Name: Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Öğrenin yağ asidi lipozomlarının hazırlanması, arıtılması ve kullanımı için bu biyokimya yöntemini. Sentetik biyoloji ve yaşamın kökeni araştırmalarında minimal hücreler oluşturmaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

J.W.S. Howard Hughes tıp Enstitüsü'nün bir dedektif olduğunu. Bu eser kısmen J.W.S. için Simons Vakfı bir hibe (290363) tarafından desteklenmiştir A.E.E. ve K.P.A. Minnesota Üniversitesi başlangıç fonlarından destek kabul edersiniz.

1. vezikül hazırlık
<ol><li>
İnce filmleri hazırlanması
	<ol>
<li>Gaz sıkı şırınga lipidler belirli miktarda bir cam şişede kloroform için Tablo 1.1 açıklandığı gibi aktarmak için kullanın.</li>
		<li>Azot veya duman başlıklı argon akışı altında elde edilen çözüm buharlaşır.</li>
		<li>Elde edilen ince film ev vakum en az 2 h herhangi bir kloroform artıklarını çıkarın için tabi. Lipid vakum altında bir gecede bu noktada bırakılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rehidrasyon veziküller
	<ol>
<li>5 mM calcein 250 mM tris-HCl pH 8.0 hidrasyon arabellek 10 mL calcein tozu 1 M tris-HCl pH 8.0 arabellek 2.5 ml 31 mg eriterek ve başka bir 7.5 mL deiyonize (DI) su ekleyerek hazırlayın.</li>
		<li>Hidrasyon arabellek üstüne, 250 µL boş bir tüp içine pipet ve 1,875 µL son 75 mM taban için 10 M NaOH (Toplam yağ asitleri ½ eşdeğeri) ekleyin. Çözüm için formu veziküller kuru lipid ince film 0.15 M toplam lipid konsantrasyon ile aktarın.</li>
		<li>Kullanım yüksek hızlı (> 3000 d/d) vortexer girdap 4-5 s için elde edilen karışımı için.</li>
		<li>Lipid-tampon karışımı suyla temasa, en az bir gecede üzerinde bir düşük hızlı (ca. 30 rpm) dönen bir shaker bırakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Boyutlandırma veziküller (isteğe bağlı)
	<ol>
<li>Cımbız kullanarak, bir filtre destek Ekstruder şırınga noktalarından iç her yüzey için geçerlidir.</li>
		<li>Her filtre desteği 250 mM tris ile ıslak-HCl, pH 8.</li>
		<li>Cımbız kullanarak, bir parça kazınmış 100 nm polikarbonat membran Ekstruder o-Ring birine uygulamak ve filtre destekler. Değil gözyaşı veya membran ponksiyon, yavaşça içine iki yüzey arasında iyi temas yapmak için O-ring membran itmek için dikkat çekici.</li>
		<li>Membran yerinden değil için dikkat çekici Ekstruder, montaj ve filtre destekler.</li>
		<li>Bir Ekstruder şırınga ile ca. 0,5 mL 250 mM tris doldurun-HCl, pH 8. Bu şırınga ekstruder bir tarafı yerleştirin.</li>
		<li>Boş bir şırınga Ekstruder öbür yerleştirin.</li>
		<li>Elle, arabellek içeren yavaş yavaş şırınga (≤ 50 µL/s) pistonu itmek ve direnç, yer ve sağlam parça kazınmış membran olduğunu belirten hissedilir doğrulayın. Direnç beklenen düzeyini ölçmek için bu adım olmadan bir membran yerde uygulaması yararlıdır.</li>
		<li>Kaldırmak ve iki şırınga boş. Aynı kompozisyon lipozom hazırlık için arabellek içerdiğinden, bu aşamada iki şırınga temizlemek gerekli değildir.</li>
		<li>Lipozom hazırlık iki şırınga birinin içine yerleştirin.</li>
		<li>Extruder Makinası vezikül örnek sol ve sağ tarafta boş şırınga içeren şırınga ile yeniden monte.</li>
		<li>El, vezikül örnek çok yavaş içeren şırınga (10-25 µL/s) pistonu itin.</li>
		<li>Ekstruder sağ tarafında şırınga dikkatle gözlemlemek; Açık arabellek başlangıçta Ekstruder sağ tarafında girin (ca. 50 µL, bu Ekstruder ölü iç hacmi nedeniyle), haddelenmiş lipozomlar küçük bir tüy tarafından takip. Hemen bu noktada itmeyi bırak, şırınga Ekstruder sağ tarafında kaldırmak ve bu çözüm atın.</li>
		<li>Şırınga Ekstruder sağ tarafında değiştirin ve sol şırınga boşalıncaya kadar bükün.</li>
		<li>Ekstruder yönünü tersine çevirmek ve 13 arasındaki adımları yineleyin. Devir (genellikle 7, 9 veya 11); istenilen sayıda için devam bir tek sayı her zaman un haddelenmiş lipozomlar başlangıçta öncesi küçülme lipozom hazırlık içeren şırıngadan toplanan değil emin olmak için kullanılır.</li>
		<li>Yavaşça bir Eppendorf tüp içine doğru şırınga içeriğini dağıtmak ve yaklaşık 0,5 h için bir düşük hızlı (ca. 30 rpm) dönen shaker tüpü yerleştirin.</li>
		<li>Vezikül arıtma ile Bölüm 2'de açıklandığı gibi devam edin. Haddelenmiş veziküller içinde 24 h kullanılan veya sonraki saat kullanmadan önce yeniden kalıptan çekilmiş.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. vezikül arıtma
<ol><li>
Vezikül arıtma mobil faz hazırlanması
	<ol>
<li>5 mL 250 mM tris-HCl pH 8 hidrasyon arabellek de 1,25 mL 1 M tris-HCl pH 8 arabelleği, 3.75 mL DI su 15 ml Falcon tüp ekleyerek hazırlayın. Sonra 10 M NaOH 37,5 µL ekleyin (Bankası unesterified yağ asidi göre ½ eşdeğeri) hidrasyon arabellek. Doğrudan bir vezikül çözüm 0.15 M toplam lipidler ile sonuçlanan Falcon tüp içine saf oleik asitin 235 µL pipet.</li>
		<li>Kullanım yüksek hızlı (> 3000 devir/dakika) girdap karışımı 4-5 s için için vortexer sonra takla shaker en az 2 h için döner bir düşük hızlı üzerinde. Lipid hazırlık gecede üzerinde dönen shaker bu noktada bırakılabilir. Herhangi bir potansiyel toplamları kaldırmak için kullanmadan önce 0.22 mikron şırınga filtre ünitesi ile mobil faz filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Veziküller Sepharose üzerinde arıtma
	<ol>
<li>CA. 5 mL ethanolic Sepharose 4B Bulamaç de bir pipet kullanarak şişeden çıkarın. Bu bir tek kullanımlık 10 mL Kromatografi sütun için geçerli.</li>
		<li>Etanol reçine yatağın üst yaklaşımlar dek yerleşmeye Bulamaç ve etanol akışı aracılığıyla izin veremeyiz.</li>
		<li>5 mL uygulayın reçine ve izin akış-etanol kalıntı silsin için aracılığıyla üst deiyonize su.</li>
		<li>250 mM tris uygulamak-HCl, pH 8 ' 1-2 mL bölümleri yeni bir bölümü sıvı düzeyi reçine yatağın üstündeki yaklaşımlar her zaman uygulamak reçine, dön. Yineleme için 3 - 5 kez.</li>
		<li>Sütun imbik kürsüye kelepçe, ardından stopcock bağlayıcı ve boru kesir toplayıcı için sütun ucunu bağlayın. Tampon tüp floş, Sıvı düzey sütun reçine üst yaklaştığında stopcock kapatmak için başka bir bölümüne ekleyin.</li>
		<li>Haddelenmiş veziküller 200 µL pipettor kullanarak, vezikül hazırlık mümkün olduğunca eşit uygulamak için reçine reçine yatak veya sütun duvar dokunmadan için dikkat çekici reçine üst bölüm 1 uygulamak.</li>
		<li>Akışını başlamak ve kesirler bir 96-şey plaka toplamaya başlamak için stopcock açın. 0.5-1 reçine yatakta üstündeki vezikül arıtma mobil faz uygulamak mL porsiyon arabellek depletes, reçine yatak kurumasına izin vermemek için dikkat çekici gibi. En az 36 wells (96-şey plaka üç sıra) toplama beş bırak kesirler içinde toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Arıtma kesirler Floresans karakterizasyonu
	<ol>
<li>96-şey plaka önceki bölümden almak ve bir plaka okuyucu okumak (λex485 = nm, λem515 = nm).</li>
		<li>Floresans kesir sayısı vs olarak elde edilen floresan verileri çizmek. Veziküller elute önce unencapsulated kısmı (şekil 1) tarafından takip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Veziküller vezikül sızıntı izlemek için repurification
	<ol>
<li>Bölüm 2,2 ve 2.3 arıtma ve karakterizasyonu adımlarını yineleyin. İçeriklerini berraklığını veziküller unencapsulated çözünen (ya da çok küçük bir vezikül en yüksek yoğunluk yaklaşık 5-%10) hiçbir zirvesine sergileyecek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. veziküller magnezyum huzurunda kullanımı
<ol><li>
Unliganded magnezyum kullanımı
	<ol>
<li>Hazırlamak ve veziküller 1, 2,1 ve 2,2 bölümlerinde açıklandığı gibi arındırmak.</li>
		<li>50 mm MgCl2 çözüm içinde 250 mM tris-HCl pH 8.0 tampon 1 mL 1 M tris-HCl pH 8.0 arabelleği 250 µL ve 1 M MgCl2 50 µL DI 700 µL için ekleyerek su hazırlamak. Girdap iyice karıştırın.</li>
		<li>5 mM istenen magnezyum konsantrasyon vermek, 0.9 mL saf veziküller ve 100 µL magnezyum çözüm mix ve hızla geçici veziküller maruz magnezyum yüksek yerel konsantrasyon vezikül kesintileri en aza indirmek için heyecan. Not: Magnezyum çözümü hızlı karıştırma vezikül istikrar için önemlidir. Magnezyum ve veziküller hızlı bir şekilde hemen vortexing tarafından karışık değil, bazı veziküller içinde tutarsız sonuçlar örnek örnek sonucu magnezyum, daha yüksek konsantrasyonları maruz kalacağı.</li>
		<li>2.4 içeriği sızıntı için kontrol etmek için açıklandığı gibi bir bardak için en az 30 dk önce repurification vezikül örnek çıkarma. Magnezyum vezikül örnekteki gibi aynı yoğunlukta repurification mobil faz ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Liganded magnezyum kullanımı
	<ol>
<li>Hazırlamak ve veziküller 1, 2,1 ve 2,2 bölümlerinde açıklandığı gibi arındırmak. Not: ½ eşdeğer KOH NaOH yerine deprotonate yağ asitleri için kullanın; Bu Şelatatlı MgCl2 sistemlerinde daha istikrarlı lipozomlar üretir bulundu.</li>
		<li>2 M potasyum sitrat çözüm hazırlamak ve pH 8,0 KOH ile ayarlayın.</li>
		<li>MgCl2 ve potasyum sitrat belirtilen oranında (ca. 1:4 için kararlı oleik asit veziküller) 250 mM tris-HCl pH 8.0 arabelleği premix.</li>
		<li>Premix Magnezyum sitrat çözüm vezikül örnek, kısaca girdap ekleyin. Not: Her zaman magnezyum ve ligand çözüm premix. Unchelated magnezyum çözüm yalnız veziküller pilleri.</li>
		<li>2.4 açıklandığı gibi bir bardak için en az 30 dk önce repurification vezikül örnek çıkarma. Magnezyum ve sitrat vezikül örnekteki gibi aynı konsantrasyon repurification mobil faz ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. non-enzimatik RNA veziküller içinde kopyalama
<ol><li>
Monodisperse RNA hazırlanması veziküller kapsüllenmiş
	<ol>
<li>Bir kuru oleik asit film 1.1 bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
		<li>Vezikül rehidrasyon arabellek 50 µM floresan etiketli RNA astar ile 150 µM RNA şablonu ve 250 mM tris-HCl pH ½ eşdeğer KOH göre oleik asit içeren 8.0 hazırlayın.</li>
		<li>Rehidrasyon arabelleği 250 µL lipid video eklemek ve takip adım 1.2.2 ve veziküller toplam 0.15 M lipid konsantrasyon ile yapmak 1.2.3.</li>
		<li>Küçük unilamellar monodisperse veziküller yapmak için bölümü 1.3 vezikül ekstrüzyon için izleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Magnezyum sitrat toplama ve vezikül arıtma
	<ol>
<li>Magnezyum ve sitrat stokları premix ve bu son lipid konsantrasyonu 0.1 m vezikül örnek ile karıştırın.</li>
		<li>Veziküller Sepharose 4B boyutu dışlama sütun, 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0.1 M lipidler ve Magnezyum sitrat mobil faz olarak verilen arındırmak.</li>
		<li>Vezikül kesirler ile aşağıdaki bölüm 2.3 toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Astar uzantısı tepki
	<ol>
<li>200 mM 250 mM tris-HCl pH 8.0 ile 2-MeImpG (guanozin 5'-monofosfattır 2-methylimidazolide) hisse senedi çözüm hazırlamak. (Not: takip önceki 2-MeImpG sentezi için protokol10 yayınlandı.)</li>
		<li>Astar uzantısı reaksiyonu başlatmak için 450 µL vezikül örnek için 75 mM lipid ve 50 mM aktif monomer son bir konsantrasyon ulaşmak için 2-MeImpG hisse senedi çözüm 150 µL aktarın. Örnek sayacı ve tutmak tepki her zaman yuvarlanan Başlat.</li>
		<li>(İsteğe bağlı) Sürekli taze monomer beslenmesi için 300 µL tepki çözüm bir odasına bir laboratuar inşa küçük hacimli lipozom dialyzer11 ve çözüm diğer odasında besleme yerine 300 µL aktarın. Besleme çözüm veziküller boş veziküller ile içeren RNA değiştirme dışında tepki çözüm olduğu gibi aynı konsantrasyonu, tüm malzemeyi içermelidir. Diyaliz her turun analit ve membran kullanılan bağlı olarak 1 / 24 h alır.</li>
		<li>Kinetik çalışmalar, 100 µL her zaman noktası aliquot al ve aliquot üzerinden Sepharose 4B boyutu dışlama sütun mobil faz olarak 250 mM tris-HCl pH 8.0 ile repurify.</li>
		<li>Bir 1,5 mL eppendorf tüp vezikül kesirleri toplamak.</li>
		<li>Triton vezikül kesirler bir final yaklaşık %0,1 için pipet v/v.</li>
		<li>Soğuk etanol 0.5 mL tüp ekleyin ve en az 2 h için-20 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>16,1 × 1000, tüm örnekler santrifüj kapasitesi rcf (16,1 × g) 10 dk ve yavaşça pipet sıvı dışarı için. RNA % 70 soğuk etanol ve santrifüj ile granül yıkama tekrar 5 dakika süreyle sıvı atmak ve RNA parçaları ile tüp kalan etanol buharlaşır için 2 dakika için bir 80 ° C ısı blok koymak. 8 M üre 1xTBE yükleme arabelleği ile 50 µL granül geçiyoruz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SAYFA analizi
	<ol>
<li>% 20 hazırlamak sayfa jel 200 mL UreaGel sisteminin konsantre ol, seyreltici, UreaGel sisteminin 25 mL karıştırma 10xTBE arabelleği 25 mL, TEMED, 80 µL ve amonyum persülfat 250 mg tarafından. Hızlı bir şekilde klempe jel plaka (35 cm × 45 cm) arasındaki jel karışımı dökün ve tarak ekleyin. En az 30 dk eksiksiz polimerizasyon kadar bekleyin.</li>
		<li>Jel plaka jel stand üzerine monte ve tampon çalıştıran 1xTBE jel ile jel kutuları doldurun. Tarak almak ve kuyular şırınga ile yıkayın. 60 W 30 dk. için jel önceden çalıştırın.</li>
		<li>Örnekleri için 2 dk 80 ° C ısı blokta ısı ve iyi ücret her örneğinin 5 µL yük.</li>
		<li>Jel güç kutusunu açın ve jel 60 W 2,5 h için sürekli Watt ile çalışan ayarlayın.</li>
		<li>Jel plaka jel stand sökmeye, camı temizle ve jel taramayı başlatmak için jel tarayıcıda bütün plaka koymak.</li>
		<li>Jel ImageQuant TL 1 D analizi ile ölçmek. Astar astar zaman vs başlangıç miktarı için bir zaman noktasında kalan miktarı oranında doğal logaritması arsa, bir satır için uygun ve sözde ilk sipariş reaksiyon oranı (Resim 2) hesaplamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. hammerhead RNA kendini bölünme veziküller içinde
<ol><li>Hazırlık ve veziküller içinde kapsüllü ribozyme arıtma<ol>
<li>Lipid ince bir film hazırlamak (OA: GDO 9:1 =) bölümünde 1.1 bileşenleri ile olarak olduğu gibi Tablo 1.2. Not: en az 60 ° tam kullanmadan önce erime için c sıcak GDO.</li>
		<li>Vezikül rehidrasyon arabellek her çekiç ribozyme strand ve 250 mM tris-HCl pH 8.0 5 mikron ile hazırlayın.</li>
		<li>Rehidrasyon arabelleği 250 µL lipid video eklemek ve adım 1.2.2 ve veziküller ile 0.15 M toplam yapmak 1.2.3 lipid konsantrasyon izleyin.</li>
		<li>Küçük unilamellar monodisperse veziküller yapmak için bölümü 1.3 vezikül ekstrüzyon için izleyin.</li>
		<li>Lipidler mobil faz karışık veziküller bir Sepharose 4B boyutu sütun dışlama, 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0.15 M ile arındırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çekiç kafa ribozyme öz-bölünme tepki
	<ol>
<li>Magnezyum çözüm hazırlamak ve öz-bölünme reaksiyonu başlatmak için bölümde 3.1 açıklandığı gibi saf veziküller ile karıştırın.</li>
		<li>Kinetik çalışmalar, her zaman noktası 100 µL karışımı alın ve doğrudan bu aliquot üzerinden Sepharose 4B boyutu dışlama sütun mobil faz olarak 250 mM tris-HCl pH 8.0 ile repurify. Vezikül kesir toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SAYFA analizi
	<ol>
<li>Örnek yükleme RNA hazırlamak için 4.3.6 4.3.8 adımları uygulayın.</li>
		<li>Ticari olarak döküm % 15 TBE-üre jel jel kutusu koyun ve jel kutusu arabellek çalışan 1xTBE jel ile doldurun.</li>
		<li>Örnekleri için 1 dk 80 ° C ısı blokta ısı ve iyi ücret her örneğinin 5 µL yük.</li>
		<li>Jel yaklaşık 1 h için sürekli 200 V ile çalıştırın.</li>
		<li>Jel inceden inceye gözden geçirmek.</li>
		<li>Jel ImageQuant TL 1 D gibi bir analiz yazılımı ile ölçmek, kalan şiddeti karşılaştırarak bölünme kapsamını ölçmek için bant (şekil 3) substrat RNA band ve i ciddi RNA parçası.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. dev yağ asidi veziküller mikroskopi için
<ol><li>
Dev yağ asidi veziküller hazırlanması
	<ol>
<li>Bölüm 1.1 ve oleik asit ince film fluorescently etiketli lipid mol % 0.2 ile daha iyi membran gözlem için hazırlamak için Tablo 1.3 izleyin.</li>
		<li>500 µL 250 mM tris-HCl pH toplamda vezikül örnek 10 mM lipidler yapmak 8.0 ile lipid film rehydrate. Arabellek floresan boyalar veya RNA molekülleri istenirse içeriyor olabilir. Vezikül örnek gecede yuvarlanan bırakın.</li>
		<li>150 mL saf yağ asidi diyaliz arabelleği 10 mM ile toplam lipidler 470 µL oleik asit ve 150 mL 250 mM tris-HCl pH ½ eşdeğer NaOH içeren 8.0 karıştırarak hazırlayın.</li>
		<li>Büyük toplamları kaldırmak için bir 10 µm polikarbonat membran aracılığıyla vezikül örnek A'ya.</li>
		<li>Vezikül örnek daha önce açıklandığı gibi 1 µm büyük gözenek diyaliz kaset aktarın. 12
</li>
		<li>Diyaliz kaset 30 mL diyaliz arabellek içeren bir 100 mL kabı yerleştirin. Kabı hafifçe üfleyin, 80-100 rpm de bir masa üstü shaker kışkırtmak.</li>
		<li>Diyaliz arabellek her 30 dk ücretsiz boya veya RNA ve küçük veziküller kaldırmak 5 kere için değiştirin.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde vezikül örnek diyaliz kaset bir şırınga ve transferi ile bir Eppendorf tüp çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mikroskopi gözlem
	<ol>
<li>Veziküller temiz çift mikroskop slayt üzerine 10 µL pipet ve cam kapak notu örnek yerleştirin. Cam şeffaf oje ile kapatın.</li>
		<li>Confocal mikroskobu fluorescently etiketli membran, RNA veya Kapsüllenen boya (şekil 4) için uygun lazer kaynak kullanarak tarafından bir 60 X yağ dağılım veya benzer amacı ile veziküller gözlemlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Models+of+Primitive+Cellular+Compartments%3A+Encapsulation%2C+Growth%2C+and+Division%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division.</a> Science. 302, 618-622 (2003).</li>
<li>Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-directed+synthesis+of+a+genetic+polymer+in+a+model+protocell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell.</a> Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).</li>
<li>Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+vesicles+of+monocarboxylic+acids+and+alcohols%3A+conditions+for+stability+and+for+the+encapsulation+of+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).</li>
<li>Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00105a004">Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).</li>
<li>Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC224735/">Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).</li>
<li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymatic+template-directed+RNA+synthesis+inside+model+protocells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells.</a> Science. 342 (6162), Science. New York, N.Y. 1098-1100 (2013).</li>
<li>Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+catalytic+oligoribonucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small catalytic oligoribonucleotide.</a> Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).</li>
<li>Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+catalysis+in+model+protocell+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">RNA catalysis in model protocell vesicles.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).</li>
<li>Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaboration+between+primitive+cell+membranes+and+soluble+catalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts.</a> Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).</li>
<li>Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6205154">RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers.</a> J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).</li>
<li>Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+liposome+dialyzer+for+the+preparation+of+high-value%2C+small-volume+liposome+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations.</a> Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).</li>
<li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19347043">Preparation of large monodisperse vesicles.</a> PloS one. 4 (4), e5009(2009).</li>
<li>Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+extrusion+through+polycarbonate+track-etched+membranes+using+a+hand-held+mini-extruder%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzym%22%5BJournal%5D)">Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder.</a> Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Yağ asitleri kurulan lipozomlar Yüksek geçirgenlik ve dinamik özellikleri nedeniyle ilkel hücreler için potansiyel modelleri gibi birçok kişi tarafından önerilmiştir. Tek zincirli yağ asitleri karboksilik baş grup yalnızca kendinden montajlı membranlar kısıtlı pH aralığı içine sağlar ve elde edilen membranlar tuzları varlığı oldukça duyarlıdır. Sonuç olarak, yağ asidi veziküller farklı hazırlık ve Fosfolipid veziküller ile karşılaştırıldığında yöntemleri işleme gerektirir.
Bu protokol için lipozom oluşumu için örnek olarak oleik asit kullandığımız rağmen diğer uzun zincir doymamış yağ asitleri (C14) ve onların türevleri (ca. myristoleic asit, palmitoleic asit ve karşılık gelen alkoller ve gliserin esterleri) ayrıca veziküller formu Toplam lipid konsantrasyon cmc ve hidrasyon tampon pH olduğu sürece tabi belgili tanımlık ince film rehidrasyon yöntem membran içinde yağ asitleri pKa yakındır. Tris-HCl tampon bu protokol için kullanılan dışında fosfat veya Bor arabellekte oluşan veziküller genellikle oldukça sızan13olmasına rağmen diğer tampon sistemleri (ca. bicine, fosfat, Bor) yağ asidi vezikül oluşumu, desteklemek için rapor edilmiştir. Rehidrasyon sonra elde edilen yağ asidi veziküller polydisperse vardır ve multilamellar, ancak kolayca küçük monodisperse unilamellar veziküller ekstrüzyon tarafından açıklandığı gibi dönüştürülür. Küçük veziküller oluşturmak için alternatif bir yöntem olarak sonication ile karşılaştırıldığında, ekstrüzyon farklı gözenek boyutu membranlar uygulayarak vezikül boyutta denetim için daha fazla seçenek sağlar. Ekstrüzyon sonra veziküller genellikle biraz membran gözenek boyutu büyük, fakat ekstrüzyon devir sayısını artırarak, veziküller dar bir boyut dağılımı ve membran gözenek boyutu yakın bir ortalama boyutu ile elde edilebilir.
Fonksiyonel protocells sentez için ana bilgisayar belirli biyokimyasal reaksiyonlar RNA veya diğer yapı taşlarını encapsulation kaynaklanan yağ asidi veziküller gerekmektedir. İnce film rehidrasyon yöntemi istenen kapsüllenmiş malzemeler içeren formu veziküller için kolay bir yol sağlar. Ancak, kapsülleme verimliliği nispeten düşük olduğunu ve RNA gibi değerli malzemeler büyük bir kısmı arıtma işlemi sırasında genellikle kayıp. Bazı durumlarda kapsülleme verimliliği alçakgönüllülükle tekrarlanan donma-çözülme çevrimleri ekstrüzyon önce tarafından geliştirilebilir. Benzer yöntemleri henüz yağ asidi veziküller için geliştirilmiştir değil ancak mikrosıvısal yöntemler Fosfolipid lipozomlar yüksek verimli hazırlanması için neredeyse % 100 kapsülleme verimlilik için olanak sağlar.
Ne zaman protocells ya Şelatatlı ya da ücretsiz Mg2 +, magnezyum çözüm eklenmesi ve kaldırılması her zaman noktası sağlar önce repurification sonra arıtma işleme sızdırılmış kapsüllenmiş reaksiyon oranı doğruluğunu etkileyebilir malzeme ölçümler veziküller içinde. En az 10 dk iyi ayırma elde etmek ve vezikül kesirleri toplamak için her arıtma alır bu yana, hızlı reaksiyonlar analizini zordur ve reaksiyon sütun repurification önce durdurulması gerekir.
Burada mevcut protokolü bu ilkel hücreler oluşabilecek taklit reaksiyonlar ev sahipliği yağ asidi lipozomlar inşası için uygundur. Bizim protokoller de Biyomedikal vasıtalarının ve Biyoreaktörler diğer biyokimyasal reaksiyonlar için potansiyel uygulamalar geliştirme sağlar.

Lipozomlar veya veziküller – amfifilik lipidler oluşan bilayer membranlar tarafından kapsanan bölmeleri - kullanımı çok sayıda Biyomedikal uygulamalarda teslimat araçlar için ilaç, hücre zarı, modelleri ve sentetik gelişimi için bulduk hücreleri. Aynı zamanda biz ve diğerleri lipozomlar ilkel hücre zarlarında erken yaşam modelleri olarak istihdam. 1 , 2 , 3 , 4 genellikle, tür sistemlerde, bu moleküller modern hücreleri istihdam kodlanmış protein enzimler parası olmadan sentezlemek basit olduğu gibi tek bir lipid hidrokarbon kuyruk (örneğin, oleik asit), içeren tek Zincirli amphiphiles kullanıyoruz.
Tek-zinciri lipidler oluşan lipozomlar diacylphospholipids kurulan benzer (örneğin, 1-palmitoyl-2-oleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine veya POPC) sınır bilayer zarı oluşur ki. Lipitler ya sınıfından oluşan lipozomlar çözünmüş yükü koruyabilirsiniz ve küçültme ve farklı tekniklerle saf. Birkaç önemli farklılıklar sonucu tek zincir lipidler benzersiz kimyasal özellikleri. Veziküller fosfolipitler tarafından kurulan bir geniş pH aralığında kararlı iken yağ asidi veziküller yalnızca belirli pH tampon için vezikül hazırlık gerektirir hafif temel için nötr pH (ca. 7-9), stabildir. Çoğu zaman, bu arabellek ya da işlevsel malzemeler (örneğin, RNA) olabilir vezikül kapsülleme için belirli çözünen molekülleri compartmentalized biyokimyasal reaksiyonlar veya basit floresan boyalar (örneğin, calcein-ebilmek da içermek ) vezikül karakterizasyonu için.
Sadece bir tek hidrokarbon zinciri varlığı hem daha geçirgen solutes için hem de daha dinamik bir membran üretir. Ayrıca, karboksilik asit baş grup yağ asitleri sonuçları tuz ve divalent katyonlar (örneğin, Mg2 +) varlığı daha hassas veziküller içinde mevcut. Magnezyum protocells hayat köken araştırmaları biyokimyasal reaksiyonlar kataliz için en önemli divalent katyonlar biridir. Sofistike protein enzimler, evrimi önce erken yaşamda RNA baskın polimer, kendi kendini çoğaltmak ve kataliz gerçekleştirmek üzere çift kapasitesini nedeniyle olabilir. Magnezyum gerektiren bir RNA'ın bir temsilcisi örnek ile ilgili kopyalama, 1960'lı yıllarda ilk gösterdi enzimatik olmayan RNA tepkidir. 5 kimyasal olarak aktif RNA nükleotitler (Yani 2-methylimidazolide nukleotid) için önceden varolan bir astar şablon karmaşık bağladığınızda, astar 3'-hidroksil grubuna bitişik aktif bir monomer yerinden için 5'-fosfat saldırıları bırakarak grup (Yani 2-methylimidazole) ve formları yeni bir dizide bağ. Bu RNA kopyalama kimya yağ asidi protocells ile uyumlu olması için Şelatatlı gereken Mg2 +, yüksek bir konsantrasyon gerektirir. 6 başka bir Mg2 +-bağımlı tepkidir bu belki de en çok karakterize katalitik RNA olduğu çekiç ribozyme tarafından katalize. İki kısa oligonucleotides yeniden, bu ribozyme bir jel shift tarafından izlemek uygun bir self-bölünme tepki gerçekleştirir. Bu nedenle, bu sık sık hayat kaynağı çalışmalarda bir modeli ribozyme istihdam edilmektedir. 7 unliganded magnezyum için bu ribozyme tarafından bir gereklilik nedeniyle lipozomlar genellikle yağ asidi ve magnezyum için daha istikrarlı yağ asidi gliserin esterleri tarafından inşa edilir. 8 , 9 bu protokol için sunduğumuz hazırlama, işleme, bu veziküller karakterizasyonu için geliştirdik ve bu veziküller ana bilgisayar enzimatik olmayan RNA kopyalama ve çekiç kafa ribozyme için uygulama protocells olarak göstermek teknikleri kataliz.

<table><tbody><tr><td>sephorose 4B</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>4B200</td><td></td></tr><tr><td>kalsein</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>C0875-10G</td><td></td></tr><tr><td>tris-HCl pH8.0 1M</td><td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td><td>AM9851</td><td></td></tr><tr><td>sitrik asit</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>251275-500G</td><td></td></tr><tr><td>sodyum hidroksit</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>71690-250G</td><td></td></tr><tr><td>potasyum hidroksit</td><td>Sigma</td><td>30614</td><td></td></tr><tr><td>oleik asit</td><td>Nu-Chek</td><td>U-46-A</td><td></td></tr><tr><td>gliserol monooleat</td><td>Nu-Chek</td><td>M-239</td><td></td></tr><tr><td>Liss Rhodamine-PE YAŞAM</td><td>TEKNOLOJİLERİ A.Ş.</td><td>L1392</td><td></td></tr><tr><td>magnezyum klorür</td><td>Fisher/Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>sequagel konsantresi</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>EC-830</td><td></td></tr><tr><td>sequagel SEYRELTICI</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>EC-840</td><td></td></tr><tr><td>%15 TBE-ÜRE JEL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC68852BOX</td><td></td></tr><tr><td>üre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504-500G</td><td></td></tr><tr><td>titon-100x</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>T9284-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNA astarı</td><td>IDT</td><td>5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG</td><td></td></tr><tr><td>RNA şablonu</td><td>IDT</td><td>5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC</td><td></td></tr><tr><td>çekiç başlı substrat ipliği</td><td>IDT</td><td>5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GÜÇ UCG AGC</td><td></td></tr><tr><td>çekiç başlı ribozim ipliği</td><td>IDT</td><td>5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG</td><td></td></tr><tr><td>vezikül ekstruder seti</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>fraksiyon toplayıcı</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td>171041</tr><tr><td>96 kuyulu plakalar</td><td>Fisher</td><td>NC9995941/675</td><td></td></tr><tr><td>plaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>SpectraMax i3</td><td></td></tr><tr><td>konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R MP Konfokal</td><td></td></tr><tr><td>jel tarayıcı</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>Typhoon 9410 tarayıcı</td><td></td></tr></tbody></table>

hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Lipozomlar tek Zincirli amphiphiles içeren, özellikle yağ asitleri, diacylphospholipids nedeniyle bu amphiphiles benzersiz kimyasal özelliklerini içeren göre farklı özellikler sergiler. Özellikle, yağ asidi lipozomlar tek Zincirli amphiphiles nispeten yüksek çözünürlük nedeniyle dinamik karakter geliştirmek. Benzer şekilde, serbest yağ asitleri içeren lipozomlar daha metal iyonları ve karboksilik asit kafa grupları arasındaki güçlü etkileşim nedeniyle tuz ve divalent kasyonları duyarlıdır. Burada hazırlık, arıtma ve kısmen oluşan lipozomlar kullanımı ya da tek zincir amphiphiles (örneğin, oleik asitleri) bütün teknikleri göstermektedir.

Biz genellikle boyutu-dışlama sütunlarda lipozom purifications gerçekleştirin. Tipik lipozom hazırlıkları bir fluorophore bir tür içerir. Zaman lipozomlar oluşturulan ve kalıptan çekilmiş, içindeki ve dışındaki lipozomlar kapsüllenmiş için türler bulunur. Boyut-dışlama reçine (Sepharose 4B) üzerinde lipozomlar arındırıcı tarafından süre büyük lipozomlar değildir ve ilk (şekil 1A) elute unencapsulated solutes reçine, gözenekleri içinde korunur. Kesirleri toplama ve çizme Floresans kesir sayı (şekil 1B) vs genellikle iki tepeli izleme, daha sonra toplanan ve sonraki uygulamalarda kullanılan lipozomlar, karşılık gelen erken stentlerin kesirli sayıları verir.
Biz sık sık ribozyme ve protein bazlı RNA polimerazlar RNA çoğaltma önce ortaya çıkması muhtemel bir araç olduğunu nonenzymatic astar uzantısı reaksiyonları incelemek. Bu reaksiyonlar genellikle aktif monomerleri tarafından genişletilmiş bir fluorescently etiketli astar (şekil 2A), istihdam. Bu tepkiler Jel Elektroforez (şekil 2B) tarafından izlenebilir ve elde edilen electropherograms tümleşik hızı sabitler verilen tepki durumu (şekil 2C) elde etmek için.
RNA protocells içinde işlev olabilir göstermek için bir modeli RNA katalitik tepki çekiç ribozyme öz-bölünme (şekil 3A) kullanıyoruz. Bu reaksiyon kataliz kolaylaştırmak için ücretsiz Mg2 + gerektirir ve bu nedenle biz onlar huzurunda 5 mM Mg2 +kararlı olduğundan OA/GDO veziküller kullanılır. Benzer şekilde astar uzantısı reaksiyonlar, çekiç kafa ribozyme öz-bölünme tepki de olabilir Jel Elektroforez (şekil 3B) tarafından izlenen ve daha sonra hızı sabiti (şekil 3 c) belirli koşullarda elde etmek için analiz edilebilir.
Biz her iki floresan istihdam ve ışık aktarılan lipozomlar görüntü. Lipozomlar bir membran etiket (şekil 4A) vermek, floresan lipidler veya floresan çözünen içinde onların Lümen (şekil 4B) kullanarak etiketli. İletilen ışık ( şekil 4B' de gösterilen) veziküller gözlemlemek için kullanılabilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Tablo 1.1 saf oleik asit kloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bileşen</td>
			<td>Hisse senedi</td>
			<td>Tutar</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Oleik asit</td>
			<td>&gt;</td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td>&gt;</td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td>&gt;</td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td>&gt;</td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><img alt="Kalsein vezikül kromatografisi işlemi; Ayırma sonuçlarını gösteren diyagram ve floresan grafiği." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="DNA uzatma proses diyagramı, jel elektroforez sonuçları ve kinetik analiz grafiği." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="RNA bölünme diyagramı, jel elektroforezi, kinetik analiz tablosu; Cy3 etiketli substrat işlemi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Lipid veziküllerinin çift mikroskopi görüntüleri, floresan görüntüleme ve faz kontrastı." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4">

Lipozomlar tek Zincirli amphiphiles içeren, özellikle yağ asitleri, sergi farklı özellikleri nedeniyle tek zincir amphiphiles benzersiz kimyasal özelliklerini içeren bu diacylphospholipids göre. Burada hazırlık, arıtma ve kısmen oluşan lipozomlar kullanımı ya da bu amphiphiles bütün teknikleri açıklar.

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Bu prosedürün genel amacı, yağ asitlerinin bir kısmında veya tamamında bulunan lipozomları hazırlamak, saflaştırmak ve kullanmaktır. Bu yöntem, sentetik biyoloji ve minimal hücrelerin tanımlanması ve yapay protohücrelerin oluşturulması gibi yaşamın kökeni çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokolün ana avantajı, yüksek verimli monodispers yağ asidi vezikülleri üretmek ve bunları bir dizi deneysel koşulda işlemek için kolay ve ucuz bir yol sunmasıdır.Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, yağ asidi veziküllerinin fosfolipid veziküllerinden daha hassas olması nedeniyle, özellikle de Kurutulmuş lipitlerin ince filmlerini hazırlamak için, kloroformdaki belirli bir miktarda lipiti bir cam şişeye aktarmak için gaz geçirmez şırıngalar kullanın. Çeker ocakta bir nitrojen veya argon akışı altında kloroformu buharlaştırın. Elde edilen ince filmi, kalan kloroformu çıkarmak için en az iki saat ev vakumuna tabi tutun.Lipid bu noktada gece boyunca vakum altında bırakılabilir. Vezikülleri yeniden sulandırmak için, 250 mikrolitre hidrasyon tamponunu boş bir tüpe pipetleyin, ardından son 75 milimolar baz için 1.875 mikrolitre 10 molar sodyum hidroksit ekleyin. Toplam yağ asidi konsantrasyonu 0.15 molar olan veziküller oluşturmak için çözeltiyi ince kuru lipit filmine aktarın, ardından elde edilen karışımı dört ila beş saniye boyunca girdaplamak için yüksek hızlı bir girdap kullanın.Gece boyunca yeniden sulandırmak için lipid tampon karışımını düşük hızlı dönen bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Tek tip boyutta veziküller oluşturmak için, lipozom ekstrüderinin şırınga portlarının her bir iç yüzeyine bir filtre desteği uygulamak için cımbız kullanın. Her filtre desteğini 250 milimolar Tris-HCL pH 8 ile ıslatın.Cımbız kullanarak, ekstrüder o-ringlerinden ve filtre desteklerinden birine 100 nanometre polikarbonat membrana bir parça aşındırma uygulayın. Membranı yırtmamaya veya delmemeye dikkat ederek, iki yüzey arasında iyi bir temas sağlamak için membranı nazikçe o-ringin içine itin. Ardından, membranı ve filtre desteklerini yerinden çıkarmamaya dikkat ederek ekstrüderi monte edin.Bir ekstrüder şırıngasını yaklaşık 0,5 mililitre 250 milimolar Tris-HCL pH 8 ile doldurun. Bu şırıngayı ekstrüderin bir tarafına yerleştirin. Ekstrüderin diğer tarafına boş bir şırınga yerleştirin.Pistonu ve şırınga içeren tamponu elinizle yavaşça itin ve direncin hissedildiğini doğrulayın, bu da rayla kazınmış zarın yerinde ve sağlam olduğunu gösterir. Beklenen direnç seviyesini ölçmek için bu adımı yerinde bir zar olmadan uygulamak faydalı olacaktır. İki şırıngayı çıkarın ve boşaltın.Bu aşamada iki şırınganın temizlenmesi gerekli değildir, çünkü bunlar lipozom preparatı ile aynı bileşime sahip bir tampon içerir. Ardından, lipozom preparatını iki şırıngadan birine yükleyin. Ekstrüderi, sol tarafta vezikül örneğini içeren şırınga ve sağ tarafta boş bir şırınga ile yeniden monte edin.Daha sonra vezikül örneğini içeren şırınganın pistonunu elle çok yavaş bir şekilde itin. Ekstrüderin sağ tarafındaki şırıngayı dikkatlice inceleyin. Berrak tampon, ekstrüderin iç ölü hacmi nedeniyle başlangıçta ekstrüderin sağ tarafına girecek, ardından küçük bir ekstrüde lipozom tüyü izleyecektir.Bu noktada hemen itmeyi bırakın. Ekstrüderin sağ tarafındaki şırıngayı çıkarın ve çözeltiyi atın. Ekstrüderin sağ tarafındaki şırıngayı değiştirin ve sol şırınga boşalana kadar ekstrüzyon yapın.Ekstrüderin yönünü tersine çevirin ve şırınga değişimini tekrarlayın. İstenilen döngü sayısı için devam edin. Lipozomların, orijinal olarak ekstrüde edilmemiş lipozomlar içeren şırıngadan toplanmamasını sağlamak için her zaman tek bir sayı kullanılır.Son olarak, sağ şırınganın içeriğini nazikçe bir Eppendorf tüpüne dağıtın. Tüpü yaklaşık 30 dakika boyunca düşük hızda dönen bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Vezikül saflaştırma mobil fazını hazırlamak için, 15 mililitrelik bir Falcon tüpünde beş mililitre 250 milimolar Tris-HCL pH 8 hidrasyon tamponu hazırlayın.Daha sonra hidrasyon tamponuna 37.5 mikrolitre 10 molar sodyum hidroksit ekleyin. Falcon tüpüne 235 mikrolitre saf oleik asit pipetleyin, bu da 0.15 molar toplam lipid içeren bir vezikül çözeltisi elde edilmesini sağlar. Ardından, karışımı dört ila beş saniye boyunca girdaplamak için yüksek hızlı bir girdap kullanın.Ardından, en az iki saat boyunca düşük hızda dönen bir çalkalayıcı üzerinde yuvarlanın. Lipid hazırlığı, bu noktada dönen çalkalayıcı üzerinde gece boyunca bırakılabilir. Olası agregaları gidermek için mobil fazı 0,22 mikronluk bir şırınga filtre ünitesinden süzün.Vezikülleri saflaştırmak için önce Sepharose 4B kolonunu metin protokolünde detaylandırıldığı gibi hazırlayın ve imbik standına sıkıştırın. Ardından kolonun ucunu stop cock konektörüne bağlayın ve boruyu fraksiyon toplayıcıya bağlayın. Boruyu yıkamak için başka bir tampon parçası ekleyin ve kolondaki sıvı seviyesi reçinenin üst kısmına yaklaştığında durdurma musluğunu kapatın.Daha sonra, ekstrüde edilmiş vezikülleri 200 mikrolitrelik bir pipetleyici kullanarak reçinenin üstüne uygulayın ve vezikül preparatını reçine yatağına veya kolon duvarına dokunmadan reçineye mümkün olduğunca eşit bir şekilde uygulamaya özen gösterin. Akışı başlatmak için durdurma musluğunu açın ve fraksiyonları 96 oyuklu bir plakada toplamaya başlayın. Reçine yatağının kurumasına izin vermemeye dikkat ederek, tampon tükendikçe vezikül saflaştırma mobil fazını reçine yatağının üstüne 0,5 ila bir mililitrelik porsiyonlar halinde uygulayın.Daha sonra eluenti en az 36 kuyu toplayarak beş damla fraksiyonlar halinde toplayın. Saflaştırma fraksiyonlarını karakterize etmek için, bir plaka okuyucudaki 96 oyuklu plakayı okuyun. Elde edilen floresan verilerini floresan ve kesir sayısı olarak çizin.Veziküller önce elüte, ardından kapsüllenmemiş fraksiyon gelir. Ligandlanmış magnezyum kullanırken, magnezyum klorür ve potasyum sitratı belirtilen oranda 250 milimolar Tris-HCL pH 8 tamponunda önceden karıştırın. Burada, kararlı oleik asit vezikülleri için bir ila dört oranı kullanılır.Her zaman magnezyum ve ligand çözeltisini önceden karıştırmayı unutmayın. Yağ asidi veziküllerini asla tek başına şelatsız magnezyuma maruz bırakmayın. Önceden karıştırılmış magnezyum sitrat çözeltisini vezikül örneğine ekleyin.Karışımı kısaca girdaplayın. Vezikül örneğini, metin protokolünde açıklandığı gibi yeniden saflaştırmadan önce en az 30 dakika bir bardakta bırakın. Vezikül örneğindekiyle aynı magnezyum ve sitrat konsantrasyonunu yeniden saflaştırma mobil fazına eklediğinizden emin olun.Kendi kendine bölünme reaksiyonunu başlatmak için magnezyum çözeltisini metin protokolünde açıklandığı gibi saflaştırılmış veziküllerle karıştırın. Kinetik çalışmalar için, her zaman noktasında karışımdan 100 mikrolitre alın ve bu alikotu, mobil faz olarak 250 milimolar Tris-HCL pH 8 olan bir Sepharose 4B boyut dışlama sütunu aracılığıyla doğrudan yeniden saflaştırın. Vezikül fraksiyonunu toplayın.RNA yükleme örneğini metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Ticari olarak dökülen %15 TBE üre jelini jel kutusuna yerleştirin ve jel kutusunu 1X TBE jel çalıştırma tamponu ile doldurun. Numuneleri 80 santigrat derece ısı bloğunda bir dakika ısıttıktan sonra, oyuk başına her numuneden beş mikrolitre yükleyin.Jeli yaklaşık bir saat boyunca sabit 200 volt ile çalıştırın. En sonunda, jeli tarayın ve bir analiz programı ile nicelleştirin. RNA'nın protohücreler içinde işlev görebileceğini göstermek için, floresan etiketli substrat zinciri ile çekiç başlı ribozim kendi kendine bölünme, bir model RNA katalitik reaksiyonu olarak kullanıldı.Bu reaksiyon, katalizi kolaylaştırmak için serbest magnezyum gerektirir. Bu nedenle, beş milimolar magnezyum varlığında stabil oldukları için oleik asit / gliserol monooleat vezikülleri kullanıldı. Çekiç başlı ribozim kendi kendine bölünme reaksiyonu, jel elektroforezi ile izlenebilir.Sayfa görüntüsünü ölçtükten sonra, belirli bir zaman noktasında kalan alt tabaka miktarının zamana karşı başlangıçtaki alt tabaka miktarına oranının doğal logaritmasının doğrusal bir uyumu oluşturulur. Bu grafik, ribozim aktivitesi hesaplaması için kullanılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, kapsüllenmiş boya veya RNA'ya sahip yağ asidi lipozomları 24 saat içinde hazırlanabilir ve saflaştırılabilir.Bu prosedürü denerken, veziküllerin çözünmesini önlemek için doğru pH aralığında yağ asidi lipozomları oluşturmayı ve toplam lipid konsantrasyonunu lipidin kritik agregasyon konsantrasyonunun üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, yağ asidi lipozomlarının nasıl hazırlanacağını ve bunların biyokimyasal reaksiyonlara ev sahipliği yapmak için nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

preparation-purification-and-use-of-fatty-acid-containing-liposomes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokol, homojen bir yüksek derecede mikronaltı boyutlarda lipid kesecikler hazırlanması için bir çekme yöntemi açıklar. Bu yöntem, lipozom preparatı için kontrollü bir nitrojen akışı hızları ile bir basınç kontrol sistemi kullanır. Lipid...

Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi

Biyokimyasal olarak tanımlanmış büyük tek tabakalı veziküller (LUV'ler), BCL-2 ailesi etkileşimlerini analiz etmek için uygun bir model sistemdir ve apoptozun mitokondriyal yolunun daha iyi anlaşılmasında doğrudan etkileri vardır. LUV üretme yöntemiyle birlikte, LUV permeabilizasyonunu incelemek için standart BCL-2 ailesi protein kombinasyonları ve kontroller sunulmaktadır.

Büyük ünilamellar Veziküller ile incelenmesi BCL-2 Aile Fonksiyonu

Kaynak: Ginies, C., ve diğerleri. Bacillus cereus'ta Yağ Asitlerinin Tanımlanması. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, biyokütleyi alkali bir çözelti ile işleyerek bakteri örneklerinden yağ asidi metil esterlerinin (FAME'ler) hazırlanması, ardından aşağı akış analizi için faz ayırma ve çözücü buharlaştırma sürecini göstermektedir.

Bakteriyel Biyokütleden Yağ Asidi Metil Esterlerinin (FAME'ler) Hazırlanması

Yama-kelepçe elektrofizyoloji ile kombine edildiğinde tanımlanan kompozisyon dev lipozomlar içine fonksiyonel membran proteinleri yeniden kurgulamak güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, geleneksel dev lipozom üretim protein istikrar ile uyumsuz olabilir. Biz saf lipidler veya iyon kanalları içeren küçük lipozomlar gelen dev lipozomlar üretmek için protokolleri tarif.

Görüntüleme ve Patch-Kelepçe Elektrofizyoloji için dev Liposome Hazırlık

Desteklenen lipid çift katmanlarının hazırlanması ve atomik kuvvet mikroskobu ve kuvvet spektroskopisi kullanılarak karakterizasyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Burada hedef lipid bilayers postfusion bilayer içine bu membran proteinlerinin deterjan ücretsiz teslim etmek için ile ultrafast protokollerinden membran proteinlerinin fusogenic proteoliposomes içine sulandırma ve böyle proteoliposomes füzyonu için mevcut. Bu yaklaşımlardan birleşimini karmaşık çok bileşenli Membran sistemleri hızlı ve kolayca kontrollü montaj sağlar.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Bu yöntem, özellikle Staphylococcus aureusgibi kompleks ana kaynaklardan gelen eksojen yağ asitleri dahil etmek için bir çerçeve sağlar. Bunu başarmak için, tavuk yumurtası sarısı ve kütle spektrometresi kullanan bakteriyel fosfolipidlerin sonraki yağ asidi profillerinden lipoprotein parçacıklarının zenginleşmesi için protokoller açıklanmıştır.

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Bu çalışmada nanopartikül karakterizasyonu takip nanoliposome hazırlık için ince lipid film yöntemi kullanılarak klasik hidrasyon açıklanır. A 47 kDa-hidrofilik ve küresel protein, tarin, başarıyla istikrarı artırmak için bir strateji olarak kapsüllenir, hızlı açıklık önlemek, ve kontrollü salınımı teşvik. Bu yöntem hidrofobik moleküllerkapsülasyonuna adapte edilebilir.

Biyoaktif Hidrofilik Globüler Proteinlerin Tuzakları Için Nanoliposomes Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Protokol, sendelenmiş herringbone micromixer microfluidics cihazını kullanarak termosensitli lipozomların hazırlanması için optimize edilmiş parametreleri sunar. Bu aynı zamanda lipozomlar içine doksorubisin ve indosiyanyeşil co-kapsülleme ve kontrollü / tetiklenen ilaç salınımı için doksorubisin fototermal tetiklenen serbest sağlar.

Lysolipid İçeren Sıcaklığa Duyarlı Lipozomların Mikroakışkan Üretimi

Bu protokolün amacı, floresan olarak etiketlenmiş lipozomları sentezlemek ve lipozomların hücresel düzeyde in vivo lokalizasyonunu tanımlamak için akış sitometrisini kullanmaktır.

Floresan Boya Etiketli Lipozomların İn Vivo Dokuya Özgü Hücresel Alımının Hazırlanması, Uygulanması ve Değerlendirilmesi

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Öğrenin yağ asidi lipozomlarının hazırlanması, arıtılması ve kullanımı için bu biyokimya yöntemini. Sentetik biyoloji ve yaşamın kökeni araştırmalarında minimal hücreler oluşturmaya yardımcı olur.

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Daha fazla video keşfet