Name: Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Öğrenin, akış sitometresi ile insan yağ dokusundan bağışıklık hücrelerini izole etme ve fenotipleme yöntemini. Bu protokol, obeziteyle ilişkili metabolik hastalıklarda immün hücre popülasyonlarını nicel ve nitel olarak analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Teknik destek için J. van de Gaar ve M. Vroomen (Maastricht University, Hollanda) teşekkür etmek istiyorum. Buna ek olarak, K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, teşekkür etmek istiyorum ve E. Blaak kan ve doku biyopsisi sağlamak için bu iletişim kuralını ve sonraki deneyler ayarlama için kullanılan.

Visseral ve subkutan örnekleri tıbbi etik Komitesi Jessa hastane, Hasselt ve Hasselt Üniversitesi, Belçika, Helsinki Deklarasyonu doğrultusunda tarafından onaylanan çalışma kayıtlı konulardan alınmıştır.
1. hazırlanması reaktifler
<ol><li>Collagenase çözüm<ol>
<li>1 g geçiyoruz Collagenase ben fosfat 10 ml serum fizyolojik (PBS, kalsiyum ve magnezyum olmadan) 100 mg/mL stok çözüm yapmak için arabelleğe alınmış. 200 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>Collagenase XI 1 g 10 ml 100 mg/mL stok çözüm yapmak için PBS çözülür. 200 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>Dnaz 10 mg dağıtılması ı yapmak a 10 mg/mL stok eriyik için PBS 10 mL. 180 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>100 µL Collagenase ekleyin ben (100 mg/mL), 100 µL Collagenase XI (100 mg/mL) ve 90 µL Dnaz 10 mL DMEM Ham'ın F12 için ben (10 mg/mL). Collagenase çözüm her yalıtım için taze olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eritrosit lizis arabellek<ol>
<li>0,84 g NH4Cl ultrasaf su 100 ml geçiyoruz.</li>
		<li>PH 7.4 kullanmadan önce ayarlayın. Bir cam şişeye 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>Eritrosit lizis arabellek buz kullanmadan önce yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FACS arabellek<ol>
<li>0.5 g sığır serum albumin (BSA) 100 mL % 0.5 BSA PBS elde etmek için PBS çözülür.</li>
		<li>65 mg NaN3 10 mM NaN%3 0.5 BSA PBS elde etmek için 100 mL % 0.5 BSA PBS çözülür. Bir cam şişeye 4 ° C'de çözümde mağaza</li>
		<li>Kullanmadan önce buzda yer FACS arabellek. Dikkat: NaN3 çok zehirli. Bir duman mahallede çalışma ve koruyucu gözlük ve eldiven NaN3işleme koruma için giymek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İnsan IgG blok<ol>
<li>10 mg insan IgG 10 ml 1 mg/mL elde etmek için PBS çözülür. 100 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>İnsan IgG blok buz kullanmadan önce yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. izolasyon SVF AT üzerinden
<ol><li>1 g biyopsi bir 50 mL santrifüj tüpü (örneğin, Falcon tüp) bir neşter ve transferi ile küçük parçalara (± 2 mm2) kesti. Her örnek, 10 mL collagenase çözeltisi ekleyin. Not: tamamen tüp kapağını kapatın ve kapağı ¼ geri döndürmek.</li>
	<li>Nazik (60 devir/dak) sallayarak altında bir su banyosu içinde 37 ° C'de 60 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Elde edilen süspansiyon 200 µM ile filtre ve yeni bir 50 mL santrifüj tüpü örnek toplamak. 7 mL PBS filtre durulama ve tüm hücreleri elde etmek için filtre üzerine ekleyin.</li>
	<li>280 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Kayan adipocyte kesir pipetting tarafından kaldırın. Hücre Pelet SVF var. Not: SVF elde etmek için adipocyte kesir kaldırın. Çünkü bu sadece PBS ve değil kayan adiposit kaldırır tüm uç örnek batış kaçının.</li>
	<li>SVF PBS collagenase kaldırmak için süspansiyon 70 µM ile filtre, filtre 5 mL PBS ile durulayın ve 280 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi 5 ml resuspend</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve Pelet 3 mL eritrosit lizis arabellek resuspend.</li>
	<li>Buz üzerinde 5 min için kuluçkaya. PBS 7 mL kuluçka sonra ekleyin.</li>
	<li>280 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi</li>
</ol>3. boyama SVF Akış Sitometresi Analizi için
<ol><li>Hücre Pelet 90 µL 4 ° C FACS arabelleği dağıtılması ve 1 mg/mL insan IgG blok 10 µL ekleyin. Hücre süspansiyon 96 v-shape iyi plaka 2 Wells bölün. Plaka Buza koyun ve 15dk için kuluçkaya insan IgG blok izin.</li>
	<li>Yıkama ve plaka ile 280 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi için her örnek için 100 µL FACS arabellek ekleyin Süpernatant plaka baş aşağı bir düzgün hareket plaka dokunarak olmadan devrilme tarafından kaldırın. Not: kalan herhangi bir sıvı bir doku ile plaka üst plaka baş aşağı tutarak kaldırmak emin olun.</li>
	<li>Antikor kokteyller Tablo 1 ve Tablo 2' de açıklandığı gibi makrofaj ve DC alt kümeleri (FACS Masası 1) ve T ve B hücre alt kümeleri (FACS panel 2) için hazır olun. Tablo 1 ve Tablo 2 ' de anlatıldığı birimler antikor konsantrasyonları optimize sonra seçilir ve bir KDV veya uydu örnek için yeterli. Not: FACS Masası'nda 1, CD303 ve CD141 işaretleri onaylamak için bu CD11C+ CD11Bdüşük hücrelerdir DCs. Ancak, bu işaretler bir canlı/ölü boyama içerecek şekilde panelinden dışlamak için tavsiye edilir. Her iki FACS Masası 1 ve 2 CD303 panelinde 1 PE kanalı olarak hariç kullanılmayan ne zaman boyama canlı/ölü Fixable kırmızı ölü hücre leke Kit canlılığı ile kombine edilebilir. Üreticinin yönergelerine göre boyama canlılık gerçekleştirin.</li>
	<li>29,5 µL antikor FACS paneli 1 kokteyl Pelet ve 23 µL antikor FACS panel 2 kokteyl resuspend. Buz üstünde karanlıkta 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Her şey için 150 µL FACS arabellek eklemek ve ikinci bir yıkama adım gerçekleştirmek için hücre Pelet resuspend. 280 x g ve 4 ° c, 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Süpernatant plaka baş aşağı devrilme tarafından kaldırın.</li>
	<li>150 µL % 1 formaldehit çözüm hücreleri düzeltmek için her şey için ekleyin. Hücre süspansiyon P200 pipet ile pipetting tarafından karşılık gelen FACS tüp her kuyudan aktarın. 7 gün karanlık up FACS tüpler 4 ° C'de depolayın. Not: Doğrudan ölçüm olanağı da sağlar. Her şey yerine % 1 formaldehit 150 µL FACS arabellek eklemek, karşılık gelen FACS tüpler için P200 pipet ile pipetting tarafından hücreleri aktarmak ve hücreleri analiz. Dikkat: Formaldehit çok toksiktir. Formaldehit çözümleri inhalasyon önlemek ve eldiven ve koruyucu gözlük koruma için bir duman başlıklı çalışırken hazırlayın.</li>
</ol>4. Akış Sitometresi Analizi
<ol><li>İlk ölçüm önce bir günahı negatif kontrol ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) ayarlamak için kullanın. Akış Sitometresi üretici yönergelerine göre voltaj ilgi tüm örneğin alınma olasılığını FSC ve SSC grafikte görünür ve enkaz ve canlı hücreleri arasında bir ayrım yapılabilir şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Üreticinin protokol sonrası antikor yakalama boncuk ile çok renkli tazminat çözümlemesi gerçekleştirin.</li>
	<li>Eksi bir (FMO) denetimleri floresan antikor mix yaparak hazırlamak ancak bir antikor karışımından dışarıda. 8 antikor karışımları FACS paneli 1 ve 6 antikor karışımları FACS panel 2 için oluşturma her antikor için bunu. Bu FMO antikor karışımları bu protokol için daha önce açıklandığı gibi SVF leke için kullanılır.</li>
	<li>Tüm FMO denetimleri ölçmek ve gating stratejisi FMO denetimlere dayalı ayarlayın. FMO denetimleri mümkün auto-floresan hücreleri algılamak için kullanır. Not: bir antikor karışımından kaldırarak, bu kanalda tespit herhangi bir floresan arka plan/autofluorescent sinyal düzeydir. Bu nedenle, farklı FMO karşılaştırarak FACS sonuçları denetlemek, gates belirli nüfus gatings pozitif hücreleri temel alan ve auto-floresan üzerinde temel almayan sağlanması üzerinde çizilebilir.</li>
	<li>Akış Sitometresi yerleştirerek ve ölçüm başlamadan önce 800 rpm'de girdap FACS tüpler. Not: En az 50.000 olayları canlı kapısında yeterince hücre her subpopulation ölçülür sağlamak için önerilir.</li>
</ol>

<ol><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2C+immunity%2C+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li>
<li>Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+in+obesity-related+inflammation+and+insulin+resistance%3A+cells%2C+cytokines%2C+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines.</a> ISRN Inflamm. 2013, 139239(2013).</li>
<li>DeFuria, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+promote+inflammation+in+obesity+and+type+2+diabetes+through+regulation+of+T-cell+function+and+an+inflammatory+cytokine+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).</li>
<li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).</li>
<li>Han, J. M., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+in+obesity-associated+adipose+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation.</a> J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deficiency+and+pharmacological+stabilization+of+mast+cells+reduce+diet-induced+obesity+and+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice.</a> Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+effector+T+cells+contribute+to+macrophage+recruitment+and+adipose+tissue+inflammation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity.</a> Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).</li>
<li>Koh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+forms+profound+vascular+network+through+the+dynamic+reassembly+of+blood+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).</li>
<li>Peinado, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal-vascular+fraction+of+adipose+tissue+contributes+to+major+differences+between+subcutaneous+and+visceral+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots.</a> Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).</li>
<li>Leggate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+inflammatory+and+prominent+proteomic+changes+in+plasma+and+adipose+tissue+after+high-intensity+intermittent+training+in+overweight+and+obese+males%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).</li>
<li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+in+human+adipose+tissue%3A+link+with+morbid+obesity%2C+inflammatory+status%2C+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).</li>
<li>Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fats%2C+inflammation+and+insulin+resistance%3A+insights+to+the+role+of+macrophage+and+T-cell+accumulation+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nutr+Soc%22%5BJournal%5D)">Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue.</a> Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).</li>
<li>Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+macrophages%3A+phenotypic+plasticity+and+diversity+in+lean+and+obese+states%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Clin+Nutr+Metab+Care%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).</li>
<li>Wentworth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+CD11c%2BCD206%2B+adipose+tissue+macrophages+are+associated+with+insulin+resistance+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity.</a> Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).</li>
<li>Wouters, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+classical+monocytes+are+associated+with+CD11c%2B+macrophages+in+human+visceral+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue.</a> Sci Rep. 7, 42665(2017).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+contributes+to+false-positive+intracellular+Foxp3+staining+in+macrophages%3A+a+lesson+learned+from+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Bu yöntemler KDV SVF yalıtmak anlatan ve oturdu ve bu dokularda bağışıklık hücreleri göreli miktarda ölçmek. Ayrıca, belirli hücre tipleri üzerinde işaretleri ifade belirleme yöntemleri devlet.
Akış Sitometresi doku bağışıklık hücrelerinin fenotip dokuların immünolojik devlet için güçlü bir tekniktir. Doku bağışıklık hücreleri miktar birçok uygulamaları olabilir. Sonuçlar açıklandığı gibi belirli bağışıklık hücreleri (örn, vs obez yalın) hasta grupları arasında varlığı karşılaştırmak mümkündür. Buna ek olarak, aynı zamanda Akış Sitometresi aynı hastaların kan gerçekleştirerek, dolaşan hücre ve doku hücreleri arasındaki ilişkileri araştırılması. Bu uygulama ile biz monosit dolaşan belirli bir alt pro-inflamatuar CD11C ile ilişkili olduğunu belirlemek mümkün+ yağ doku makrofajlar16.
Çok sayıda mevcut floresan antikor Akış Sitometresi çok yönlü yapmak gibi ayarlamalar açıklanan protokol uygulamaları genişleyecektir. Farklı antikorlar ile neredeyse tüm hücre tiplerinin ayırt edilebilir ve birçok işaretleri ifade tespit edilebilir. Ayrıca işaretleri intracellularly floresan antikor hücre içi bağlantısına izin için hücre zarının permeabilizing tarafından leke mümkündür. Bu özellikleri ötesinde aşırı Basitleştirilmiş M1 ve M2 makrofaj alt türlerinden çok farklı makrofaj nüfusun ayrım sağlar. Yüzey marker ifade ölçümü yanı sıra, intracellularly bilgi makrofaj işlevselliği sağlayan proteinler (Yani, sitokinler) Boyanabilen. Ayrıca, nükleer silahların yayılmasına karşı işaretleri Ki67 gibi nükleer silahların yayılmasına karşı oranları ölçmek için kullanılır. Açıklandığı gibi makrofajlar ve DCs arasında ayrım DC işaretlerinin MFI düzeylerine göre. CD68 gibi bir genel makrofaj marker makrofaj Masası (FACS panel 1) dahil edilebilir. Ancak, CD68 tercih değildir ve protokol uzanacak hücre membran intracellularly gerektiren permeabilization lekeli gerekir. Diğer makrofaj işaretleri CD163 ve CD206 veya CD11c, ikincisi burada sunulan makrofaj panelinde varlık bütünleşmek gibi alt işaretleri vardır.
Bizim FACS paneller, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için bir işaretleyici dahil değildi çünkü o ölü hücreleri daha doğru bir dışlama FSC ve SSC kullanımı daha bırakmak hangi tercih olacaktır. Sık kullanılan DNA canlılığı boyalar propidium iyodür (PI) veya 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) yanı sıra ücretsiz Amin boya canlı/ölü Fixable ölü hücre leke kiti gibi farklı boya renk seçenekleri olan tepki boyama. Ancak, PI ve DAPI ne zaman hücreleri fixing kullanılamaz. İletişim kuralında açıklandığı gibi canlı/ölü Fixable kırmızı ölü hücre canlılığı boyama her iki panelleri strateji çoğunluğuna genel FACS etkilemeden entegre edilebilir.
Buna ek olarak, verileri canlı hücreleri tüm veri göreli anlamına gelir yüzdesi olarak ifade edilir. Yalnızca bir tam girerek, Akış Sitometresi hücre sayısı bilinen her hücre tipi tam numaraları belirlemek mümkün. Hücreleri yaklaşık bir sayısını SVF kesir hücrelerde sonra sayım sayım odası kullanarak hesaplanan. Ancak, bu sayı SVF ayırmak için kullanılan biyopsi doku miktarı için ayarlanacak olurdu, ama bu, obez için yalın karşılaştırırken sınırlamaları vardır. Onlar lipidler ile doldurulur ve büyük ölçüde genişlettik obez AT benzer bir kitle daha az adiposit oluşur. Bu bir küçümseme veya adipocyte, gram başına bağışıklık hücrelerinin sayı olarak gösterilmesini sağlar Eğer bağışıklık hücre sayının neden olabilir.
İnsan çalışmalarda hastaların eklenmesi genellikle büyük önem deneysel prosedürler standardizasyon yapmak zaman uzun bir süre içinde yapılır. Akış Sitometresi veri hastalar arasında karşılaştırma için birkaç seçenek vardır. Bu protokol için açıklandığı gibi hücreleri ölçüm analiz çeşitli örneklerinin aynı gün izin önce düzeltilebilir. Bu da onları boyama, boyama yordamı tüm örnekleri arasında eşit olarak sağlar ancak hücre canlılığı etkilenebilir önce SVF dondurarak elde edilebilir. Son olarak, Ayrıca bu çalışmada istihdam, tazminat düzeyleri yüklemek için floresan boncuk vardır ve sitometresi izleme boncuk iki haftada sitometresi günlük ölçümleri standartlaştırmak için kullanılmıştır. Bu son seçenek en verimli olur ne zaman uzun bir zaman aralığını kapsayan bir çalışma örnekleri ölçme.
Akış Sitometresi için kısıtlayıcı bir faktör genel Floresans kullanımıdır. Aynı anda tespit edilebilir floresan etiket sayısını emisyon spectra birbiri üzerine çakışması nedeniyle sınırlıdır. Ancak, akıllı FACS paneli geliştirme ve çeşitli antikor kokteyller KDV veya uydu örnek başına kullanımı ile bu sorun bu protokol için açıklandığı gibi üstesinden gelebilir. Önemli bir FACS paneli geliştirme FMO denetimleri yönüdür. Panelin bir dışında tüm antikorları kullanarak, FMO tam paneli ile karşılaştırırken potansiyel autofluorescence düzeyleri takdir edilebilir. Bu doğru nüfus çoğunluğuna izin verir ve yeni bir FACS panel ayarlarken bu yordamları yapılmalıdır. Buna ek olarak, yeni nesiller FACS cihazların en fazla 50 parametreleri aynı anda birçok özellikleri tespiti hücre başına izin algılayabilir. Hücreleri, özellikle makrofajlar autofluorescence floresan yönü ile ilgili başka bir sorun var. FACS lazer hücrelerle (özellikle ile 488 nm dalga boyu uyarma) uyarma sonra bu hücreleri floresan bir sinyal yayarlar (esas olarak < 640 nm) örtüşme antikor emisyon spectra ile etiketleri bu otelde17,18. Bunun için hesabınıza, günahı hücreleri her kanaldaki autofluorescence belirlemek için ölçülmelidir. Bu bilgiyle, fluorochromes autofluorescent sinyal aşan bir sinyal gücü görüntüleyen seçilmesi gerekir. Bu autofluorescent arka plan sinyal nüfusun gating stratejisi belirlerken dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, bu protokolü ve akıllı FACS panel tasarım uygulama tarafından derinlik fenotip makrofaj alt içinde mümkündür. Yeni farklı AT makrofajlar ve işlevlerine ile karakterizedir.

Obezite ile düşük dereceli AT ile karakterize iltihap1 ve pro-inflamatuar bağışıklık hücreleri (KDV, oturdu), visseral ve subkutan infiltrasyonu. Pro-inflamatuar bağışıklık hücreleri KDV birikimi tip 2 diyabet2geliştirmek için birincil bir risk faktörü olan insülin direnci yol açar. Doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sisteminin bağışıklık hücreleri makrofajlar, nötrofiller, mast hücreleri gibi obez AT CD4 bulunur+ ve CD8+ T-hücre ve B-hücreleri3,4,5,6 ,7. Endotel hücreleri, stromal hücreler, adipocyte ataları, fibroblastlar ve perisitlerden, bu bağışıklık hücreleri SVF8 oluşturmaktadır ve AT9pro-inflamatuar maddeler ana kaynaktır.
AT inflamatuar durumunu yaygın olarak Western blot10, qPCR11ve immünhistokimya11gibi teknikleri tarafından araştırıldı. Ancak, bu teknikler, tüm AT, adipositler ve SVF kullanıldığında kullanılır. Bu zor tutar ve bağışıklık hücreleri AT mevcut alt kümelerine belirlemek yapar. Bağışıklık hücreleri tanımlamak ve onları, makrofajlar gibi kategorilere ayırmak için çeşitli hücre işaretleri var. Makrofajlar önemli heterojenite içinde işlev ve hücre yüzey marker ifade12i göster. Bu nedenle, sık sık iki makrofaj nüfus kategorize edilir: M1 ve M2. M2 makrofajlar genellikle alternatif olarak aktif makrofajlar12,13 denir ve yalın, metabolik olarak normal insanlar14AT bulunur. Ancak, obezite sırasında fenotipik anahtarı M2 makrofajlar M1 makrofajlar için oluşur. Bunlar klasik makrofajlar CD11C12 hızlı ve ölü adiposit taç benzeri yapıları13oluşturmak üzere birikir M1 aktif. Bu gösterilmiştir o CD11C+ AT makrofajlar insülin eylem zayıflatabilir ve obez insanlar15insülin direnci ile ilişkili. AT M1 ve M2 makrofajlar tanımlamak için immünhistokimya bir seçenektir. Bu teknik doku makrofajlar konumu hakkında bilgi verir. Ancak, bir boyama kullanılan işaretleri sayısı sınırlar. Ayrıca, ölçmek zordur. Bu nedenle, farklı bağışıklık hücre alt kümeleri KDV ve uydu mevduat araştırmak için biz bir Akış Sitometresi yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım bize hücre alt kümeleri tanımlamak ve her alt AT yataklarında mevcut sayıları saymak için bir Akış Sitometresi Analizi ile hücre başına birden çok işaretçileri kullanmak için fırsat verir.

<table><tbody><tr><td>Santrifüj</td><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>5660</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)-Jambon' s F12</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum Sigma</td><td>Aldrich'ten</td><td>Kollajenaz XI C7657-1g</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1g</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I sığır pankreasından</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Merck</td><td>1.01145.0500</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu</td><td>Albümin Sigma Aldrich</td><td>A4503-100</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Merck</td><td>1.06688.0100</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; M şırınga Filcons</td><td>BD Biosciences</td><td>340613</td><td></td></tr><tr><td>70 & M filtresi</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>Fc bloğu / insan IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14506</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Merck</td><td>1.04003.2500</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV421</td><td>Biolegend</td><td>301324</td><td></td></tr><tr><td>CD19-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555412</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>561807</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-Fitc</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>CD56-Fitc</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>562794</td><td></td></tr><tr><td>CD11C-APC-CY7</td><td>Biyoefsane</td><td>337218</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE-CY7</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>557748</td> CD19-BV421 Biyoefsane 302234 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3-V500</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>561416</td><td></td></tr><tr><td>CD56-APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300528</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>641400</td><td></td></tr><tr><td>CD303-PE</td><td>Biolegend</td><td>354204</td><td></td></tr><tr><td>CD141-APC</td><td>Biolegend</td><td>344106</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 v-şekilli kuyu plakası</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td></td>651101</tr><tr><td>PBS PH 7.4</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüpü 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp</td> İnsan serumundan <td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sıçan Ig, &kappa;/Negatif Kontrol Kompanzasyon Parçacıkları Seti</td><td>BD Biosciences 552844</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare Ig, &kappa;/Negatif Kontrol Kompanzasyon Parçacıkları Seti</td><td>BD Biosciences</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Kırmızı Ölü Hücre Leke Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>L23102</td><td></td></tr><tr><td>IKA&nbsp;MS 3 temel çalkalayıcı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z645028-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

akış sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Subkutan ve viseral Yağ dokusundan (AT) mevduat bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu tip 2 diyabet gibi obezite ile ilişkili komplikasyonların gelişmesine katkıda bulunan bir düşük dereceli iltihabı neden olur. Nicelik ve nitelik itibariyle mevduat insan bağışıklık hücre alt kümeleri araştırmak için bir Akış Sitometresi yaklaşım geliştirdik. Stromal vasküler kesir (SVF), bağışıklık hücreleri içeren subkutan ve visseral biyopsi, collagenase sindirim tarafından izole edilmiştir. Adiposit Santrifüjü sonra kaldırılır. SVF hücreleri bağışıklık hücre alt kümeleri arasında ayırt etmek için seçilen ve Akış Sitometresi kullanılarak analiz birden çok membran bağlı işaretler için lekeli. Bu yaklaşım, pro ve anti inflammatory makrofaj alt kümeleri, bir sonucu olarak dendritik hücreler (DCs), B-hücreleri, CD4+ ve CD8+ T-hücreleri, ve NK hücreleri tespit ve sayılabilir. Bu yöntem AT bağışıklık hücreleri ve her belirli alt miktarı hakkında ayrıntılı bilgi verir. Mevcut çok sayıda floresan antikor olduğundan, Akış Sitometresi yaklaşımımız çeşitli diğer hücresel ve hücre içi işaretleri ilgi ölçmek için ayarlanabilir.

KDV'den izole ve oturdu SVF Akış Sitometresi kullanılarak ölçüldü. Akış Sitometresi ölçümleri hücresel işaretleri (şekil 1A ve 1B) göre farklı hücre popülasyonlarının gösterilen araziler oluşturmak. İlk olarak, komplo tarafından ileri genişliği (FSC-W) dağılım ve toplamları daha fazla analiz tek hücre düşük FSC-W. çoğunluğuna tarafından elimine edilebilir dağılım alanı (FSC-A), hücre ileri Sonraki, canlı hücreler seçilir ve hücresel enkaz hariç, doğru boyut ve karmaşıklık FSC kullanarak hücreleri çoğunluğuna tarafından-bir ve yan dağılım alanı (SSC-A), anılan sıraya göre. Ölü hücreleri küçük ve bu nedenle ayrı bir nüfus olarak görünür küçük bir ile FSC-A. Sonraki, bağışıklık hücreleri pan-lökosit işaretçiyi CD45 (Panel 1 ve 2, şekil 1A) kullanımı ile seçildi. Diğer bağışıklık hücreleri T hücreleri gibi (CD3), B-hücreleri (CD19), nötrofiller makrofajlar analiz etmek için (CD66b+ CD11b+), ve NK hücreleri (CD56) farklı antikorlar bu hücreler hedefleme kullanarak ama aynı ile daha fazla çözümleme hariç fluorochrome. Kalan hücrelerin daha fazla alt bölümü CD11b ve CD11c ifadesine dayanıyordu. Bu aşağıdaki nüfus sonuçlandı: CD11b+ CD11c+ makrofajlar, CD11b+ CD11c- makrofajlar ve CD11bdüşük /- CD11c+ DCs (FACS Masası 1, şekil 1B). Ortalama Floresans yoğunluğu (MFI) ölçümü izin CD303 ifade miktar (plazmasitoid DC marker) ve CD141 (DC marker), CD11b üzerinde+ CD11c+ makrofajlar ve CD11bdüşük /- CD11c+ DCs. Her iki işaretleyiciyi de ifade edildi CD11b içinde daha yüksekdüşük /- CD11c+ hücreleri onaylayan bu CD11bdüşük /- CD11c+ hücreleri olduğunu DCs (şekil 1 c).
CD45+ hücreleri (şekil 1A) T-hücre ve B-hücre ayrıldı CD3 ve CD19, sırasıyla kullanarak. T-hücreleri T yardımcı hücreleri alt (CD4+) ve sitotoksik T-hücreleri (CD8+). Son olarak, CD3-CD19-hücreler NK hücreleri işaretçisi CD56 kullanarak ölçmek için çizilen (FACS panel 2, şekil 1 d). Her kapı hücre sayısı sayısal ve bütün canlı hücreler (Tablo 3) bu hücre türü yüzdesini hesaplamak için kullanılabilir.
Tüm ortalama hesaplama sağlayan her konu grubu içinde örneğin özel bir bağışıklık hücreye, Yani, pro-inflamatuar CD11b bolluk görüntüleme yağsız ya da obez erkek konular için canlı hücreler yüzdesi hesaplanabilir+ CD11c+ makrofaj visseral AT içinde (Şekil 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig1.jpg"> Şekil 1. Strateji visseral yağ dokusunun çoğunluğuna FACS. (A) FACS arsa ileri dağılım genişliği yoğunluğu (FSC-G) ve (FSC-A) tarafından bir FACS komplo takip sadece tek hücreleri (kırmızı) seçmek için bir kapı içeren ileri dağılım alan yoğunluğu ile tüm olayların (siyah) dayalı FSC-A ve yan dağılım alan yoğunluğu üzerinde (SSC-A) canlı hücreleri (açık yeşil) seçerek bir kapı içeren. Sonraki SSC-A ile arsa ve CD45 floresan yoğunluğu içeren tüm CD45 seçerek bir kapı+ (bağışıklık) hücreleri (mavi). (B) FACS CD19, CD3, CD66b ve CD56 floresan yoğunluğu CD11b floresan yoğunluğu ve CD19, CD3, CD66b ve CD56 negatif tüm hücreleri seçmek için bir kapısı (kahverengi) daha fazla nüfus lige karşı bir komplo. Sonraki komplo CD11b ve CD11c floresan yoğunluğu dayalı olarak daha fazla alt bölümü. Gates CD11b içeren görüntülenir+ CD11c+ makrofajlar (koyu yeşil), CD11b+ CD11c- makrofajlar (mor) ve CD11bdüşük /- CD11c+ dendritik hücreler (mavi). (C) CD11b tutarı+, CD11c+, veya CD11bdüşük /- CD11c+ CD303 ve CD141 ve ortalama karşılık gelen miktar için floresan yoğunluğu (x ekseni) düzeylerinin görüntüleme hücreleri (y ekseni) Floresan yoğunluğu (MFI). Önceki CD45 görüntüleme (D) FACS arsa+ için her iki CD3 T-hücreleri (macenta), B-hücreleri (koyu yeşil) ve sigara autofluorescent hücreleri (yeşil) negatif seçme gates içeren CD3 ve CD19 floresan yoğunluğu dayalı nüfus (mavi) ve CD19. Aşağıdaki çizim CD4 ve CD8 Floresans CD4 seçme gates ile dayanır+ (açık yeşil) ve CD8+ (macenta) T-hücreleri. Aynı bir perdeleme strateji deri altı yağ dokusu için kullanılır. Aynı bir perdeleme strateji deri altı yağ dokusu için kullanılır. Bu rakam Wouters vd değiştirildi 16 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig2.jpg"> Şekil 2. Obez KDV içeren daha fazla pro-inflamatuar makrofajlar. CD11b miktarı+ CD11c+ makrofajlar tüm canlı hücreler yalın ve obez erkeklerin KDV yüzdesi olarak sundu. Tüm veri anlamına gelir ± SEM vardır; n = 20 için yalın ve n = 31 için obez. p ≤ 0,01 yalın vs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hedef</td>
			<td>Tanım hedef</td>
			<td>Mevcut</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Miktar</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11B</td>
			<td>myeloid integrin marker</td>
			<td>granülosit, monosit/makrofajlar, dendritik hücrelerdüşük ve doğal katil hücreler</td>
			<td>BV421</td>
			<td>2.5 ΜL</td>
			<td>ICRF44</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>ortak B hücresi antijen</td>
			<td>Blastoid B hücre ve plazma B hücre için pro-B hücre b hücre gelişimi</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>ortak T hücre antijen</td>
			<td>T lenfositler, doğal katil T hücreleri ve timositleri</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD66B</td>
			<td>carcinoembryonic antijen (CEA) üyesi-glikoprotein ailesi gibi</td>
			<td>granülosit</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>G10F5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>ağır glikozile yapışma protein</td>
			<td>doğal katil hücreler ve doğal katil T hücreleri</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>B159</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD303</td>
			<td>tip II transmembran glikoprotein</td>
			<td>plazmasitoid dendritik hücreler</td>
			<td>PE</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>201</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD141</td>
			<td>thrombomodulin</td>
			<td>monosit/makrofajlardüşük, dendritik hücre subpopulation</td>
			<td>APC</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>M80</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C</td>
			<td>transmembran glikoprotein yazın; integrin αx</td>
			<td>monosit/makrofajlar, dendritik hücreler, granülosit, doğal katil hücreler, B ve T hücre alt grubunu</td>
			<td>APC-Cy7</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
			<td>Bu15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>ortak lökosit antijen</td>
			<td>lenfosit, monosit, granülosit, eozinofil ve timositleri dahil olmak üzere tüm insan lökosit</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS arabellek</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Antikor için kokteyl FACS panel alt kümeleri makrofaj ve dendritik hücreler örneğin alınma olasılığını belirlemek için 1. Bir örnek analiz için açıklanan antikor miktarıdır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hedef</td>
			<td>Tanım hedef</td>
			<td>Mevcut</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Miktar</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>ortak B hücresi antijen</td>
			<td>Blastoid B hücre ve plazma B hücre için pro-B hücre b hücre gelişimi</td>
			<td>BV421</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>ortak T hücre antijen</td>
			<td>T lenfositler, doğal katil T hücreleri ve timositleri</td>
			<td>V500</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>ağır glikozile yapışma protein</td>
			<td>doğal katil hücreler ve doğal katil T hücreleri</td>
			<td>APC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>HCD56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>Ig süper, tip ı transmembran glikoprotein</td>
			<td>T yardımcı hücresi, timositleri, monosit/makrofajlar, tip II doğal katil T hücreleri</td>
			<td>PerCP-Cy5.5</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>RPA-T4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>Α-alt disülfür bağlı bimolecular kompleks</td>
			<td>sitotoksik T hücreleri, timositleri, doğal katil hücre alt grubunu</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>ortak lökosit antijen</td>
			<td>lenfosit, monosit, granülosit, eozinofil ve timositleri dahil olmak üzere tüm insan lökosit</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS arabellek</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. Antikor için kokteyl FACS paneli 2T ve B hücre popülasyonlarının tanımlamak için. Bir örnek analiz için açıklanan antikor miktarıdır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Makrofaj paneli</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Geçidi adı</td>
			<td># Hücreleri</td>
			<td>% canlı</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tek hücre</td>
			<td>183054</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>canlı</td>
			<td>10477</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>4100</td>
			<td>39.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>döküm-
</td>
			<td>771</td>
			<td>7,36</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C- CD11B+
</td>
			<td>430</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B+
</td>
			<td>104</td>
			<td>0,99</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11Bdüşük /-
</td>
			<td>15</td>
			<td>0,14</td>
		</tr>
<tr>
<td>T-hücre, B-hücresi, NK hücre paneli</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Geçidi adı</td>
			<td>#Cells</td>
			<td>% canlı</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tek hücre</td>
			<td>34616</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Canlı</td>
			<td>3728</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45+
</td>
			<td>1589</td>
			<td>42.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>NK hücreleri</td>
			<td>29</td>
			<td>0.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3+
</td>
			<td>953</td>
			<td>25,56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4+
</td>
			<td>40'lı</td>
			<td>16.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8+
</td>
			<td>328</td>
			<td>8.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19+
</td>
			<td>20</td>
			<td>0.54</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3. Farklı hücre tipleri KDV bağışıklık Hücre bolluğu. Her kapı hücre sayısı ve farklı hücre tipleri yüzdesi dayalı canlı hücreler toplam miktarı.

Bu makalede bağışıklık hücreleri yağ dokusu ve daha sonraki analiz Akış Sitometresi kullanarak yalıtım tarafından yağ dokusu bağışıklık hücre içeriğini analiz etmek için bir yöntem.

Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Bu prosedürün genel amacı, yağ dokusu içinde bulunan farklı bağışıklık hücresi popülasyonlarının fenotiplemesi için insan yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyonu izole etmek için akış sitometrisi kullanmaktır. Bu yöntem, obez bireylerin yağ dokusunda hangi bağışıklık hücrelerinin biriktiği ve ne ölçüde biriktiği gibi metabolik araştırmalardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bağışıklık hücreleri üzerindeki çoklu belirteçlerin aynı anda ölçülmesine ve bu bağışıklık hücrelerinin yağ dokusunda tanımlanmasına ve miktarının belirlenmesine izin vermesidir.Bu teknik, yağ dokusu iltihabı hakkında çok önemli bilgiler sağlayabilse de, diğer organ ve dokulara da uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, boyama işlemi sırasında esas olarak stromal vasküler hücre kontaminasyonu ve hücre kaybı ile mücadele edeceklerdir. Doktora adaylarımdan ikisi, Suzan Wetzels ve Mitchell Bijnen, protokolü uygulayacaklar.Bir gram yağ dokusu biyopsisini yaklaşık iki milimetre karelik parçalar halinde kıymak için bir neşter kullanarak başlayın. Parçaları 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve numunelere 10 mililitre kollajenaz çözeltisi ekleyin. Doku parçalarını dakikada 60 döngüde 37 santigrat derece su banyosunda 60 dakika inkübe edin.Ardından 200 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe filtrasyon yapılır. Santrifüjlemeden önce filtreyi yedi mililitre PBS ile durulayın. Ardından, tüm pipet ucunu çözeltiye batırmadan süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın.Pelet açıkça görülebilir olmalı ve stromal vasküler fraksiyonun yağ hücreleri ile kontaminasyonunu önlemek için neredeyse tüm süpernatanı çıkarmalıdır. Stromal vasküler hücre peletini beş mililitre taze PBS ile askıya alıyoruz ve stromal vasküler fraksiyonu 70 mikrometrelik bir süzgeçten geçirerek yeni bir tüpe filtreliyoruz. Santrifüjlemeden sonra, yıkanmış stromal vasküler fraksiyon peletini üç mililitre eritrosit lizis tamponunda buz üzerinde beş dakika süreyle askıya alıyoruz.Daha sonra lizisi yedi mililitre PBS ile durdurun ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Akış sitometrik analizi için stromal vasküler fraksiyonu boyamak için, peleti 90 mikrolitre dört santigrat derece floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamasında veya FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve spesifik olmayan boyamayı on mikrolitre insan IgG ile bloke edin. Hücre süspansiyonunu 96 oyuklu v tabanlı bir plakanın iki oyuğu arasında bölün ve hücreleri 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.İnkübasyonun sonunda, her bir numuneyi 100 mikrolitre FACS tamponu ile yıkayın ve santrifüjlemenin sonunda süpernatanları atmak için plakayı dokunmadan tek bir yumuşak hareketle ters çevirin. İşlem sırasında hücrelerinizin kaybını önlemek için ters çevirmeden önce plakanın altındaki peleti net bir şekilde görebildiğinizden emin olun. İlk peleti birinci FACS paneli için 29.5 mikrolitre antikor kokteyli içinde ve ikinci peleti ikinci FACS paneli için 23 mikrolitre antikor kokteyli içinde yeniden süspanse edin.Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika geçirdikten sonra, hücreleri oyuk başına 150 mikrolitre FACS tamponu ile yıkayın ve hücre peletlerini 150 mikrolitre yüzde bir formaldehit çözeltisine sabitleyin. Hücre süspansiyonlarını her bir kuyucuktan uygun karşılık gelen FACS tüplerine aktarın ve numuneleri buz üzerine yerleştirin. Analizlerinden önce, ileri saçılma ve yan saçılma parametrelerini ayarlamak için akış sitometresine lekelenmemiş, negatif bir kontrol yükleyin.Ardından, akış sitometresinin voltajlarını, ilgilenilen tüm popülasyonlar ileri saçılma ve yan saçılma grafiklerinde görünene ve kalıntı ile canlı hücreler arasında bir ayrım yapılana kadar üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandığında, hücreleri tamamen yeniden süspanse etmek ve numuneyi sitometreye yüklemek için ilk deneysel numuneyi 800 rpm'de vorteksleyin. Canlı kapıda en az 50.000 olay okuyun, ardından girdap yapın ve az önce gösterildiği gibi analiz için ikinci örneği yükleyin.Bu temsili deneyde yağ dokusu makrofaj popülasyonlarının analizine izin vermek için, CD11b + CD11c + makrofajlar, CD11B + CD11C-makrofajlar ve CD11Blow-CD11C + dendritik hücrelerin varlığını ortaya çıkarmak için T hücreleri, B hücreleri, nötrofiller ve doğal öldürücü hücreler gibi diğer bağışıklık hücreleri hariç tutuldu. Bu hücrelerin ana floresan yoğunluğunun nicelleştirilmesi, CD11B + CD11C + ve CD11Blow-CD11C + hücreleri üzerinde plazma sitoid dendritik hücre ve jenerik dendritik hücre belirteçlerinin ekspresyonunu ortaya çıkardı ve CD11Blow-CD11C + hücrelerinde gözlenen her iki markörün daha yüksek bir ekspresyonu, CD11Blow-CD11C + hücrelerinin aslında dendritik hücreler olduğunu doğruladı. CD45 pozitif hücrelerin geçitlenmesi, CD19 pozitif B ve CD3 pozitif T hücre popülasyonlarını ortaya çıkardı, bunların sonuncusu ayrıca CD3 + CD4 + T yardımcısı ve CD3 + CD8 + sitotoksik T hücresi alt kümeleri ve CD3-CD56 + doğal öldürücü hücrelere bölünebilir.Canlı bağışıklık hücrelerinin yüzdesi daha sonra her denek için hesaplandı ve obez yetişkin erkek deneklerin viseral yağ dokusundaki pro-inflamatuar CD11B + CD11C + makrofajların yüzdesinde önemli bir artış olduğunu ortaya koydu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yürütülürse dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tamponları ve hücre fraksiyonlarını buz üzerinde tutmak önemlidir ve hücreleri antikorlarla etiketlerken onları karanlıkta tutmak çok önemlidir.Geliştirildikten sonra, bu teknik, metabolik araştırma alanındaki araştırmacıların, insanların yağ dokusundaki bağışıklık hücresi değişikliklerini keşfetmelerine izin verdi. Bu videoyu izledikten sonra, yağ dokusu bağışıklık hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve bu hücreler üzerinde akış sitometrisinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. Potansiyel olarak bulaşıcı insan materyali ve formaldehit gibi tehlikeli olabilecek maddelerle çalıştığınızı unutmayın.Her zaman eldiven ve koruyucu gözlük takarak önlem alın.

characterization-immune-cells-human-adipose-tissue-using-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Yağ dokusu (AT) yoğun bağışıklık hücre aktivasyonu ve etkileşim bir sitedir. Bağışıklık sisteminin hemen hemen tüm hücreleri AT mevcut olan oranını obezite etkilenir. Bağışıklık hücre popülasyonlarının AT uygun izolasyon, miktar ve karakterizasyonu immunometabolic hastalık rolleri anlamak için önemlidir.

Yağ Doku Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Bu çalışma, in vitro dendritik hücreler (DC'ler) elde etmek için iki farklı insan monosit izolasyonu yöntemini karşılaştırmaktadır. Monositler yapışma ile seçilir veya manyetik ayırma ile negatif olarak zenginleştirilir. Monosit verimi ve canlılığı ile MDDC canlılığı, proliferasyonu ve CD11c/CD14 yüzey marker ekspresyonu her iki yöntem arasında karşılaştırılacaktır.

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Burada monosit alt kümeleri tam kan akış sitometresi tarafından karakterize için bir iletişim kuralı mevcut. Bu nasıl alt kümeleri kapı ve onların ifade yüzey işaretlerinin değerlendirmek özetleyen ve M1 (iltihabi) ve M2 işaretleri (anti-inflamatuar) ifadesi değerlendirme bir örnek vererek içerir.

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Alkolsüz steatohepatiti için basit ve güvenilir bir diyet kaynaklı kemirgen hayvan modeli (NASH) tarif edilir, hayvanlar ve özel bir yüksek yağ diyet uygulanması SPF olmayan konut aracılığıyla elde. Biz karaciğer ve adipoz immün hücre alt kümeleri tanımlamak için insan immünolojik koşulları farları çevresel mikroplar maruz tarafından yeniden tanımlamakta.

Tip 2 diyabet ile Ilişkisi olmayan alkollü steatohepatit için gelişmiş bir Murine modeli

Burada, kapalı bir sistem cihazı kullanarak insan yağ dokusu enzimsiz mikro-parçalanma sıyoruz. Bu yeni yöntem, in vivo transplantasyon, in vitro kültür ve daha fazla hücre izolasyonu ve karakterizasyonu için uygun yağ dokusunun milimetre altı kümelerinin elde edilmesine olanak sağlar.

Hücre Fenotimi ve Sekretom Karakterizasyonu için İnsan Yağ Dokusu Mikro-parçalanma

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

Bu protokol, adipositlerden yüksek kaliteli RNA elde etme metodolojisi ve akış sitometrisi ile analiz için çoklu membrana bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF-makrofajların fenotipleştirilmesi dahil olmak üzere, canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon-SVF hücrelerinin insan viseral yağından tek bir işlemde izolasyonu için etkili bir kollajenaz sindirim yöntemi sağlar.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Bu çalışmada, murin solunum sisteminin immün popülasyonlarını izole etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, 9 renk tabanlı bir akış sitometri paneli kullanarak, sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan tüm doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.

Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi

Burada, insan deri altı yağ dokusundan (hSATMVEC'ler) mikrovasküler endotel hücrelerinin izole edilmesi, kültürlenmesi ve fenotiplendirilmesi için bir protokol tanımlanmıştır. Ek olarak, deneysel bir hSATMVEC-adiposit çapraz konuşma modelini açıklıyoruz.

İnsan Subkutan Yağ Dokusunda Adipoz Endotel Hücresi/Adiposit Çapraz Konuşmasının İncelenmesi

Öğrenin, akış sitometresi ile insan yağ dokusundan bağışıklık hücrelerini izole etme ve fenotipleme yöntemini. Bu protokol, obeziteyle ilişkili metabolik hastalıklarda immün hücre popülasyonlarını nicel ve nitel olarak analiz etmenizi sağlar.

Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet