3' adapte CDNA hızlı amplifikasyon transkript kanser eşlemek için sona erer

Bu prosedürün genel amacı, sonraki iki PCR'de transkripte özgü iç içe geçmiş primerler kullanarak ve saflaştırılmış PCR ürünlerini dizileyerek üç asal uçtan protein kodlama bölgesi içindeki bölgelere kadar mRNA transkriptlerinin dizilerini belirlemektir. Bu yöntem, poliadenilasyon sinyalinin, durdurma kodonunun ve transkriptin üç asal çevrilmemiş bölgesinin sırasının belirlenmesi gibi genetik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, açık okuma çerçevesinin küçük bölgesinin dizisi ise herhangi bir transkripte uygulanabilmesidir. Bu tekniğin anlamı, tümöre özgü füzyon genlerini ve ekleme varyantlarını tespit edebildiği için kanser teşhisine kadar uzanır.

Bu yöntem için ilk olarak, daha önce karakterize edilmemiş, üç primli çevrilmemiş bölgelere sahip yeni transkriptleri tanımladığımızda aklımıza geldi. Protokole başlamak için fenol ve guanidin izotiyosiyanat hücre karışımını buz üzerinde çözün. Çözüldükten sonra, bir PCR başlığındaki mikrosantrifüj tüpüne 100 mikrolitre kloroform ekleyin.

Karışım pembe ve opak olana kadar numuneyi 10 ila 15 saniye vorteksleyin. Ardından, numuneyi 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneyi 20, 800 g ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.

Üst renksiz sulu fazı dikkatlice çıkarın ve yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, çökeltmeye geçin ve numuneye eşit hacimde izopropanol ekleyin. RNA için bir taşıyıcı görevi görmesi ve sonraki adımlarda RNA'yı görselleştirmeye yardımcı olması için numuneye bir mikrolitre eş çökeltici ekleyin.

Numuneleri 80 santigrat derecede en az dört saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneyi soğutulmuş bir santrifüje aktarın ve 20, 800 g ve dört santigrat derecede 35 dakika döndürün. Dönüşten sonra, RNA tüpün altında mavi bir özellik olarak görünecektir.

İzopropanolü, numuneden dikkatlice çıkarın. 500 mikrolitre %80 etanol ekleyin ve üç saniye boyunca kısa bir süre girdap yaparak peleti yeniden süspanse edin. Numuneyi tekrar santrifüjleyin.

Numunedeki tüm etanolü çıkarın ve numuneyi yaklaşık 10 dakika kurumaya bırakın. Numune kuruduktan sonra, 35 mikrolitre RNaz içermeyen su ile tekrar süspanse edin. Ardından, numuneyi bir ısı bloğuna yerleştirin.

RNA'nın tamamen çözelti içinde olduğundan emin olmak için beş dakika boyunca 65 santigrat dereceye ayarlayın. Isıttıktan sonra tüpü hemen buzun üzerine yerleştirin. 50 mikrolitrelik bir son reaksiyon hacmi için, yeni bir tüpe toplam 22 mikrolitrelik bir hacme su eklenmiş dört mikrogram toplam RNA ekleyin.

25 mikromolar astar çözeltisinden iki mikrolitre Oligo dT 10 astar ekleyin. Ters transkripsiyon kitinden iki mikrolitre RNaz inhibitörü, sekiz mikrolitre 5x reaksiyon tamponu, dört mikrolitre 10 milimolar dNTP ve iki mikrolitre ters transkriptaz ekleyin. Negatif kontrol olarak hareket etmek için ters transkriptaz olmadan bir reaksiyon ayarlayın.

Tüpü bir saat boyunca 42 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpü ısıtma bloğuna taşımadan önce doğrudan buza aktarın. Ardından, tüpü beş dakika boyunca 75 santigrat derecede ısıtın.

75 santigrat derece ısıttıktan sonra tüpü buzun üzerine yerleştirin. İki mikrolitre cDNA'yı 0,5 mililitrelik yeni bir PCR tüpüne aktarın. 10 milimolar astar çözeltisinden bir mikrolitre ileri astar ve bir mikrolitre ters astar ekleyin.

8,5 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyerek 12,5 mikrolitreye kadar yapın ve jel ana karışımına 12,5 mikrolitre 2x PCR ekleyin. Ardından, ekranda listelenen PCR termal döngü koşullarını girin ve PCR'yi çalıştırın. PCR'den sonra, etidyum bromür ile boyanmış %1'lik bir agaroz jeli hazırlayın.

Bir gram agarozu 100 mililitre triasetat veya 250 mililitrelik bir şişede TAE tamponunda çözün. İçeriği bir mikrodalgada kaynatın. Jeli bir dakika soğumaya bırakın ve çeker ocakta 7,5 mikrolitre etidyum bromür çözeltisi ekleyin.

Şişeyi döndürerek iyice karıştırın. İçeriği yatay bir jel aparatına dökün ve jelin çeker ocakta oda sıcaklığında en az 30 dakika katılaşmasına izin verin. Jeli 1x TAE tamponu ile örtün ve 10 mikrolitre PCR ürününü, DNA moleküler ağırlık merdiveninin üç ila beş mikrolitresi ile birlikte agaroz jelin üzerine yükleyin.

Jeli 10 dakika boyunca 175 voltta çalıştırın. İlk PCR için, bir mikrolitre cDNA'yı bir PCR tüpüne aktarın ve beş mikrolitre 10x Pfu reaksiyon tamponu ekleyin. İlk iç içe geçmiş ön astardan bir mikrolitre, T7 Oligo dT 25 astarından bir mikrolitre ve 10 milimolar çözeltiden bir mikrolitre dNTP ekleyin.

40 mikrolitre su ekleyerek toplam hacmi 49 mikrolitreye kadar çıkarın. Bir mikrolitre Pfu DNA polimeraz ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından, PCR'yi çalıştırın.

Ardından, ikinci PCR'yi hazırlayın. Ürünlerin iki mikrolitresini ilk PCR'den yeni bir PCR tüpüne aktarın ve beş mikrolitre 10x Pfu ultra iki reaksiyon tamponu ile karıştırın. Bir mikrolitre ikinci iç içe PCR astarı, bir mikrolitre T7 astarı ve bir mikrolitre dNTP ekleyin.

39 mikrolitre su ekleyerek toplam 49 mikrolitreye kadar reaksiyon hacmi oluşturun ve bir mikrolitre Pfu DNA polimeraz ekleyin. PCR'yi, ilk PCR kurulumuyla aynı PCR profilini kullanarak çalıştırın. Alternatif olarak, Pfu DNA polimeraz kullanmak yerine, iki farklı PCR'de bir kimerik DNA polimeraz kullanılabilir.

İkinci PCR ürününden beş ila on mikrolitre alın ve bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Son olarak, sonucu bir görüntüleyicide görselleştirin. Bu agaroz jel, aynı ileri astarı ancak farklı ters astarları kullanan iki farklı PCR ürününü ve farklı bir ileri ve geri astarı olan farklı bir PCR ürününü gösterir.

PCR bazlı reaksiyon için kullanılacak ideal primerler, tek bir farklı PCR ürünü veren primerlerdir. Pfu DNA polimeraz ve kimerik DNA polimeraz ile ikinci PCR reaksiyonundan elde edilen ürünler, üç asal RACE için farklı PCR döngü koşullarına sahip olmalarına rağmen aynı boyutta PCR ürünleri üretti. Ters transkriptaz negatif kontrolleri, cDNA sentezinde ve sonraki aşağı akış reaksiyonlarında kullanılan RNA'nın genomik kontaminasyonunu göstermedi.

Jel saflaştırılmış PCR ürünleri dizileme için gönderildi. Bir dizi kromatogramından temsili bir Sanger dizisi, üç asal RACE ürünündeki durdurma kodonunun, varsayılan poliadenilasyon sinyalinin ve bölgenin yanı sıra poli A kuyruğunun konumunu tanımladı. Bu prosedürü denerken, her zaman koruyucu ekipman ve eldiven giymeyi unutmamak önemlidir.

Ek olarak, reaktifleriniz, tüpleriniz ve diğer tek kullanımlık malzemeleriniz için steril DNaz ve RNase kullanın. Fenol ve kloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Ve bu prosedür gerçekleştirilirken reaktiflerin bir başlıkta kullanılması ve malzemenin belirlenmiş bir atık kabına atılması gibi önlemler her zaman alınmalıdır.