Bir fare pankreas adacık hücre tabanlı tarama diyabetojenik çevresel kimyasallar için

Pankreas hücreleri, tip 2 diyabet gelişimi ile ilişkili olan ROS kaynaklı hasarlar için hassas bir hedeftir. Pankreas hücresi bazlı tahliller, ROS indükleyen kimyasalların tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniğin ana avantajı, ilave diyabetojenik potansiyellere sahip olabilecek ROS indükleyici kimyasalların basit ve etkili bir şekilde tanımlanması için izole edilmiş pankreas adacık hücrelerinin kullanılmasıdır.

Bu yöntem aynı zamanda, kimyasalların pankreasın glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu gibi fizyolojik bir işlevi üzerindeki etkileri üzerine in vitro analiz için de kullanılabilir. Duodenumu Oddi sfinkterinin konumuna yakın bir şekilde sıkıştırmak için bir çift kavisli forseps kullanın. Başka bir çift kavisli forseps ile, safra yolunu tıkamak için duodenum duvarını sıkıştırın.

Ortak safra kanalını bulun ve 30 gauge iğne ve beş mililitrelik bir şırınga ile yavaşça üç mililitre kollajenaz çözeltisi enjekte edin. Ardından, fareyi başı proksimal ve ayakları distal olacak şekilde yeniden konumlandırın. Enjeksiyondan sonra koledok ve pankreasın şişirildiğinden emin olun.

Kavisli forseps ve ince makas kullanarak, inen kolon, bağırsaklar, mide ve dalaktan ayırmak için şişmiş pankreası çıkarın. Daha sonra organı üç mililitre kollajenaz çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve buz üzerinde tutun. Her 50 mililitrelik tüpü 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin ve 15 ila 20 dakika inkübe edin.

Tüpleri girdaplayın, ardından dört ila beş sindirilmiş organı büyük bir steril lavabo süzgecinde toplayın ve pankreası iyice parçalamak için bir kepçe kullanın. 23 gauge iğne ve yıkama solüsyonu içeren on mililitrelik bir şırınga ile sindirilmiş hücreleri ekrandan kuvvetlice pipetleyin. Ardından, yıkama solüsyonunu 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Tüpleri bir dakika boyunca 97g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın. Tüplere 25 mililitre yıkama solüsyonu ekleyin ve hafifçe girdap yaparak dokuyu yeniden süspanse edin. Ardından, dokuyu aşağı doğru döndürün ve süpernatanı boşaltın.

Yıkamayı üç kez tekrarlayın, peletlenmiş dokuyu yerinden çıkarmamaya dikkat edin. Adacıkları saflaştırmak için, yıkanmış doku peletine on mililitre saflaştırma çözeltisi ekleyin ve içeriği nazikçe yeniden süspanse edin. Arıtma çözeltisinin üzerine beş mililitre izolasyon solüsyonunu nazikçe yerleştirin.

İki çözelti arasında keskin bir sıvı arayüzünün korunduğundan emin olun. Tüpü 560 g'da dört santigrat derecede 15 dakika boyunca, yavaş hızlanma ve ara vermeden santrifüjleyin. Ardından, pipeti arayüze yerleştirin ve adacık tabakasını toplayın.

Az önce gösterildiği gibi adacığı yıkamadan önce çözeltiyi yeni 50 mililitrelik tüplere aktarın. Son yıkamayı çıkardıktan sonra, on mililitre adacık kültürü çözeltisi ekleyin ve adacıkları yeniden süspanse etmek için nazikçe ve iyice karıştırın. Daha sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak, oyuk başına 100 mikrolitreyi 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın.

Plakayı bir doku kültürü inkübatöründe 12 saat inkübe edin. Ardından, plakayı 112 g'da santrifüjleyin ve kültür ortamını çıkarın. Çevresel kimyasalları adacık kültürü ortamında seyreltin.

Kimyasal seyrelticilerin her birinden 100 mikro litre plakanın ayrı kuyucuklarına ekleyin. Her bir oyuktaki adacıkları yeniden askıya alın ve plakayı 12 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Adacıkların kimyasal olarak işlenmesinden sonra, numuneleri yıkamak için 1x PBS kullanın.

Daha sonra, ROS'u söndürmek için bir antioksidan olarak kuyucuklara beş milimolar N-Asetil Sistein veya NAC ekleyin ve plakaları 12 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 96 oyuklu plakayı 112 g'de santrifüjleyin, ardından beş mikromolar floresan prob çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. İşlem görmüş adacık hücrelerini üç kez yıkamak için PBS kullanın ve floresansı ölçmek için 480 nanometrede bir mikroplaka okuyucu kullanın.

Son olarak, pankreas adacıklarının fizyolojik fonksiyonu üzerindeki ksenobiyotik etkileri ölçmek için ROS indükleyen ksenobiyotik ile muamele edilmiş ve tedavi edilmemiş adacıklar üzerinde glikoz ile uyarılmış insülin sekresyonunu veya GSIS testini gerçekleştirin. Burada gösterilen, C57 Black/6 farelerinden izole edilmiş, yuvarlak veya oval şekilli ve nispeten tek tip boyutta olan sağlıklı pankreas adacıklarıdır. Bu GSIS testinde, insülini salgılamak için glikoz ile uyarılan izole adacıklar kullanılarak, doza bağlı bir yanıt gözlenmiştir.

İzole edilmiş adacıklar burada listelenen ksenobiyotiklerle tedavi edildiğinde, Atrazin, BaP, BPA ve PCB dahil olmak üzere çeşitli kimyasallar reaktif oksijen türlerinin önemli bir indüksiyonuna neden oldu. Bununla birlikte, NAC ilavesi, kimyasal işlemlerle ROS üretimini söndürebildi. Ek olarak, PCB126 ve BPA ile ön işleme tabi tutulan pankreas adacıkları, kontrol grubuna kıyasla insülin sekresyonunda önemli bir azalma gösterdi ve ROS'un T2DM'ye yol açan pankreas beta hücrelerinin fizyolojik fonksiyonuna zarar vermedeki önemli rolünü doğruladı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, pankreas adacıklarının izolasyonu, uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, adacıkları diğer pankreas kalıntılarından arındırmak için gradyan santrifüjleme kullanmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kimyasalların pankreas adacıklarının fizyolojik fonksiyonları üzerindeki etkileri gibi ek soruları yanıtlamak için glikoz ile uyarılan insülin salgılanması gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, toksikoloji alanındaki araştırmacıların, izole fare pankreas adacık hücrelerindeki çevresel kimyasalların diyabetojenik potansiyellerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, fare pankreas adacıklarını nasıl izole edeceğinizi ve bu adacık hücrelerini tanımlama için nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.