Name: Bir fare pankreas adacık hücre tabanlı tarama diyabetojenik çevresel kimyasallar için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Öğrenin fare pankreas adacık hücre izolasyonunu ve diyabetojenik çevresel kimyasalları tarama yöntemini. Bu teknik, reaktif oksijen türlerini tetikleyen maddeleri belirlemek için in vitro analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser CREH merkezi NIEHS tarafından ve Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (No. 31572626) tarafından desteklenen bir pilot proje hibe tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri tüm ilgili kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak idam edildi. Gösterilen iletişim kuralı rehberlik ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Texas A & M Enstitüsü onaylanması için genomik Tıp altında gerçekleştirildi.
1. çözüm hazırlık
<ol><li>Çift Kişilik distile H2O ile 1 x 10 x Hank'in dengeli tuz solüsyonu sulandırmak ve 4 ° C'de depolayın</li>
	<li>Yalıtım çözüm HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) ve glikoz (5 mM) ekleyerek hazırlayın. PH 7.4 için ayarlamak ve buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Collagenase tip 4 collagenase çözümden hazırlayın. Not: Özellikle, collagenase tip 4 160 mg kuru ağırlığının U içerir. collagenase tip 4 1 g 5 mL Çift Kişilik distile H2O 200 mg/mL bir konsantrasyon ile seyreltilmiş. seyreltilmiş Collagenase 2 mL 30 mL buz soğuk izolasyon çözüme eklenir ve 6 mL collagenase çözeltisi 50 mL tüp her fare için transfer edilir.</li>
	<li>Yıkama çözüm yalıtım çözüm 1 mM CaCl2 ekleyerek hazırlayın.</li>
	<li>Soğuk polysucrose/sodyum diatrizoate çözüm (1.1119 g/mL, 5 mL) ile arıtma çözüm hazırlamak.</li>
	<li>Adacık kültür ortamının 500 mL L-glutamin (20 mM), penisilin (100 U/mL), streptomisin (100 µg/mL) ve fetal Sığır serum (FBS) (% 10) RPMI orta ekleyerek hazırlayın.</li>
	<li>DCFH-DA hisse senedi çözüm toz 200 µM, distile su ve store-20 ° C'de çözülerek hazırlamak Not: Çözüm boyama ROS taze DCFH-DA hisse senedi eriyik-e doğru RPMI içinde 5 mikron son konsantrasyonu sulandrarak yapılır. Bu reaktif ışıktan korunmalıdır.</li>
</ol>2. cerrahi hazırlık
<ol><li>İntraperitoneally (IP) bir fare ile avertin (%2.5 avertin, 0.4 mL/20 g) enjekte et. Sonra fare tamamen anestezi ve artık yanıt hind için pinch ayak, fare ötenazi ve biyolojik hood taşır.</li>
	<li>Karın yüzü yukarı bakacak şekilde euthanized fareyi getirin ve sterilizasyon için % 70 etanol ile cilt sprey.</li>
	<li>Karın üst karın üzerine 1 cm U-kesi ile açın ve karın boşluğu ortaya çıkarmak için göğüs üzerinde cilt rostral yönde geri çek.</li>
</ol>3. pankreas perfüzyon ve kaldırma
<ol><li>Şekil 1' de gösterildiği gibi ampulla konumunu bulmak. Duodenum Oddi Sfinkter konumunu yakın kelepçe için Kıvrımlı pensler bir çift kullanın. Bir çift daha Kıvrımlı pensler duodenum safra yolu engellemek için oniki parmak bağırsağı duvar kelepçe için kullanın. Not: Ampulla Bu adımda eklenen değil. Bu adımı duodenum safra yolu engellemek içindir.</li>
	<li>Fareyi başından proksimal ve distal açısından araştırmacı ayak yeniden konumlandırın.</li>
	<li>Ortak safra kanalını bulmak ve yavaş yavaş 30 G iğne ve 5 mL şırınga ile 3 mL collagenase çözeltisi enjekte. Ortak safra kanalını ve pankreas enjeksiyon sonra şişirilir emin olun.</li>
	<li>Şişmiş pankreas inen kolon, bağırsak, mide ve dalak ayırmak için Kıvrımlı pensler ve iyi makas kullanarak kaldırın. Pankreas 3 mL collagenase çözeltisi içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirin ve buz üzerinde tutun.</li>
</ol>4. pankreas sindirim
<ol><li>Her 50 mL tüp 37 ° C su banyosu yerleştirin. 15-20 dk için kuluçkaya (süre değişir zorlanma ve fareler yaş ile).</li>
	<li>Bir girdap kullanarak boru titremek.</li>
	<li>4-5 büyük steril lavabo süzgeç sindirilir pankreasta havuz ve iyice darmadağın pankreas yapmak için bir kaşık kullanabilirsiniz. Zorla ekrandan sindirilir hücreleri pipette için yıkama solüsyon içeren 23 G iğne ve 10 mL şırınga kullanın. 50 mL tüp yıkama çözümde toplamak.</li>
	<li>Tüpler, 97 x g 4 ° c için 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak.</li>
	<li>Tüpler için 25 mL yıkama çözeltisi ekleyin ve doku nazik vortexing tarafından yeniden askıya alma. Spin aşağı doku, 97 x g 1 dk. için 4 ° C'de ve süpernatant dikkatle boşaltmak. İçin 3 kez tekrarlayın. Pelleted doku çıkarmak değil dikkatli olun.</li>
</ol>5. arıtma adacıkları
<ol><li>Arıtma Çözüm 10 mL yıkanmış doku Pelet ekleyin ve hafifçe içeriği resuspend.</li>
	<li>Yavaşça 5 mL yalıtım çözeltisi arıtma çözüm üzerinde yerleşimi. İki çözüm arasında keskin bir sıvı arayüzü tutmak için dikkatli olun.</li>
	<li>Tüp 4 ° C'de 15 dakika yavaş ivme ile de g x 560 ve fren yok santrifüj kapasitesi. Pipet arayüzü içine yerleştirin ve adacıkları katman yeni 50 mL tüpler içine toplamak.</li>
	<li>Adacıkları 3.5 adımda anlatıldığı gibi yıkayın.</li>
</ol>6. kaplama ve adacık hücreleri tedavi
<ol><li>Adacıkları adacıkları kültür çözüm 10 mL resuspend, yavaşça karıştırın ve 100 µL/iyi bir 96-şey plaka için çok kanallı pipet ile yerleştirin. 96 başına yaklaşık 5 adacıktan de yerleştirin.</li>
	<li>12 h için doku kültürü kuluçka plaka yerleştirin.</li>
	<li>96-şey plaka (112 x g) santrifüj kapasitesi ve kültür orta kaldırın.</li>
	<li>Çevresel kimyasallar adacıkları kültür orta sulandırmak. Her birinin kimyasal seyrelticiler 100 µL plaka ayrı kuyu ekleyin. Her iyi adacıkları resuspend ve 12 h (konsantrasyonu farklı çevresel kimyasallar için değişir) 37 ° C'de için kuluçkaya.</li>
</ol>7. ROS boyama ve ölçüm
<ol><li>1 x PBS ile adacıkları tedaviden sonra yıkayın (her 96-kuyu 200 µL). Not: Kimyasal konsantrasyonu olarak takip olduğunu: AFB1: 3 µM, Atrazine: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-östrojen, PCB126: 10 µM, Nonylphenol ve BPA: 100 µM.</li>
	<li>N-asetil sistein (NAC) bir antioksidan ROS gidermek için kullanın. NAC 5 mM ROS kaynaklı kimyasal seyrelticiler ekleyin ve 37 ° C'de 12 h için kuluçkaya</li>
	<li>96-şey plaka 112 x g, santrifüj kapasitesi ve 60 dk 37 ° C'de 5 µM çözüm floresan inceleyebilirsek (H2-DCFH-DA RPMI ortamda çözünmüş) ile kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez PBS ile tedavi adacık hücreleri yıkama ve floresan 488 bir Mikroplaka Okuyucu ile ölçmek nm. Not: DCF hücrelerdeki birikimi artış tarafından 530, floresans içinde ölçülen örnek 488 heyecanlı zaman nm nm.</li>
	<li>Glikoz uyarılmış insülin salgılanması (GSIS) tahlil9 xenobiotic ROS-inducing gerçekleştirmek tedavi adacıkları ve tedavi edilmezse adacıkları pankreas adacıkları fizyolojik fonksiyonu xenobiotic etkisini ölçmek için.</li>
</ol>

<ol><li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes%3A+increased+incidence+or+improved+survival%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
<li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538(2012).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li>
<li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+in+%CE%B2-cells%3A+type+2+diabetes%2C+good+radicals+gone+bad%2C+and+the+glutathione+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li>
<li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells%3A+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li>
<li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li>
<li>Efendić, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreastatin+and+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li>
<li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ah+receptor+and+NF-%CE%BAB+interactions%2C+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR%2FCyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-%5B%CE%B1%5D-pyrene-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li>
<li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCB126+induces+differential+changes+in+androgen%2C+cortisol%2C+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li>
<li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2565847/">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Kanıt biriken öneriyor çevresel kimyasallar o maruz T2DM gelişiminde önemli bir rol oynar. Xenobiotics kaynaklı ROS T2DM gelişmesine katkıda bulunan bir potansiyel etyolojik faktör olarak kabul edilmiştir. İnsanlar xenobiotic kimyasalların geniş bir dizi sunulur ve bir büyük gerek roman araştırma teknikleri etkili pankreas toxicants tanımlamak ve toksisite pankreas hücreleri belirli mekanizmasının araştırmak için.
Bu çalışmada, yayımlanmış yordamlar14, dayalı geliştirdi...

T2DM yaygınlığı artışlar küresel sağlık krizi son yıllarda poz halk sağlığı1için ciddi bir tehdit haline gelmiştir. Pek çok faktör bulunmuştur nedensel T2DM, geliştirme arasında hangi, bağlanacak şekilde yinelenen bulgular bu faktörler için bir ortak yakınsak noktası aşırı ROS2 nesil uzaklaşan oksidatif stres indüksiyon olduğunu göstermektedir , 3.
Çevresel kimyasallar PCB, dioksin ve BaP gibi geniş bir yelpazede pankreas β hücrelerinin işlevini bozabilir ve insülin direnci ve T2DM4yol oksidatif stres, neden tespit edilmiştir. Her ne kadar ROS fizyolojik düzeyi hücresel işlevlerinde önemli bir rol oynar, antioksidan sistem kapasitesini aşıyor ROS maruz hücreler/dokulara zarar sonuçları ve hastalıklar5' e götürür. Pankreas Beta hücreleri antioksidan enzim düşük düzeyde hızlı ve dolayısıyla oksidatif stres-aracılı hasar6,7için önemli bir hedef. Kronik ROS yüksek düzeyde maruz stres kaynaklı pankreas hücresi disfonksiyon5 neden için gösterilen yanı sıra karaciğer ve yağ dokusu8insülin direnci.
Bu projenin genel amacı bir hücre tabanlı tahlil ekran kimyasallara ROS pankreas hücreleri içinde onların indüksiyon dayalı onların diyabetojenik potansiyeller için geliştirmektir. Pankreas ve metabolik detoksifikasyon yoksun xenobiotic indüklenen zarar6,7için önemli bir hedeftir. Bu nedenle, doğrudan pankreas hücrelerinde üretilen ROS ölçerek, bu tahlil pankreas kimyasal kaynaklı yaralanma doğrudan bir yaklaşım sağlamalıdır. Bu yöntem geliştirmek için biz fare pankreas adacıkları izole, izole adacık hücre kültür koşul kimyasallar ile altında kültürlü ve kimyasal kaynaklı ROS üretimi okuma olarak kullanılmaktadır. Bu basit ve izole adacık kimyasal maddeler ROS-inducing belirlenmesinde etkili işlemdir; soruşturma için pankreas içinde vitroözgü mekanizmaları toksisite için daha fazla geliştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>10 kez; Hank' S Dengeli Tuz Çözeltisi&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip 4</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>polisekroz / sodyum diatrizoat çözeltisi &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2 ',7'-diklorofloresein (DCFH-DA)</td> <td>Sigma</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>floresan mikroplaka okuyucu ve nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>streptomisin</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan / Fare İnsülin ELISA Kiti</td><td>Millipore</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka santrifüjü için</td> <td>Santrifüj</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td></tr><tr><td>Floresan okuma için</td> <td>mikroplaka okuyucu</td><td>Biotek</td><td>Epoch 2</td></tr></tbody></table>

bir fare pankreas adacık hücre tabanlı tarama diyabetojenik çevresel kimyasallar için

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Bazı çevresel kimyasallar insan ve hayvanlarda maruz hangi-ecek götürmek tip 2 diabetes mellitus (T2DM) gelişimi için pankreas β hücrelerinin hücre hasarına neden tespit edilmiştir. Kimyasal kaynaklı β hücre hasarı için mekanizmalar belirsiz ve karmaşık olması olasılığı olmasına rağmen bir yinelenen bu kimyasalların oksidatif stres zarar neden aşırı reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi için önde gelen neden bulgudur β hücre. Potansiyel diyabetojenik çevresel kimyasallar tanımlamak için C57BL/6 fareler pankreas adacık hücreleri ve kültürlü adacık hücreleri 96-şey hücre kültür tabak içinde izole; daha sonra adacık hücreleri kimyasallar ile ilaç ve ROS üretimi 2' tarafından 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) floresan boya tespit edildi. Bu yöntemi kullanarak, biz o Bisfenol A (BPA), Benzo [a] dumanında (BaP), Poliklorlu bifeniller (PCB) bulup, potansiyel olarak adacık hücreleri hasara neden olabilir düşündüren ROS, yüksek düzeyde neden. Bu yöntem diyabetojenik xenobiotics eleme için yararlı olmalıdır. Buna ek olarak, kültürlü adacık hücreleri de kimyasal kaynaklı toksisite pankreas hücreleri vitro analiz için adapte olabilir.

Sağlıklı izole adacık test adacıkları olan bir yuvarlak veya oval şekil (boyutu tekdüzelik zorlanma zorlanma değişebilir rağmen) nispeten boyutu üniforma olduğu Şekil 2' de gösterilmiştir. Biz sonraki adacık yalıtma ve kültür adacıkları insülin salgılanmasını uyarıcı bir vitro tahlil pankreas adacık işlevlerinde araştırdık. Şekil 3 C57BL/6 izole fare adacıkları 3,3 mM ve 16,7 mM glikoz9tarafından ...

Burada potansiyel diyabetojenik xenobiotic kimyasallar tanımlamak için xenobiotics tarafından ROS indüksiyon süzmek için fare pankreas adacık hücreleri izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Bir fare pankreas adacık hücre tabanlı tarama diyabetojenik çevresel kimyasallar için

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Pankreas hücreleri, tip 2 diyabet gelişimi ile ilişkili olan ROS kaynaklı hasarlar için hassas bir hedeftir. Pankreas hücresi bazlı tahliller, ROS indükleyen kimyasalların tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniğin ana avantajı, ilave diyabetojenik potansiyellere sahip olabilecek ROS indükleyici kimyasalların basit ve etkili bir şekilde tanımlanması için izole edilmiş pankreas adacık hücrelerinin kullanılmasıdır.Bu yöntem aynı zamanda, kimyasalların pankreasın glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu gibi fizyolojik bir işlevi üzerindeki etkileri üzerine in vitro analiz için de kullanılabilir. Duodenumu Oddi sfinkterinin konumuna yakın bir şekilde sıkıştırmak için bir çift kavisli forseps kullanın. Başka bir çift kavisli forseps ile, safra yolunu tıkamak için duodenum duvarını sıkıştırın.Ortak safra kanalını bulun ve 30 gauge iğne ve beş mililitrelik bir şırınga ile yavaşça üç mililitre kollajenaz çözeltisi enjekte edin. Ardından, fareyi başı proksimal ve ayakları distal olacak şekilde yeniden konumlandırın. Enjeksiyondan sonra koledok ve pankreasın şişirildiğinden emin olun.Kavisli forseps ve ince makas kullanarak, inen kolon, bağırsaklar, mide ve dalaktan ayırmak için şişmiş pankreası çıkarın. Daha sonra organı üç mililitre kollajenaz çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve buz üzerinde tutun. Her 50 mililitrelik tüpü 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin ve 15 ila 20 dakika inkübe edin.Tüpleri girdaplayın, ardından dört ila beş sindirilmiş organı büyük bir steril lavabo süzgecinde toplayın ve pankreası iyice parçalamak için bir kepçe kullanın. 23 gauge iğne ve yıkama solüsyonu içeren on mililitrelik bir şırınga ile sindirilmiş hücreleri ekrandan kuvvetlice pipetleyin. Ardından, yıkama solüsyonunu 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.Tüpleri bir dakika boyunca 97g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın. Tüplere 25 mililitre yıkama solüsyonu ekleyin ve hafifçe girdap yaparak dokuyu yeniden süspanse edin. Ardından, dokuyu aşağı doğru döndürün ve süpernatanı boşaltın.Yıkamayı üç kez tekrarlayın, peletlenmiş dokuyu yerinden çıkarmamaya dikkat edin. Adacıkları saflaştırmak için, yıkanmış doku peletine on mililitre saflaştırma çözeltisi ekleyin ve içeriği nazikçe yeniden süspanse edin. Arıtma çözeltisinin üzerine beş mililitre izolasyon solüsyonunu nazikçe yerleştirin.İki çözelti arasında keskin bir sıvı arayüzünün korunduğundan emin olun. Tüpü 560 g'da dört santigrat derecede 15 dakika boyunca, yavaş hızlanma ve ara vermeden santrifüjleyin. Ardından, pipeti arayüze yerleştirin ve adacık tabakasını toplayın.Az önce gösterildiği gibi adacığı yıkamadan önce çözeltiyi yeni 50 mililitrelik tüplere aktarın. Son yıkamayı çıkardıktan sonra, on mililitre adacık kültürü çözeltisi ekleyin ve adacıkları yeniden süspanse etmek için nazikçe ve iyice karıştırın. Daha sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak, oyuk başına 100 mikrolitreyi 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın.Plakayı bir doku kültürü inkübatöründe 12 saat inkübe edin. Ardından, plakayı 112 g'da santrifüjleyin ve kültür ortamını çıkarın. Çevresel kimyasalları adacık kültürü ortamında seyreltin.Kimyasal seyrelticilerin her birinden 100 mikro litre plakanın ayrı kuyucuklarına ekleyin. Her bir oyuktaki adacıkları yeniden askıya alın ve plakayı 12 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Adacıkların kimyasal olarak işlenmesinden sonra, numuneleri yıkamak için 1x PBS kullanın.Daha sonra, ROS'u söndürmek için bir antioksidan olarak kuyucuklara beş milimolar N-Asetil Sistein veya NAC ekleyin ve plakaları 12 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 96 oyuklu plakayı 112 g'de santrifüjleyin, ardından beş mikromolar floresan prob çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. İşlem görmüş adacık hücrelerini üç kez yıkamak için PBS kullanın ve floresansı ölçmek için 480 nanometrede bir mikroplaka okuyucu kullanın.Son olarak, pankreas adacıklarının fizyolojik fonksiyonu üzerindeki ksenobiyotik etkileri ölçmek için ROS indükleyen ksenobiyotik ile muamele edilmiş ve tedavi edilmemiş adacıklar üzerinde glikoz ile uyarılmış insülin sekresyonunu veya GSIS testini gerçekleştirin. Burada gösterilen, C57 Black/6 farelerinden izole edilmiş, yuvarlak veya oval şekilli ve nispeten tek tip boyutta olan sağlıklı pankreas adacıklarıdır. Bu GSIS testinde, insülini salgılamak için glikoz ile uyarılan izole adacıklar kullanılarak, doza bağlı bir yanıt gözlenmiştir.İzole edilmiş adacıklar burada listelenen ksenobiyotiklerle tedavi edildiğinde, Atrazin, BaP, BPA ve PCB dahil olmak üzere çeşitli kimyasallar reaktif oksijen türlerinin önemli bir indüksiyonuna neden oldu. Bununla birlikte, NAC ilavesi, kimyasal işlemlerle ROS üretimini söndürebildi. Ek olarak, PCB126 ve BPA ile ön işleme tabi tutulan pankreas adacıkları, kontrol grubuna kıyasla insülin sekresyonunda önemli bir azalma gösterdi ve ROS'un T2DM'ye yol açan pankreas beta hücrelerinin fizyolojik fonksiyonuna zarar vermedeki önemli rolünü doğruladı.Bir kez ustalaştıktan sonra, pankreas adacıklarının izolasyonu, uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, adacıkları diğer pankreas kalıntılarından arındırmak için gradyan santrifüjleme kullanmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kimyasalların pankreas adacıklarının fizyolojik fonksiyonları üzerindeki etkileri gibi ek soruları yanıtlamak için glikoz ile uyarılan insülin salgılanması gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, toksikoloji alanındaki araştırmacıların, izole fare pankreas adacık hücrelerindeki çevresel kimyasalların diyabetojenik potansiyellerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, fare pankreas adacıklarını nasıl izole edeceğinizi ve bu adacık hücrelerini tanımlama için nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

a-murine-pancreatic-islet-cell-based-screening-for-diabetogenic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Murin Pankreas Adacık İzolasyonu

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Kendini yenileme ve erişkin fare pankreas izole progenitör hücrelerin farklılaşmasını tespit etmek için in vitro koloni deneylerde icat edilir. Bu analizlerde, pankreas ataları metilselüloz içeren yan-katı bir ortam içinde 3-boyutlu bir uzayda hücre kolonileri yol açar. tek hücreler ve bireysel koloniler karakterizasyonu taşıma protokolleri açıklanmıştır.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek.

Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases tek hücreli RNA sıralama tarafından takip endokrin hücrelerden yalıtım için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, analizleri sağlar pankreatik endokrin lineage gelişimi, heterojen ve transcriptomic dinamikleri hücre.

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Termostabilite mühendisliği alanında belirli bir yeni yönlendirilmiş evrim yöntem bacteriolytic enzimler için geliştirilen ve sonuç olarak doğrulanmıştır. Yükseltilmiş sıcaklıkta inkübasyon sonrasında yabani-tip protein ile karşılaştırıldığında rasgele mutagenez sadece bir yuvarlak, gelişmiş bir bacteriolytic enzim, PlyC 29C3, iki kez etkinlik kalıntı daha fazla görüntülenen sonra.

Termostabil Bacteriolytic Enzimlerin yönlendirilmiş evrimi için Yeni Tarama Yöntemi

Öğrenin fare pankreas adacık hücre izolasyonunu ve diyabetojenik çevresel kimyasalları tarama yöntemini. Bu teknik, reaktif oksijen türlerini tetikleyen maddeleri belirlemek için in vitro analiz sağlar.

Bir fare pankreas adacık hücre tabanlı tarama diyabetojenik çevresel kimyasallar için

Daha fazla video keşfet