Name: Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Öğrenin canlı hücrelerde kaspaz aktivasyon komplekslerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için Bimoleküler Floresan Tamamlama yöntemini. Bu teknik apoptoz mekanizmalarını incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu tekniğin gelişimine katkıda bulunan tüm önceki üyeleri Bouchier-Hayes laboratuvar kabul etmek istiyoruz. Bu eser kısmen bir Texas Çocuk Hastanesi Pediatrik Pilot Ödülü LBH tarafından finanse edildi. Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Teksas) ekibi ile işbirliği içinde yayımlanan verileri eklemek izin için teşekkür ediyoruz. Açıklanan reaktifler gelişimi NIH (NIAID P30AI036211, ncı P30CA125123 ve NCRR S10RR024574) ve Joel M. Sederstrom yardımıyla fon ile sitometresi ve hücre sıralama özünde Baylor Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir

1. hücre ve kültür yemeklerin hazırlanması
Not: Bir doku kültürü laminar akış mahallede 1-3 adımları gerçekleştirin. Eldiven giymek.
<ol><li>Cam alt yemekleri kullanıyorsanız, fibronektin ile cam ceket. Adım 1.2 için plastik yemekleri kullanıyorsanız atlayın.<ol>
<li>Fibronektin bir 0.1 mg/mL solüsyon olun: 1 mL 1 mg/mL fibronektin çözeltisi 1 X PBS 9 ml seyreltik.</li>
		<li>Kapak cam kuyunun her 0.5-1 mL fibronektin ve oda sıcaklığında 1-5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak, fibronektin çözüm toplamanız ve 4 ° C'de Not: Fibronektin çözüm birden çok kez yeniden kullanılabilir.</li>
		<li>Bir kez 1-2 mL 1 X PBS ile cam yıkama ve PBS Aspire edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6-şey plaka 2 ml (bkz. Tablo 1 için farklı büyüklükte kuyular için kullanılacak cep numaralarını) uygun hücre kültür ortamının kuyu başına 1 x 105 hücre plaka. Stabil (konuya bakın) caspase BiFC bileşenleri ifade eder bir hücre kültürünü kullanıyorsanız, 2 x 105 hücreleri plaka ve tedavi tutamaçlarından (Adım 3).</li>
	<li>Gecede 37 ° C'de bir doku kültürü kuluçka çanak uygun hücrelere izin.</li>
</ol>2. caspase BiFC bileşenleri tanıtmak transfection hücre
<ol><li>Uygun transfection reaktif hücrelerle transfect. Not: Bu protokol Lipofectamine 2000, en az toksisite için optimize edilmiş talimatı özetliyor. Bu iletişim kuralı başarıyla Hela hücreleri, MCF7 hücreleri ve LN18 hücreleri kullanılmaktadır. Ek kullanarak transfection reaktifler üreticinin yönergeleri izleyin ve gerektiği şekilde en iyi duruma getirme.<ol>
<li>Transfection reaktif 12 µL düşük serum medya steril tüp içinde 750 µL ekleyin.</li>
		<li>5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>10 eklemek bir muhabir plazmid (floresan bir protein transfected hücreleri etiketlenir örneğin kırmızı floresan protein [RFP], kodlama bir plazmid) ng steril 1,5 mL tüp transfected her şey için.</li>
		<li>20 eklemek her caspase BiFC plazmid ng (örneğin, 20 ng caspase-2 prodomain [C2 Pro]-VC ve 20 ng C2 Pro-VN) her Tube (Tablo 2).</li>
		<li>Her tüp 100 µL toplam hacmi kadar düşük serum medya ekleyerek getir.</li>
		<li>P200 pipet kullanarak, transfection reaktif çözeltinin 100 µL 2.1.2 adımından plazmid karışıma dropwise bir şekilde ekleyin.</li>
		<li>Plazmid-transfection reaktif karıştırmak için oda sıcaklığında 20 dk kuluçkaya.</li>
		<li>Ve sonra kullanarak p1000 pipet pipet 800 µL serum Ücretsiz medya yavaşça aşağı kuyunun medya bir pipet kullanarak hücreleri veya emme Aspire edin.</li>
		<li>P200 pipet kullanarak dropwise DNA-lipid kompleks 200 µL her şey için ekleyin.</li>
		<li>3 h için bir doku kültürü kuluçka makinesi-37 ° C'de hücrelerde kuluçkaya.</li>
		<li>Değil monolayer bozabilir, aspirasyon emme kullanarak veya bir pipet ile DNA-lipit kompleksi içeren serum boş ortam kaldırmak için dikkat çekici.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış (37 ° C) tam büyüme medya yavaşça aşağı her şey tarafında 2 mL pipet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku kültürü kuluçka için en uygun protein ifade için 24-48 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
</ol>3. indüksiyon caspase harekete geçirmek
<ol><li>Bir uyuşturucu veya uyarıcı caspase harekete geçirmek yaklaşık 24 s sonrası transfection ikna ile tedavi.<ol>
<li>Uyuşturucu için istenen konsantrasyonu önceden sıcak (37 ° C) görüntüleme medya (Hepes [20 mM, pH 7.2-7,5] ve 2-mercaptoethanol [55 µM] ile desteklenmiş tam büyüme medya) ve karışımı yavaşça ekleyin (Tablo 3).</li>
		<li>Ve sonra bir pipet kullanarak, yavaşça aşağı kuyunun 3.1.1 çözümden 2 mL pipet medya bir pipet kullanarak hücreleri veya emme Aspire edin.</li>
		<li>Uyuşturucu olmadan görüntüleme medya için bir şey tedavi edilmemiş bir denetim ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku kültürü kuluçka 37 ° C'de hücreler kuluçkaya veya adım 4.3 için hızlandırılmış bir deneme için devam edin.</li>
</ol>4. Caspase BiFC veri toplama
<ol><li>
Caspase BiFC tek zaman nokta toplama
	<ol>
<li>Mikroskop ve üreticinin yönergeleri izleyerek Floresan ışık kaynağı açın.</li>
		<li>RFP filtre ve muhabir gen Floresans odaklanmak altındaki hücreleri bulmak.</li>
		<li>Bir el-taksitli karşı kullanarak, görme alanı içinde RFP pozitif hücrelerin tümünü say. Kaydedin.</li>
		<li>Aynı görme alanı korurken, geçiş GFP filtre (veya YFP filtre varsa) ve el-taksitli sayaç kullanarak, aynı zamanda yeşil kırmızı hücreleri saymak (Venüs-pozitif). Sadece kırmızı hücreleri Venüs-pozitif için değerlendirilmesini sağlamak için bu iki filtrenin arasında ileri geri geçiş. (Şekil 3) kaydedin.</li>
		<li>Her plaka üç bireysel alanların en az 100 RFP pozitif hücreleri saymak.</li>
		<li>Her alanda Venüs-pozitif transfected hücreleri (Yani aynı zamanda yeşil olan alyuvar) yüzdesini hesaplamak. Standart sapma almak için elde edilen yüzde ortalama.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caspase BiFC, üç boyutlu görüntüleme
	<ol>
<li>Üreticinin yönergelerini izleyerek mikroskobunun açmak ve satın alma yazılımı başlatmak.</li>
		<li>60 x veya 63 x petrol hedefi seçin ve bir damla yağı hedefte yer</li>
		<li>Kültür çanak doğru plaka sahibi kullanma mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Ya bir epifluorescence ışık kaynağı ve mikroskop göz parça veya confocal lazerler ve bilgisayar ekranı kullanarak, ilgi bir alana gidin.</li>
		<li>RFP lazer veya filtre kullanarak muhabir Floresans odaklan.</li>
		<li>Epifluorescence bu noktaya kadar kullanılan varsa, ışık kaynağı confocal lazerler geçer ve kamera tarafından alınan ve bilgisayar ekranında edinme yazılımı tarafından görüntülenen hücrelerin canlı görüntü görselleştirmek.</li>
		<li>Böylece hücreleri vizör ortasına joystick kontrolü ve odak tekerleğin kullanımı, ince odak ve hücrelerin konumunu ayarını yapın. Birbirinden ayrılır ve olmayan üst üste gelen hücreleri seçin.</li>
		<li>Yüzde lazer gücü % 50 ve 100 ms, pozlama süresi için deneme için kullanmak için en iyi ayarları belirlemek için bir başlangıç noktası olarak Venüs ve RFP için giriş.</li>
		<li>Canlı yakalama açmak ve ortaya çıkan görüntü ve eşlik eden görüntü çubuk her iki kanal için incelemek.</li>
		<li>Görüntü sinyali iyi görünüyor kadar sinyali düşük ise ve görüntü yapmak zordur, artışlarla yüzde lazer güç ve/veya pozlama süresini artırın.</li>
		<li>Sinyal doygunluk ulaşmak değil emin olun. Farklı bir zirve için her fluor görünür olduğundan emin olmak için ekran histogram bakarak kontrol edin. Tüm histogram ekran zirve kapsar, giriş alt lazer güç ve pozlama ayarlarını (Şekil 2).</li>
		<li>Kontrol (tedavi edilmemiş veya sigara transfected) hücreleri sinyal belirli olduğundan emin olmak için aynı koşullar altında görselleştirin. Not: Tek renkli transfectants de denetimine crossover için kullanılabilir, ancak sinyalleri dağınık şekilde farklı (örneğin karşı sitozolik mitokondrial) ise bu gerekli değildir.</li>
		<li>Z yığın modülü içinde belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı açın veya seçin.</li>
		<li>Odak topuzu, yaklaşık hücrenin merkezine karşılık gelen odak konumunu kullanarak.</li>
		<li>Hücre görünene kadar bir yönde odak ayarlamak, bu olarak üst konumunu seçin.</li>
		<li>Hücreyi yeniden artık görünür duruma gelene kadar ters yönde odak ayarlamak ve bu alt pozisyon seçin.</li>
		<li>En uygun adım boyu (genellikle yaklaşık 20 µm) seçin ve otomatik olarak üst ve alt pozisyonlar arasında 20 µm adımların her biri, her kanaldaki tek bir görüntü çekmek için kamera istemek için satın başlar.</li>
		<li>3D görüntü (şekil 4film 1) yeniden oluşturmak için 3B oluşturma yazılımını kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caspase BiFC zaman hata görüntüleme
	<ol>
<li>Deneme önce en az 1 h mikroskobunun açın ve 37 ° c sıcaklık ayarlayın</li>
		<li>40 x 60 x veya 63 x petrol hedefi seçin ve bir damla yağı hedefte yerleştirin.</li>
		<li>Kültür çanak doğru plaka sahibi kullanma mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin.</li>
		<li>CO2 kaynak kullanılabilir durumdaysa, CO2 teslimatı (CO2sunar tüp bağlı genellikle bir pleksiglas kapak) plaka sahibi üstüne yerleştirin. CO2 düzey 5 %'ye ayarlarsanız ve yazılım içinde CO2 denetleyicisinden açmak. CO2 kaynak yoksa, 20 mM Hepes tampon medya dahil.</li>
		<li>Transfected hücrelerinin bir alana gidin ve kamera tarafından alınan ve edinme yazılımlar RFP lazer kullanarak bilgisayar ekranında görüntülenen hücrelerin canlı görüntü görselleştirmek.</li>
		<li>Adımları 4.2.8-4.2.12, giriş ayarları için yüzde lazer güç ve pozlama kez RFP lazer. Bu değerler hala floresan sinyali algılamak mümkün olurken mümkün olduğunca düşük tutmak.</li>
		<li>Olumlu bir denetimi kullanarak örnek (bakınız Tablo 3 örnekler için), takip için yüzde lazer güç ve pozlama kez YFP lazer ışık ayarları giriş için adımları 4.2.8-4.2.12. Bu değerler hala Venüs sinyali algılamak mümkün olurken mümkün olduğunca düşük tutmak.</li>
		<li>Plaka her şey için bir veya daha fazla hücre muhabir ifade içeriyor farklı pozisyonların sayısını seçin.</li>
		<li>Her kare kare alınması hızlandırılmış ve toplam sayısı arasındaki zaman aralığını girin. Sonraki kare alınması için önce tüm seçilen pozisyonlar elde etmek için zaman olduğundan emin olun.</li>
		<li>Her bir pozisyon yeniden ziyaret edin ve düzeltin ve odak gerektiği gibi güncelleştirin.</li>
		<li>Değişiklikleri sıcaklık veya dış titreşimler neden olabilir odak drift için düzeltmek için odak kayması düzeltme sistemi üzerinde (varsa) açın.</li>
		<li>Hızlandırılmış başlar ve verileri kaydetmek.</li>
		<li>Kullanılabilir görüntüleme yazılımı (şekil 5Film 2) kullanarak verileri analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li>
<li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li>
<li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CASBAH%3A+a+searchable+database+of+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li>
<li>Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+mechanism+of+caspase-2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The biochemical mechanism of caspase-2 activation.</a> Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).</li>
<li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+model+for+apical+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A unified model for apical caspase activation.</a> Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li>
<li>Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+domains+of+death%3A+evolution+of+the+apoptosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The domains of death: evolution of the apoptosis machinery.</a> Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).</li>
<li>Salvesen, G. S., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation%3A+the+induced-proximity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Caspase activation: the induced-proximity model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).</li>
<li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+dimerization+and+inducible+cleavage+reveal+a+requirement+for+both+processes+in+caspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation.</a> J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).</li>
<li>Riedl, S. J., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apoptosome%3A+signalling+platform+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The apoptosome: signalling platform of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).</li>
<li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity-dependent+APO-1+%28Fas%2FCD95%29-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+%28DISC%29+with+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li>
<li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li>
<li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIDDosome%2C+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li>
<li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li>
<li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li>
<li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-2+activation+in+the+absence+of+PIDDosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation.</a> J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).</li>
<li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIDDosome-independent+tumor+suppression+by+Caspase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2.</a> Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPM1+directs+PIDDosome-dependent+caspase-2+activation+in+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus.</a> J Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death Dis. 6, e1813(2015).</li>
<li>Aaronson, D. S., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+road+map+for+those+who+don%27t+know+JAK-STAT%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A road map for those who don't know JAK-STAT.</a> Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).</li>
<li>Manton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953(2016).</li>
<li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li>
<li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li>
<li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li>
<li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li>
<li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li>
<li>Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdimer+processing+mechanism+of+procaspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation.</a> EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).</li>
<li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li>
<li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade%3A+hierarchical+activation+of+caspases-2%2C+-3%2C+-6%2C+-7%2C+-8%2C+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li>
<li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases%3A+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu iletişim kuralı split floresan proteinler indüklenen caspase yakınlık ölçmek için kullanmayı açıklar. Çünkü çok zeki, çok photostable ve refolding hızlı 13olduğunu Split Venüs bu teknik için seçildi. Böylece, indüklenen caspase yakınlık refolding Venüs analizini caspase protein etkileşim dynamics gerçek zamanlı tahminler yakın sağlayabilir. Venüs iki biraz örtüşen parçalara, Venüs (Venüs-N veya VN) oluşan amino asitler 1-173 N terminus ayrılır ve C terminali parçası (Venüs-C veya VC) oluşan kal...

Caspase proteaz aile kritik rollerine Apoptozis ve doğuştan gelen bağışıklık 1bilinmektedir. Onların önemi nedeniyle, ne zaman, nerede ve nasıl verimli bir şekilde belirlenmesi belirli caspases aktif çok önemli caspase mekanizmaları harekete geçirmek yolları kazandırabileceğini. Burada açıklanan görüntüleme tabanlı iletişim kuralı caspase harekete geçirmek cascade ilk adımda görselleştirme sağlar. Bu teknik, bu sürücü caspase etkinleştirme dinamik protein: protein etkileşimleri yararlanır.
Caspases iki gruba ayrılabilir: Başlatıcı caspases (caspase-1, -2, -4, -5 -8 -9, -10 ve -12) ve Cellat caspases (caspase-3, -6 ve -7). Cellat caspases ön şekillendirilmesi dimer hücrede mevcut ve büyük ve küçük alt birim 2arasında bir bölünme tarafından aktif hale gelir. Etkinleştirildiğinde, onlar apoptosis 3' te sonuçlanan çok sayıda yapısal ve düzenleyici proteinler ayırmak. Başlatıcı caspases bir yolu var olmak harekete geçirmek ve genellikle Cellat caspases aktivasyonu tetiklemek için ilk caspases vardır. Cellat caspases aksine, başlatıcı caspases dimerization 4,5tarafından etkinleştirilir. Bu dimerization harekete geçirmek platformlar bilinen belirli büyük molekül ağırlığı kompleksleri için etkin olmayan monomerleri alımı tarafından yönetilir. Derleme etkinleştirme platformlarının bir dizi belirli protein: protein etkileşimler tarafından yönetilir. Bunlar tarafından korunmuş protein etkileşim motifleri mevcut başlatıcı caspase proform aracılı ve ölüm etki alanı (DD), ölüm efektör etki alanı (DED) ve caspase işe alım etki alanı (kart) 6 (şekil 1A) içerir. Harekete geçirmek platformlar genellikle bir reseptör protein ve bir adaptör protein içerir. Reseptör genellikle çok sayıda molekülleri Oligomerizasyonda için sağlar bir konformasyonal değişim inducing bir ligand bağlanması üzerine devreye girer. Reseptör sonra da caspase doğrudan veya sırayla getirmek caspase kompleksi için adaptör molekül acemi. Böylece, çok sayıda caspase molekülleri yakın dimerization izin gelmek. Bu indüklenen yakınlık modeli 7olarak bilinir. Dimerized sonra caspase aktif enzim 4,8stabilize etmek için hizmet vermektedir işlenirken uğrar. Örneğin, Apaf1 apoptosome Meclisi yayınlandıktan sonra mitokondri mitokondrial dış membran permeabilization (MOMP) denen bir süreç üzerinden sitokrom c tarafından tetiklenir. Apaf1 caspase-9 her iki proteinler 9' mevcut bir kartıyla aracılık ettiği bir etkileşimi aracılığıyla sırayla acemi. Caspase-8 harekete geçirmek yol açan karmaşık sinyal inducing CD95 ölüm (disk) Meclisi benzer protein etkileşimleri sonucunda; caspase-2-ebilmek harekete geçirmek PIDDosome; ve caspase-1 harekete geçirmek 10,11,12başlatmak çeşitli inflammasome kompleksleri. Böylece, başlatıcı caspases belirli harekete geçirmek platformları için indüklenen yakınlık ve dimerization, hangi olmadan harekete geçirmek gerçekleşmez sonuçlanan bir ortak mekanizma ve suikastler falan.
Harekete geçirmek platformu takip caspase indüklenen yakınlık doğrudan görselleştirme izin başlatıcı caspases, harekete geçirmek bu ilk adımda ölçmek için geliştirilmiş bir görüntüleme tabanlı tahlil Caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC) olduğunu derleme. Bu yöntem, split floresan protein Venüs özelliklerini yararlanır. Venüs olduğunu bir daha parlak ve daha photostable sürümü iki sigara floresan ve biraz örtüşen parçalara ayrılmış sarı floresan protein (YFP): N-terminus Venüs (Venüs N veya VN) ve C-terminus, Venüs (Venüs C veya VC). Bu parçaları yeteneği refold ve yakın 13zaman floresan haline korur. Her Venüs parça harekete geçirmek platforma bağlar caspase çok az bölümü olan caspase, prodomain için erimiş. Bu caspases enzimatik aktivite korur ve bu nedenle eşzamanlı akış aşağı olaylar endojen olaylar ile ilişkili olası analizidir sağlar. Ne zaman caspase prodomains harekete geçirmek platforma işe ve indüklenen yakınlık tabi Venüs e saldırı indirgenmesi parçaları. (Şekil 1B). Elde edilen Venüs Floresans doğru ve özellikle hücre altı yerelleştirme, kinetik ve başlatıcı caspase harekete geçirmek platformlar Tek Kişilik hücrelerde Meclisi etkinliğini izlemek için kullanılabilir. Veri görüntüleme confocal mikroskopi veya standart floresan mikroskopi elde edilebilir ve dahil olmak üzere farklı mikroskobu yaklaşımlar bir dizi için adapte edilebilir: hızlandırılmış caspase harekete geçirmek gerçek zamanlı; izlemek için görüntüleme yüksek kararlılık düşsel hücre altı yerelleştirme kesin tayini için; ve bitiş noktası miktar verimlilik etkinleştirme.
Bu teknik ilk caspase-214aktivasyonu araştırmak için geliştirilmiştir. Caspase-2 için harekete geçirmek platform PIDDosome olduğu düşünülen iken, reseptör PIDD (protein p53 kaynaklı bir ölüm etki ile) oluşan ve adaptör RAIDD (RIP ilişkili Ich-1/CAD-3 homolog protein ölüm etki alanı ile), PIDDosome bağımsız caspase-2 aktivasyon bildirilmiştir. Bu ek harekete geçirmek platformlar için caspase-2 15,16var olduğunu göstermektedir. Caspase-2 aktivasyon platformun tam bileşenleri bilmeden rağmen caspase BiFC tekniği başarılı sorgulama moleküler düzeyde 14,17caspase-2 sinyal yollar için izin verdi. Biz de başarıyla bu protokol inflamatuar caspases (caspase-1, -4, -5 ve -12) için adapte olması 18 ve prensip olarak, aynı yaklaşımı benzer şekilde her kalan başlatıcı caspases analiz için yeterli olmalıdır. Bu iletişim kuralı benzer şekilde adapte olabilir diğer yolları araştırmak için dimerization büyük aktive sinyal edilmistir. Örneğin, STAT protein fosforilasyon Janus kinaz (JAK) 19tarafından takip dimerization tarafından etkinleştirilir. Böylece, BiFC sistemi için STAT harekete geçirmek hem de dinamik protein etkileşimler tarafından düzenlenmiş birçok yollar görselleştirmek için kullanılabilir. Aşağıdaki iletişim kuralı resim alma ve çözümleme için gazetecilere hücreye giriş için adım adım yönergeler yanı sıra yöntemleri sağlar.

<table><tbody><tr><td>6 kuyulu Kaplamasız No. 1.5 20 mm cam alt tabaklar</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Plazma Fibronektin Saflaştırılmış Protein</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VC plazmid</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VN plazmid</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>İnflamatuar kaspaz BiFC plazmitleri</td><td></td><td></td>, <td>LBH HeLa hücrelerinden talep üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td>, C2-Pro BiFC bileşenlerini</td><td></td><td></td> stabil bir şekilde ifade eder, LBH DsRed mito plazmid Clontech'ten <td>talep üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td></td><td></td><td>632421</td><td>Floresan raportör olarak kullanılabilecek benzer plazmitler Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Merkaptoetanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901'de</td><td></td></tr> bulunabilir</tbody></table>.

caspase harekete geçirmek bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Proteaz caspase ailesinin Apoptozis ve doğuştan gelen bağışıklık önemli rol oynarlar. Başlatıcı caspases bilinen bir alt Bunlar arasında ilk bu yollar var olmak harekete geçirmek. Grup caspase-2, içerir -8 ve -9 gibi inflamatuar caspases, caspase-1, -4 ve -5. Başlatıcı caspases tüm işe alım harekete geçirmek platformlar olarak adlandırılan belirli multiprotein kompleksleri için takip dimerization tarafından etkinleştirilir. Caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC) nerede floresan proteinler caspases başlatıcı caspases onların harekete geçirmek platformları ve sonucu olan alımı görselleştirmek için kullanılan başlatıcı için erimiş bölünmüş bir görüntü tabanlı yaklaşımdır indüklenen yakınlık. Bu floresan bir okuma bir başlatıcı caspase harekete geçirmek için gerekli ilk adımları sağlar. Farklı mikroskobu tabanlı yaklaşımlar bir dizi kullanarak, bu teknik Nicel veri caspase harekete geçirmek bir nüfus düzeyde verimliliğini yanı sıra caspase harekete geçirmek ve caspase etkinleştirme sayısı ve boyutu Kinetik sağlayabilirsiniz Hücre başına temelinde kompleksleri.

Caspase-2 BiFC DNA hasar tarafından indüklenen örneği şekil 3' te gösterilmiştir. Camptothecin, bir topoizomeraz ı inhibitörü, DNA hasarı ve caspase-2 aktivasyon ikna etmek için kullanıldı. Kırmızı floresan protein mCherry bir muhabir olarak hücreleri BiFC sonda hızlı göstermek için ve hücre toplam sayısı görselleştirmek yardımcı olmak için kullanılmıştır. Venüs Floresans yeşille gösterilmiş ve büyük puncta temsil eden caspase-2 yakınlık indüklenen. Bu hücrel...

Bu iletişim kuralı açıklar caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC); Başlatan caspases, indüklenen yakınlığı hangi onların harekete geçirmek için ilk adımdır görselleştirmek için kullanılan bir görüntüleme tabanlı yöntemi.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Bu metodolojinin genel amacı, bir başlatıcı kaspazın aktivasyonundaki ilk adımlardan birini görselleştirmektir. Bu adıma indüklenmiş yakınlık denir ve kaspaz molekülleri apoptotik hücre ölümü sırasında aktif dimerler oluşturmak için bir araya geldiğinde meydana gelir. Bu yöntem, kaspaz alanındaki spesifik başlatıcı kaspazların ne zaman, nerede ve ne kadar verimli bir şekilde aktive edilebileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerde kaspaz aktivasyon komplekslerinin montajının gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilmesidir. Bu biyomoleküler floresan tamamlama yöntemi, bir kaspaza infüze edilmiş tiroksin proteini Venüs'ün parçalarını kullanır. Parçalar kendi başlarına floresan değildir, ancak kaspaz indüklenmiş yakınlığa maruz kaldığında, bu iki Venüs yarısını bir araya getirir ve yanarlar.Hücreleri transfekte etmek için, önce steril bir tüpte 750 mikrolitre indirgenmiş serum ortamına 12 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, transfekte edilecek her bir kuyucuk için steril 1.5 mililitrelik bir tüpe 10 nanogram bir raportör plazmid ekleyin.Her tüpe her kaspa

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal uzay-zamansal düzenleme belirlenmesinde önemlidir. Burada, iki moleküllü floresan proteinlerin hücre mekansal etkileşimleri izlenmesi için basit bir yöntem olarak tamamlama (BiFC) açıklar.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Bu videoda, protein-protein etkileşimlerini değerlendirmek için fotoaktif lokalizasyon mikroskobu ve bimoleküler floresan tamamlamasının bir kombinasyonu olan BiFC-PALM açıklanmaktadır. BiFC, iki floresan protein fragmanının, ilgilenilen iki etkileşimli protein ile füzyonunu içerir. İki protein etkileşime girdiğinde, parçalar yakınlaştırılır, bu da iki parçanın bir araya gelmesine ve işlevsel bir floresan proteini yeniden oluşturmasına izin verir. Tek bir floroforun floresansı, PALM tarafından...

Bimoleküler Floresan Tamamlama-Birleştirilmiş Fotoaktif Lokalizasyon Mikroskobu

Bu video, bimoleküler floresan tamamlama raportör proteinleri kullanılarak insan makrofajlarındaki kaspaz proteinlerinin aktivasyonunu göstermektedir. Kaspaz-1'in pro alanları, inflamatuar kompleksler için işe alınan Venüs proteinlerinin floresan olmayan fragmanları ile kaynaştırılır. İnflamatuarların yakınlığı, Venüs parçalarının yeniden katlanmasını ve floresansını indükleyerek makrofajlarda kaspaz aktivasyonunu doğrular.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda Kaspaz Aktivasyonunun Görselleştirilmesi

Burada açıklanan yöntem, bir anti-apoptotik bakteriyel efektör proteinin aktivitesini incelemek için tanımlanmış adımlarda apoptotik sinyal kaskadını indüklemek için kullanılır. Bu yöntem aynı zamanda pro-apoptotik veya toksik proteinlerin indüklenebilir ekspresyonu için veya diğer sinyal yollarıyla etkileşimi incelemek için de kullanılabilir.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

Protein-protein etkileşimleri, bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilir. Burada açıklanan, bireysel Ras-Raf komplekslerinin nano ölçekli kümelenmesini ve difüzyonunu görselleştirmek için U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntülemek için BiFC-PALM'in kullanılmasıdır.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Kaspaz aktivitesi düşük seviyelerini ihtiva Tüm hayvanlarda sağlıklı hücreleri saptamak için, CaspaseTracker belirlenen son derece hassas biyosensör Drosophila için hazırlandı. Kaspaz bağımlı biyosensör aktivitesi ölüm uyarımının olmaması durumunda optimum koşullar altında yetiştirilen yetişkin hayvan iç organlar içinde uzun ömürlü, sağlıklı hücrelerde tespit edilir.

In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks

Anastasis teknik olarak hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez olabilir çünkü vivo içinde tespit etmek zordur. Burada tarif biz tespit ve yeni geliştirilen vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemimizi kullanarak canlı hayvanlarda anastasis geçmesi hücreleri izleme için kullanılan protokol.

Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Küçük moleküllü bir substratı oksitleyen bir lusiferaz enzimi tarafından yayılan biyolüminesans ışığı, bir lusiferin, fotosensoriyel proteinleri aktive etmek için kullanılabilir, böylece ışık stimülasyonuna başka bir boyut ekler ve hücrelerde zamansal ve mekansal ölçeklerde çok sayıda ışık aracılı fonksiyonun manipülasyonunu sağlar.

Biyolüminesan Optogenetik 2.0: Fotosensör Proteinleri In Vitro ve In Vivo'yu Aktive Etmek için Biyolüminesanstan Yararlanma

Bu protokol, insan kan örneklerinden monosit türevi makrofajlar (MDM) elde etmek için iş akışını, enflamatuar kaspaz Bimoleküler Floresan Kompleman (BiFC) muhabirlerini hücre canlılığı ve davranışından ödün vermeden insan MDM'sine verimli bir şekilde tanıtmak için basit bir yöntemi ve canlı hücrelerde enflamatuar kaspaz aktivasyonunu ölçmek için görüntüleme tabanlı bir yaklaşımı açıklamaktadır.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Bu protokol, piroptoz, apoptoz, nekroptoz ve PANoptoz gibi hücre ölüm yollarının başlatılmasını belirlemek için hem in vitro hem de in vivo (in fareler) enfeksiyon, steril hakaretler ve kanser modellerine yanıt olarak kaspaz aktivasyonunu (kaspaz-1, kaspaz-3, kaspaz-7, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-11) değerlendirmek için kapsamlı bir yöntemi açıklamaktadır.

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Mevcut protokol, akış sitometrisi veya spektroflorometre kullanarak florojenik bir substrat yoluyla kaspaz aktivitesini ölçmek için iki yöntem tanımlamaktadır.

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Öğrenin canlı hücrelerde kaspaz aktivasyon komplekslerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için Bimoleküler Floresan Tamamlama yöntemini. Bu teknik apoptoz mekanizmalarını incelemeye olanak tanır.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

Daha fazla video keşfet