Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

Bu metodolojinin genel amacı, bir başlatıcı kaspazın aktivasyonundaki ilk adımlardan birini görselleştirmektir. Bu adıma indüklenmiş yakınlık denir ve kaspaz molekülleri apoptotik hücre ölümü sırasında aktif dimerler oluşturmak için bir araya geldiğinde meydana gelir. Bu yöntem, kaspaz alanındaki spesifik başlatıcı kaspazların ne zaman, nerede ve ne kadar verimli bir şekilde aktive edilebileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerde kaspaz aktivasyon komplekslerinin montajının gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilmesidir. Bu biyomoleküler floresan tamamlama yöntemi, bir kaspaza infüze edilmiş tiroksin proteini Venüs'ün parçalarını kullanır. Parçalar kendi başlarına floresan değildir, ancak kaspaz indüklenmiş yakınlığa maruz kaldığında, bu iki Venüs yarısını bir araya getirir ve yanarlar.

Hücreleri transfekte etmek için, önce steril bir tüpte 750 mikrolitre indirgenmiş serum ortamına 12 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, transfekte edilecek her bir kuyucuk için steril 1.5 mililitrelik bir tüpe 10 nanogram bir raportör plazmid ekleyin.

Her tüpe her kaspaz BiFC plazmasından 20 nanogram ekleyin. Azaltılmış serum ortamı ekleyerek her tüpü toplam 100 mikrolitre hacme getirin. Bir P200 pipeti kullanarak, plazmit karışımına damla damla 100 mikrolitre transfeksiyon reaktif çözeltisi ekleyin.

Plazmit transfeksiyon reaktif karışımını oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ettikten sonra, ortamı bir pipet kullanarak veya emme ile hücrelerden aspire edin. Daha sonra bir P1000 pipeti kullanarak, 800 mikrolitre serumsuz ortamı kuyunun kenarından nazikçe pipetleyin. Bir P200 pipeti kullanarak, her bir oyuğa damla damla 200 mikrolitre DNA lipid kompleksi ekleyin.

Hücreleri bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede üç saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, DNA lipid komplekslerini içeren serumsuz ortamı, tek tabakayı bozmamaya dikkat ederek aspirasyon kullanarak emme veya pipet ile çıkarın. Hücreleri metin protokolünde açıklandığı gibi inkübe etmeden önce iki mililitre önceden ısıtılmış tam büyüme ortamını her bir kuyucuğun kenarından nazikçe pipetleyin.

Veri toplamadan önce, metin protokolünde açıklandığı gibi kaspaz aktivasyonunun indüksiyonunu gerçekleştirin. Üreticinin talimatlarını izleyerek mikroskobu açın ve edinme yazılımını başlatın. 60x veya 63x yağ hedefini seçin ve hedefin üzerine bir damla yağ koyun.

Ardından, doğru plaka tutucuyu kullanarak kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin. Isıtıcıyı açın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. RFP lazeri veya filtresini kullanarak muhabirin floresansına odaklanın.

Deney için kullanılacak en uygun ayarları belirlemek için başlangıç noktası olarak hem Venüs hem de RFP için %50 lazer gücü yüzdesini ve 100 milisaniye pozlama süresini girin. Canlı çekimi açın ve ortaya çıkan görüntüyü ve her iki kanal için görüntülenen histogramları inceleyin. Sinyal düşükse ve görüntünün ayırt edilmesi zorsa, sinyal ve görüntü iyi görünene kadar lazer gücü ve/veya pozlama süresini artımlarla artırın.

Ardından, mikroskop yazılımında Z yığını modülünü seçin veya açın. Hücre artık görünmeyene kadar odağı bir yönde ayarlayın. Bunu en üst konum olarak seçin.

Hücre tekrar görünmeyecek hale gelene kadar odağı ters yönde ayarlayın ve bunu alt konum olarak seçin. En uygun adım boyutunu seçin ve alıma başlayın. Gerekirse, floresan sinyalin görsel görünümünü iyileştirmek için ekran histogramını ayarlayın.

Son olarak, 3B görüntüyü yeniden oluşturmak için üç boyutlu oluşturma yazılımı kullanın. Bir karbondioksit kaynağı varsa, karbondioksit dağıtım cihazını plaka tutucunun üzerine yerleştirin. Karbondioksit seviyesini %5'e ayarlayın ve yazılımın içinden karbondioksit kontrol cihazını açın.

Kopyalanmış hücrelerden oluşan bir alana gidin. Kamera tarafından elde edilen ve RFP lazeri kullanarak bilgisayar ekranında toplama yazılımı tarafından görüntülenen hücrelerin canlı görüntüsünü görselleştirin. Ardından, RFP lazer için yüzde lazer gücü ve pozlama süresi ayarlarını girin.

Ardından, YFP lazer ışığı için yüzde lazer gücü ve pozlama süresi ayarını girin. Plakanın her bir oyuğu için, raporlayıcıyı ifade eden bir veya daha fazla hücre içeren bir dizi farklı konum seçin. Zaman turlarının her bir karesi ile alınacak toplam sayı kareleri arasındaki zaman aralığını girin.

Her konumu yeniden gözden geçirin ve odağı gerektiği gibi düzeltin ve güncelleyin. Hızlandırılmış çekimi başlatın ve verileri kaydedin. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi mevcut görüntüleme yazılımını kullanarak verileri analiz edin.

Burada, DNA hasarını takiben kaspaz-2 BiFC'nin bir örneği gösterilmektedir. Hücreler bir topoizomeraz bir inhibitör ile tedavi edildi: Kamptothecin. Kırmızı floresan proteini mCherry, hücrelerin BiFC probunu ifade ettiğini göstermek ve toplam hücre sayısını görselleştirmeye yardımcı olmak için bir raportör olarak kullanıldı.

Venüs floresansı yeşil renkle gösterilir ve büyük punkta kaspaz-2'nin neden olduğu yakınlığı temsil eder. Kaspaz aktivasyon kompleksinin hücre altı lokalizasyonunun yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlamak için, tek hücreler üç boyutlu olarak görüntülenebilir. Kaspaz-2 aktivasyonu burada yeşil renkle gösterilir ve çekirdek kırmızı ile gösterilir.

Hücrenin ortoganal dilimler görünümü, xy düzlemi, yz düzlemi ve xz düzleminin yan yana görselleştirilebildiği yerlerde gösterilir. Üç boyutlu görüntü, hücrenin y ekseni etrafında döndürüldüğü bir filmde de görüntülenebilir. Kaspazın kinetik verilerini sağlamak için BiFC zaman atlamalı görüntüleme kullanılabilir.

Bu film, proteazom inhibitörü: Bortezomib ile tedaviyi takiben yeşil renkte kaspaz-2 aktivasyonunu göstermektedir. Mitokondri kırmızı ile gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, kaspaz aktivasyon komplekslerinin montajını gerçek zamanlı olarak izlemek ve üretilen komplekslerin boyutunu, şeklini ve lokalizasyonunu belirgin bir şekilde belirlemek için kaspaz BiFC'nin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu protokol, kaspaz BiFC deneyinin sonuçlarını toplamak için birkaç mikroskop tabanlı yaklaşımı özetlemektedir; Bununla birlikte, kaspaz aktivasyon yollarını yaratıcı bir şekilde sorgulamak için bu yaklaşımların bir dizi varyasyonunun ve kombinasyonunun kullanılabileceğine dikkat edilmelidir. Bu prosedürü denerken, foto toksisite ve foto ağartma gibi mikroskopi kaynaklı artefaktlardan kontrolleri dahil etmeyi unutmamak önemlidir. Ekteki metin protokolü, bunu başarmak için ipuçları içerir.

Hangi edinim ve analiz yönteminin kullanılacağına karar vermek, keşfedilecek çevreler ve enstrümantasyon ve görüntüleme yazılımının kullanılabilirliği tarafından belirlenecektir. Bu prosedürü takiben, verileri yorumlamak için görüntüleme analizi yaklaşımları kullanılabilir. Zaman içinde floresan yoğunluğundaki değişiklikleri veya floresan hücrelerin yüzdesini ölçebilirsiniz.

Odak sayısı veya nesne boyutu da hesaplanabilir.