Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, embriyogenez, larva hareketi ve tümör oluşumu sırasında hücresel elektriksel değişikliklerin gözlemlenmesine izin veren transgenik bir zebra balığı hattı oluşturmaktır. Bu yöntem, gelişimsel biyoloji, fizyoloji ve kanser hücresi biyolojisi alanlarında, embriyogenez sırasında ve tümör hücrelerinde hücresel elektriksel sinyallemenin temel rolleri nelerdir gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücresel elektrik sinyallerini in vivo ve gerçek zamanlı olarak izlememize izin vermesidir.

Metin protokolüne göre Tol2 transpozaz mRNA'sı ve enjeksiyon solüsyonunu hazırladıktan sonra, enjeksiyondan öğleden sonra, en az iki erkek ve iki dişi ile dört ila altı üreme tankı kurun. Balık atığı miktarını azaltmak ve üreme tepkisi oluşturmak için balıkları öğleden sonra beslemekten kaçının. Ertesi sabah, hazırlanan enjeksiyon solüsyonunu eksi 80 derece dondurucudan çıkarın ve buzun üzerine koyun.

Balık yetiştirme tanklarındaki bölücüleri çekin ve balıkların çiftleşmesine izin verin. Genel olarak, balıklar 20 ila 30 dakika içinde yumurta bırakır. Beklerken, aşağıdaki parametrelere sahip bir mikropipet çektirmesi kullanarak, iğneleri kılcal camdan çekin.

İğnenin ucunu kırmak ve eğimli bir kenar oluşturmak için bir laboratuvar mendili kullanın. Embriyo mortalitesini azaltmak için daha küçük bir çap tercih edilir. Balıklar yumurtladıktan sonra, onları 10 santimetre çapında bir Petri kabında toplayın.

Hemen diseksiyon mikroskobu altında, tüm anormal embriyoları ve balık atıklarını çıkarın. Daha sonra döllenmiş embriyoları hazırlanmış% 3 agaroz enjeksiyon kalıbına pipetleyin. Embriyoların yerinde kalmasına yardımcı olmak için fazla suyu alın.

Tüm sıralar canlı embriyolarla doldurulduktan sonra, bunları, tek hücrelerin tümü iğneye göre yatay olarak 45 derecelik bir açıyla yönlendirilecek şekilde düzenleyin. Bu, enjeksiyonu daha sonra çok daha kolay hale getirecektir. Daha sonra, eldiven giyerken, hazırlanan yapının beş mikrolitresini buz üzerindeki tüpten çıkarmak için 20 mikrolitrelik bir yükleme pipet ucu kullanın.

Pipet ucunu, reaktifi uca mümkün olduğunca yaklaştırmak ve kılcal damara atmak için sivrilmeye başladığı yere dikkatlice yerleştirin. Hala hava kabarcıkları varsa, ucunu kırmamaya dikkat ederek iğneyi sallayın. İğneyi doğrudan mikro enjeksiyon iğnesi tutucusuna yerleştirin ve iğne yerinde kalana kadar dikkatlice sıkın.

Ardından açıyı yaklaşık 45 dereceye ayarlayın. İğne hazırlanıp takıldıktan sonra mikroskobu ve gaz basınç tankını açın. Tutma için yaklaşık 0.5 PSI ve çıkarma için 30 PSI kullanarak enjeksiyon hacmini ayarlayın.

Pedala basarken solüsyonun iğneden çıktığını kontrol edin. Bir damla mineral yağ içeren bir aşama mikrometresi kullanarak, çözeltinin hacmini ve akışını yaklaşık 10 mikrometre çapa ayarlayın. Karşı basıncın iğneden az miktarda çözelti damlamasına izin verdiğinden emin olun.

Yeterli geri basınç yoksa, kılcal hareket sıvının iğneye girmesine ve mRNA'nın tahrip olmasına neden olur. İğne kalibre edildikten sonra, embriyoyu yerinde tutan ve iğnenin embriyoyu hareket ettirmeden basınç uygulamasına izin veren bir destek sağlamak için jel çentiğinin kenarını kullanarak iğneyi döllenmiş embriyoların tek hücresine yerleştirin. İğnenin ucu tek hücreye girdikten sonra, istenen miktarda çözeltiyi serbest bırakmak için pedala basın.

Transgenik zebra balığı oluşturmak için çözeltinin yumurta sarısına değil hücreye enjekte edilmesi önemlidir. Bu işlemi tüm embriyolar için tekrarlayın. Tamamlandığında, enjekte edilen embriyoları agaroz çentiğinden durulayarak etiketli bir tabağa aktarmak için 3.4 mililitrelik bir transfer pipeti ve balık sistemi suyu kullanın.

Embriyoları gelişmelerine izin vermek için 28,5 santigrat derecelik bir inkübatörde saklayın. Ölü balık embriyolarını çıkarmak için gün boyunca tekrar kontrol edin ve suyu balık suyundaki% 0.1 metilen mavisi ile değiştirin. Enjeksiyondan yaklaşık altı ila sekiz saat sonra, genomik DNA hazırlamak için enjekte edilen 10 balık embriyosu ve hotshot yöntemini kullanın.

Ertesi sabah, yumurta sarısı olmayan dokularda GFP gösteren embriyoları ayırmak için floresan ışık kaynağına sahip bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Bu embriyolar enjekte edilen yapıyı içermelidir. Daha önce açıklandığı gibi transpozon aktivitesini kontrol etmek için bir Tol2 tüketim testi yapın.

Eksize edilen plazma tespit edilebilirse, enjekte edilen balık embriyolarını saklayın ve büyütün. Aksi takdirde, Tol2 tüketim testinden olumlu sonuçlar elde edene kadar Tol2 mRNA sentezini ve mikro enjeksiyon işlemini tekrarlayın. Zebra balığı embriyolarını görüntülemek için, çoklu F2 nesli kurucu balıkları tek tek çiftler halinde vahşi tip balıklarla çaprazlayın.

Zebra balığı evreleme kılavuzuna göre istenen farklı gelişim aşamalarında balık embriyolarını toplayın. Balık sistemi suyundaki erken evre balık embriyoları için, bir diseksiyon kapsamı altında, koryonları dikkatlice soymak ve çıkarmak için bir çift forseps kullanın. Birkaç embriyoyu %3 metilselüloz içeren içbükey bir cam slayta aktarmak için bir atık transfer pipeti kullanın.

Daha sonra bir diseksiyon kapsamının altında bir iğne kullanarak, hücresel GFP aktivitesini görüntülemek için embriyoları istenen pozisyonlara ayarlayın. 12 somitten daha az aşamadaki embriyolar için, görüntüleme için uyumlu bir kamera ve yazılıma sahip bir epifloresan bileşik mikroskobu kullanın. 12 somit aşamasını geçen embriyolar için bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanın.

Tümör hücresi voltajını görüntülemek için önce Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörleri veya MPNST ile balıkları tanımlayın. Balıkları 10 santimetre çapında bir Petri kabına yerleştirin ve tüm montaj görüntülemesini yapın. Son olarak, görüntülemeyi takiben, tümör hücresi elektriksel aktivitesini görüntülemeden önce tümörü inceleyin.

Başarılı bir enjeksiyonda, enjekte edilen embriyoların% 50'sinden fazlası somatik hücrelerde bir dereceye kadar GFP gösterecek ve bunların çoğu Tol2 transpozon tüketim testinden pozitif bir sonuç gösterecektir. Burada, zebra balığının erken embriyonik gelişimi sırasında hücre döngüsü boyunca zar potansiyel değişiklikleri incelendi. Bu timelapse videoda görüldüğü gibi, hücreler bölünme karığı oluşmadan önce hiperpolarize oldu.

Ayrıca, bir ila üç günlük balık embriyolarında farklı dokular çeşitli zar potansiyelleri göstermiştir. Örneğin, somit ve notocord, bitişik doku ve organlara kıyasla genellikle hiperpolarize olmuştur. Bu iki günlük balık embriyosunda, elektrik sinyal iletimine karşılık gelen renk yoğunluğu değişiklikleri ile hareket sırasında nöromüsküler elektriksel aktiviteler gösterilir.

Kanser hücrelerinin biyoelektriksel özellikleri, spontan MPNST'ye eğilimli bir RPL35 mutantı ile ASAP1 muhabir balıklarının çaprazlamalarından elde edilen embriyolarda incelendi. Çevredeki dokularla karşılaştırıldığında, tümör hücreleri daha polarizeydi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu mikro enjeksiyon tekniği uygun şekilde yapılırsa yaklaşık üç saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, ideal sonuçlar için zebra balığı embriyolarının tek hücre aşamasında olması gerektiğini unutmamak önemlidir. Geliştirilmesiyle birlikte bu teknik, gelişim biyolojisi ve hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların zebra balığı ve diğer model organizmalardaki in vivo elektriksel sinyalizasyon değişikliklerini keşfetmelerinin önünü açıyor. Bu videoyu izledikten sonra, mikro enjeksiyonla transgenik bir zebra balığı hattının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.