Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, yağ asitlerinin bir kısmında veya tamamında bulunan lipozomları hazırlamak, saflaştırmak ve kullanmaktır. Bu yöntem, sentetik biyoloji ve minimal hücrelerin tanımlanması ve yapay protohücrelerin oluşturulması gibi yaşamın kökeni çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokolün ana avantajı, yüksek verimli monodispers yağ asidi vezikülleri üretmek ve bunları bir dizi deneysel koşulda işlemek için kolay ve ucuz bir yol sunmasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, yağ asidi veziküllerinin fosfolipid veziküllerinden daha hassas olması nedeniyle, özellikle de Kurutulmuş lipitlerin ince filmlerini hazırlamak için, kloroformdaki belirli bir miktarda lipiti bir cam şişeye aktarmak için gaz geçirmez şırıngalar kullanın. Çeker ocakta bir nitrojen veya argon akışı altında kloroformu buharlaştırın. Elde edilen ince filmi, kalan kloroformu çıkarmak için en az iki saat ev vakumuna tabi tutun.

Lipid bu noktada gece boyunca vakum altında bırakılabilir. Vezikülleri yeniden sulandırmak için, 250 mikrolitre hidrasyon tamponunu boş bir tüpe pipetleyin, ardından son 75 milimolar baz için 1.875 mikrolitre 10 molar sodyum hidroksit ekleyin. Toplam yağ asidi konsantrasyonu 0.15 molar olan veziküller oluşturmak için çözeltiyi ince kuru lipit filmine aktarın, ardından elde edilen karışımı dört ila beş saniye boyunca girdaplamak için yüksek hızlı bir girdap kullanın.

Gece boyunca yeniden sulandırmak için lipid tampon karışımını düşük hızlı dönen bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Tek tip boyutta veziküller oluşturmak için, lipozom ekstrüderinin şırınga portlarının her bir iç yüzeyine bir filtre desteği uygulamak için cımbız kullanın. Her filtre desteğini 250 milimolar Tris-HCL pH 8 ile ıslatın.

Cımbız kullanarak, ekstrüder o-ringlerinden ve filtre desteklerinden birine 100 nanometre polikarbonat membrana bir parça aşındırma uygulayın. Membranı yırtmamaya veya delmemeye dikkat ederek, iki yüzey arasında iyi bir temas sağlamak için membranı nazikçe o-ringin içine itin. Ardından, membranı ve filtre desteklerini yerinden çıkarmamaya dikkat ederek ekstrüderi monte edin.

Bir ekstrüder şırıngasını yaklaşık 0,5 mililitre 250 milimolar Tris-HCL pH 8 ile doldurun. Bu şırıngayı ekstrüderin bir tarafına yerleştirin. Ekstrüderin diğer tarafına boş bir şırınga yerleştirin.

Pistonu ve şırınga içeren tamponu elinizle yavaşça itin ve direncin hissedildiğini doğrulayın, bu da rayla kazınmış zarın yerinde ve sağlam olduğunu gösterir. Beklenen direnç seviyesini ölçmek için bu adımı yerinde bir zar olmadan uygulamak faydalı olacaktır. İki şırıngayı çıkarın ve boşaltın.

Bu aşamada iki şırınganın temizlenmesi gerekli değildir, çünkü bunlar lipozom preparatı ile aynı bileşime sahip bir tampon içerir. Ardından, lipozom preparatını iki şırıngadan birine yükleyin. Ekstrüderi, sol tarafta vezikül örneğini içeren şırınga ve sağ tarafta boş bir şırınga ile yeniden monte edin.

Daha sonra vezikül örneğini içeren şırınganın pistonunu elle çok yavaş bir şekilde itin. Ekstrüderin sağ tarafındaki şırıngayı dikkatlice inceleyin. Berrak tampon, ekstrüderin iç ölü hacmi nedeniyle başlangıçta ekstrüderin sağ tarafına girecek, ardından küçük bir ekstrüde lipozom tüyü izleyecektir.

Bu noktada hemen itmeyi bırakın. Ekstrüderin sağ tarafındaki şırıngayı çıkarın ve çözeltiyi atın. Ekstrüderin sağ tarafındaki şırıngayı değiştirin ve sol şırınga boşalana kadar ekstrüzyon yapın.

Ekstrüderin yönünü tersine çevirin ve şırınga değişimini tekrarlayın. İstenilen döngü sayısı için devam edin. Lipozomların, orijinal olarak ekstrüde edilmemiş lipozomlar içeren şırıngadan toplanmamasını sağlamak için her zaman tek bir sayı kullanılır.

Son olarak, sağ şırınganın içeriğini nazikçe bir Eppendorf tüpüne dağıtın. Tüpü yaklaşık 30 dakika boyunca düşük hızda dönen bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Vezikül saflaştırma mobil fazını hazırlamak için, 15 mililitrelik bir Falcon tüpünde beş mililitre 250 milimolar Tris-HCL pH 8 hidrasyon tamponu hazırlayın.

Daha sonra hidrasyon tamponuna 37.5 mikrolitre 10 molar sodyum hidroksit ekleyin. Falcon tüpüne 235 mikrolitre saf oleik asit pipetleyin, bu da 0.15 molar toplam lipid içeren bir vezikül çözeltisi elde edilmesini sağlar. Ardından, karışımı dört ila beş saniye boyunca girdaplamak için yüksek hızlı bir girdap kullanın.

Ardından, en az iki saat boyunca düşük hızda dönen bir çalkalayıcı üzerinde yuvarlanın. Lipid hazırlığı, bu noktada dönen çalkalayıcı üzerinde gece boyunca bırakılabilir. Olası agregaları gidermek için mobil fazı 0,22 mikronluk bir şırınga filtre ünitesinden süzün.

Vezikülleri saflaştırmak için önce Sepharose 4B kolonunu metin protokolünde detaylandırıldığı gibi hazırlayın ve imbik standına sıkıştırın. Ardından kolonun ucunu stop cock konektörüne bağlayın ve boruyu fraksiyon toplayıcıya bağlayın. Boruyu yıkamak için başka bir tampon parçası ekleyin ve kolondaki sıvı seviyesi reçinenin üst kısmına yaklaştığında durdurma musluğunu kapatın.

Daha sonra, ekstrüde edilmiş vezikülleri 200 mikrolitrelik bir pipetleyici kullanarak reçinenin üstüne uygulayın ve vezikül preparatını reçine yatağına veya kolon duvarına dokunmadan reçineye mümkün olduğunca eşit bir şekilde uygulamaya özen gösterin. Akışı başlatmak için durdurma musluğunu açın ve fraksiyonları 96 oyuklu bir plakada toplamaya başlayın. Reçine yatağının kurumasına izin vermemeye dikkat ederek, tampon tükendikçe vezikül saflaştırma mobil fazını reçine yatağının üstüne 0,5 ila bir mililitrelik porsiyonlar halinde uygulayın.

Daha sonra eluenti en az 36 kuyu toplayarak beş damla fraksiyonlar halinde toplayın. Saflaştırma fraksiyonlarını karakterize etmek için, bir plaka okuyucudaki 96 oyuklu plakayı okuyun. Elde edilen floresan verilerini floresan ve kesir sayısı olarak çizin.

Veziküller önce elüte, ardından kapsüllenmemiş fraksiyon gelir. Ligandlanmış magnezyum kullanırken, magnezyum klorür ve potasyum sitratı belirtilen oranda 250 milimolar Tris-HCL pH 8 tamponunda önceden karıştırın. Burada, kararlı oleik asit vezikülleri için bir ila dört oranı kullanılır.

Her zaman magnezyum ve ligand çözeltisini önceden karıştırmayı unutmayın. Yağ asidi veziküllerini asla tek başına şelatsız magnezyuma maruz bırakmayın. Önceden karıştırılmış magnezyum sitrat çözeltisini vezikül örneğine ekleyin.

Karışımı kısaca girdaplayın. Vezikül örneğini, metin protokolünde açıklandığı gibi yeniden saflaştırmadan önce en az 30 dakika bir bardakta bırakın. Vezikül örneğindekiyle aynı magnezyum ve sitrat konsantrasyonunu yeniden saflaştırma mobil fazına eklediğinizden emin olun.

Kendi kendine bölünme reaksiyonunu başlatmak için magnezyum çözeltisini metin protokolünde açıklandığı gibi saflaştırılmış veziküllerle karıştırın. Kinetik çalışmalar için, her zaman noktasında karışımdan 100 mikrolitre alın ve bu alikotu, mobil faz olarak 250 milimolar Tris-HCL pH 8 olan bir Sepharose 4B boyut dışlama sütunu aracılığıyla doğrudan yeniden saflaştırın. Vezikül fraksiyonunu toplayın.

RNA yükleme örneğini metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Ticari olarak dökülen %15 TBE üre jelini jel kutusuna yerleştirin ve jel kutusunu 1X TBE jel çalıştırma tamponu ile doldurun. Numuneleri 80 santigrat derece ısı bloğunda bir dakika ısıttıktan sonra, oyuk başına her numuneden beş mikrolitre yükleyin.

Jeli yaklaşık bir saat boyunca sabit 200 volt ile çalıştırın. En sonunda, jeli tarayın ve bir analiz programı ile nicelleştirin. RNA'nın protohücreler içinde işlev görebileceğini göstermek için, floresan etiketli substrat zinciri ile çekiç başlı ribozim kendi kendine bölünme, bir model RNA katalitik reaksiyonu olarak kullanıldı.

Bu reaksiyon, katalizi kolaylaştırmak için serbest magnezyum gerektirir. Bu nedenle, beş milimolar magnezyum varlığında stabil oldukları için oleik asit / gliserol monooleat vezikülleri kullanıldı. Çekiç başlı ribozim kendi kendine bölünme reaksiyonu, jel elektroforezi ile izlenebilir.

Sayfa görüntüsünü ölçtükten sonra, belirli bir zaman noktasında kalan alt tabaka miktarının zamana karşı başlangıçtaki alt tabaka miktarına oranının doğal logaritmasının doğrusal bir uyumu oluşturulur. Bu grafik, ribozim aktivitesi hesaplaması için kullanılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, kapsüllenmiş boya veya RNA'ya sahip yağ asidi lipozomları 24 saat içinde hazırlanabilir ve saflaştırılabilir.

Bu prosedürü denerken, veziküllerin çözünmesini önlemek için doğru pH aralığında yağ asidi lipozomları oluşturmayı ve toplam lipid konsantrasyonunu lipidin kritik agregasyon konsantrasyonunun üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, yağ asidi lipozomlarının nasıl hazırlanacağını ve bunların biyokimyasal reaksiyonlara ev sahipliği yapmak için nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.