Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, yağ dokusu içinde bulunan farklı bağışıklık hücresi popülasyonlarının fenotiplemesi için insan yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyonu izole etmek için akış sitometrisi kullanmaktır. Bu yöntem, obez bireylerin yağ dokusunda hangi bağışıklık hücrelerinin biriktiği ve ne ölçüde biriktiği gibi metabolik araştırmalardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bağışıklık hücreleri üzerindeki çoklu belirteçlerin aynı anda ölçülmesine ve bu bağışıklık hücrelerinin yağ dokusunda tanımlanmasına ve miktarının belirlenmesine izin vermesidir.

Bu teknik, yağ dokusu iltihabı hakkında çok önemli bilgiler sağlayabilse de, diğer organ ve dokulara da uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, boyama işlemi sırasında esas olarak stromal vasküler hücre kontaminasyonu ve hücre kaybı ile mücadele edeceklerdir. Doktora adaylarımdan ikisi, Suzan Wetzels ve Mitchell Bijnen, protokolü uygulayacaklar.

Bir gram yağ dokusu biyopsisini yaklaşık iki milimetre karelik parçalar halinde kıymak için bir neşter kullanarak başlayın. Parçaları 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve numunelere 10 mililitre kollajenaz çözeltisi ekleyin. Doku parçalarını dakikada 60 döngüde 37 santigrat derece su banyosunda 60 dakika inkübe edin.

Ardından 200 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe filtrasyon yapılır. Santrifüjlemeden önce filtreyi yedi mililitre PBS ile durulayın. Ardından, tüm pipet ucunu çözeltiye batırmadan süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın.

Pelet açıkça görülebilir olmalı ve stromal vasküler fraksiyonun yağ hücreleri ile kontaminasyonunu önlemek için neredeyse tüm süpernatanı çıkarmalıdır. Stromal vasküler hücre peletini beş mililitre taze PBS ile askıya alıyoruz ve stromal vasküler fraksiyonu 70 mikrometrelik bir süzgeçten geçirerek yeni bir tüpe filtreliyoruz. Santrifüjlemeden sonra, yıkanmış stromal vasküler fraksiyon peletini üç mililitre eritrosit lizis tamponunda buz üzerinde beş dakika süreyle askıya alıyoruz.

Daha sonra lizisi yedi mililitre PBS ile durdurun ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Akış sitometrik analizi için stromal vasküler fraksiyonu boyamak için, peleti 90 mikrolitre dört santigrat derece floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamasında veya FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve spesifik olmayan boyamayı on mikrolitre insan IgG ile bloke edin. Hücre süspansiyonunu 96 oyuklu v tabanlı bir plakanın iki oyuğu arasında bölün ve hücreleri 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.

İnkübasyonun sonunda, her bir numuneyi 100 mikrolitre FACS tamponu ile yıkayın ve santrifüjlemenin sonunda süpernatanları atmak için plakayı dokunmadan tek bir yumuşak hareketle ters çevirin. İşlem sırasında hücrelerinizin kaybını önlemek için ters çevirmeden önce plakanın altındaki peleti net bir şekilde görebildiğinizden emin olun. İlk peleti birinci FACS paneli için 29.5 mikrolitre antikor kokteyli içinde ve ikinci peleti ikinci FACS paneli için 23 mikrolitre antikor kokteyli içinde yeniden süspanse edin.

Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika geçirdikten sonra, hücreleri oyuk başına 150 mikrolitre FACS tamponu ile yıkayın ve hücre peletlerini 150 mikrolitre yüzde bir formaldehit çözeltisine sabitleyin. Hücre süspansiyonlarını her bir kuyucuktan uygun karşılık gelen FACS tüplerine aktarın ve numuneleri buz üzerine yerleştirin. Analizlerinden önce, ileri saçılma ve yan saçılma parametrelerini ayarlamak için akış sitometresine lekelenmemiş, negatif bir kontrol yükleyin.

Ardından, akış sitometresinin voltajlarını, ilgilenilen tüm popülasyonlar ileri saçılma ve yan saçılma grafiklerinde görünene ve kalıntı ile canlı hücreler arasında bir ayrım yapılana kadar üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandığında, hücreleri tamamen yeniden süspanse etmek ve numuneyi sitometreye yüklemek için ilk deneysel numuneyi 800 rpm'de vorteksleyin. Canlı kapıda en az 50.000 olay okuyun, ardından girdap yapın ve az önce gösterildiği gibi analiz için ikinci örneği yükleyin.

Bu temsili deneyde yağ dokusu makrofaj popülasyonlarının analizine izin vermek için, CD11b + CD11c + makrofajlar, CD11B + CD11C-makrofajlar ve CD11Blow-CD11C + dendritik hücrelerin varlığını ortaya çıkarmak için T hücreleri, B hücreleri, nötrofiller ve doğal öldürücü hücreler gibi diğer bağışıklık hücreleri hariç tutuldu. Bu hücrelerin ana floresan yoğunluğunun nicelleştirilmesi, CD11B + CD11C + ve CD11Blow-CD11C + hücreleri üzerinde plazma sitoid dendritik hücre ve jenerik dendritik hücre belirteçlerinin ekspresyonunu ortaya çıkardı ve CD11Blow-CD11C + hücrelerinde gözlenen her iki markörün daha yüksek bir ekspresyonu, CD11Blow-CD11C + hücrelerinin aslında dendritik hücreler olduğunu doğruladı. CD45 pozitif hücrelerin geçitlenmesi, CD19 pozitif B ve CD3 pozitif T hücre popülasyonlarını ortaya çıkardı, bunların sonuncusu ayrıca CD3 + CD4 + T yardımcısı ve CD3 + CD8 + sitotoksik T hücresi alt kümeleri ve CD3-CD56 + doğal öldürücü hücrelere bölünebilir.

Canlı bağışıklık hücrelerinin yüzdesi daha sonra her denek için hesaplandı ve obez yetişkin erkek deneklerin viseral yağ dokusundaki pro-inflamatuar CD11B + CD11C + makrofajların yüzdesinde önemli bir artış olduğunu ortaya koydu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yürütülürse dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tamponları ve hücre fraksiyonlarını buz üzerinde tutmak önemlidir ve hücreleri antikorlarla etiketlerken onları karanlıkta tutmak çok önemlidir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, metabolik araştırma alanındaki araştırmacıların, insanların yağ dokusundaki bağışıklık hücresi değişikliklerini keşfetmelerine izin verdi. Bu videoyu izledikten sonra, yağ dokusu bağışıklık hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve bu hücreler üzerinde akış sitometrisinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. Potansiyel olarak bulaşıcı insan materyali ve formaldehit gibi tehlikeli olabilecek maddelerle çalıştığınızı unutmayın.

Her zaman eldiven ve koruyucu gözlük takarak önlem alın.