doldurun ve polimerin yaklaşık bir saat kürlenmesine izin verin. Sertleştikten sonra, polimeri daha önce olduğu gibi kurulayın. Son olarak, düşük yoğunluklu jel öncü karışımına Temed ve APS ekleyin ve girdaplayın.

Ardından, kasetlerin geri kalanını bu karışımla hızlı bir şekilde doldurun ve kürlenmeye başlamadan önce jel tarakları yerleştirin. Şimdi, polimerizasyon sırasında adsorbe edilecek tarak üzerine fazla rezerv öncüsü ekleyin. Sertleştikten sonra kaset kullanıma hazırdır.

RNA'yı cDNA'ya dönüştürdükten sonra, ilgilenilen fraksiyonu geri kazanmak için bir jel kullanın. İlk olarak, birkaç mililitre DNA giderme ürünü ve tüy bırakmayan bir mendil kullanarak elektroforez odasını iyice temizleyin. Ardından, hazneyi temiz, sıfır nokta beş XTBE ile doldurun ve tüm cihazı 254 nanometre, UV çapraz bağlama fırınına yerleştirin ve 15 dakika sterilize edin.

Şimdi, elektroforez odasına bir Jel-seq kaseti yerleştirin ve yerine kilitleyin. Ardından jeli yırtmadan hafifçe yukarı doğru çekerek jel tarağı yavaşça çıkarın. Şimdi, numuneleri bir pipet kullanarak yükleyin.

Kuyular arasında kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için numuneleri yüklerken ucu kuyucuklara tam olarak sokun. gDNA'yı cDNA/RNA hibritlerinden ayırmak için Gel-seq kaseti boyunca 30 dakika boyunca 250 voltluk bir elektrik alanı uygulayın. Jeli yükledikten, çalıştırdıktan ve topladıktan sonra, jeli yüksek yoğunluklu tabakanın hemen altında ikiye kesmek için bir neşter kullanın ve dolgu jelinin yarısını atın.

Ardından, bir kazıma aletini dikkatli bir şekilde kullanarak kasette kalan jeli nazikçe soyun. Bir jel doktor kullanarak ayırmayı doğruladıktan sonra, bantları çıkarmak için bir transilluminatör kullanın. gDNA, düşük yoğunluklu jelin başlangıcında bulunmalı ve cDNA, düşük ve yüksek yoğunluklu bölgelerin arayüzünde olmalıdır.

Şimdi, jelin gDNA ve cDNA içeren bölgelerini kesmek için bir neşter kullanın. Ayrıca aynı bölümleri negatif kontrol şeridinden kaldırın. Körelmiş cımbız kullanarak, jelin bölümlerini nazikçe şerit tüplere aktarın.

Jel kırılırsa, tüm kırık parçaları bulun ve tüpe aktarın. Ardından, her bir jeli dairesel hareketler kullanarak ve bir pipet ucuyla bastırarak öğütün. Uçları çıkarmadan önce, gDNA'ya 40 mikrolitre nükleaz içermeyen su ve cDNA örneklerine 80 mikrolitre ekleyin.

Ardından, uçları dikkatlice çıkarın ve atın. Şimdi, şerit tüplerini 37 santigrat derecede bir girdap karıştırıcıya sabitleyin ve sekiz ila 12 saat çalkalayın. Böylece DNA jelden kaçacaktır.

Çalkalamadan sonra, numuneleri sekiz mikronluk gözenekli bir filtre plakasına pipetleyin. Daha sonra, jel parçalarını süzmek için plakayı beş dakika boyunca 2.600 g'da döndürün. Ardından, ağ filtre plakasını muhafaza plakasından kaldırın ve jel içermeyen numuneleri plakadan yeni 200 mikrolitrelik şerit tüplerine aktarmak için bir pipet kullanın.

gDNA içeren her numuneye bir mikrolitre proteaz ekleyin ve iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, numuneleri 50 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Ardından 70 santigrat derecede 15 dakika ısıtma aktivasyonu yapın.

Bu nükleozom tükenme aşaması kritiktir. Ardından, her numune tüpünün kapağında bir delik açmak için 18 gauge bir iğne kullanın. Ardından, gDNA örneklerini beş mikrolitreye ve cDNA örneklerini 10 mikrolitreye düşürmek için bir vakum kullanın.

Hacim hedefin altına düşerse, gerektiği kadar nükleaz içermeyen su ekleyin. gDNA ve cDNA/RNA hibritleri, Gel-seq cihazı kullanılarak fiziksel olarak ayrıldı. Negatif kontrol, arayüzlerde jelin otomatik floresansına sahip değildir.

DNA merdivenleri, düşük ve yüksek yoğunluklu zarlar arasındaki arayüzde sadece koyu bir bant gösterir ve küçük parçaların düşük yoğunluklu jelden geçebileceğini ortaya çıkarır. 500 PC3 hücresinden alınan biyolojik bir örnek, genomik DNA ve cDNA/RNA hibritlerinin istenen ayrımını gösterir. Düşük yoğunluklu zarın tepesindeki koyu renkli bir bant, megabaz ölçekli genomik DNA'dır, cDNA / RNA hibritleri ise düşük ve yüksek yoğunluklu bölgelerin arayüzünde istiflenir.

Küçük 100 altı baz çifti fragmanları, ters transkripsiyon sırasında primer oligonükleotidlerden üretilen hedef dışı ürünlerdir ve beklenmelidir. Kütüphaneler 500 PC3 hücresinden veya 750 HeLa hücresinden oluşturuldu. Gel-seq'ten oluşturulan eşleşen kütüphanelerden gelen parça dağılımları, standart protokollerle oluşturulan eşleşmeyen örneklerle karşılaştırıldı.

Nükleotid fragmanlarının dağılımı her iki yöntemle de benzerdi. PC3 hücre kütüphanesinin dizileme sonuçları geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldı. Genom çapında kopya sayısı varyasyonları karşılaştırıldı.

İstatistiksel olarak, iki yöntem benzer sonuçlar elde etti. Bu videoyu izledikten sonra, aynı başlangıç örneğinden hem DNA hem de RNA için eşleştirilmiş yeni nesil dizileme kitaplıklarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Herhangi bir düşük girdi sıralama deneyinde olduğu gibi, temiz bir çalışma ortamı sağlamayı unutmamak zorunludur.

Tüpleri sterilize etmeye ve eldivenleri temizlemeye çok dikkat etmelisiniz. Bu önlemlerle bile, deneyler bazen kontaminasyon nedeniyle başarısız olur. Önemli bir not, poliakrilamid jellerin her yerde bulunması ve güvenliği, üretim öncülerinin tehlikeli nörotoksinler olduğunu unutmayı kolaylaştırır.

Bu reaktiflerle her zaman çeker ocakta çalışmalı ve dökülenleri hemen temizlemelisiniz. Gel-seq'i araştırmacıların kendi laboratuvarlarında uygulayabilecekleri basit bir şekilde tasarladık ve bunun, bu teknolojinin hızlı bir şekilde benimsenmesini kolaylaştıracağını umuyoruz.