Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

Bu titratör ELISA'nın genel amacı, yeni bir algoritma kullanarak iki bağlanma ortağının afinite sabitini tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde belirlemektir. Bu yöntem, sadece protein ligand etkileşimi ve reseptör araştırmaları alanında değil, aynı zamanda farmasötik araştırmalar ve farmakolojide uygulanan yaşam bilimlerinde de önemli sorulara cevap verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir reseptör ligand etkileşiminin afinite sabitini, bir ELISA plakasında bir ligand ile reseptörü titra ederek ve yeni bir değerlendirme algoritması kullanarak kolayca belirleyebilmektir.

Bu prosedürü, Integrin Alfa 2 A Alanının stok çözeltisini TBS magnezyum klorür tamponunda beş mikrogram / mililitre son konsantrasyonuna seyreltmekle başlayın. Bu gösterimde hem bir yabani tip hem de bir mutant Integrin Alfa 2 A Alanı kullanılacak. Yarım alanlı bir mikrotitre plakasının her kuyucuğunu Integrin Alfa 2 A Alanı kaplama çözeltisinin 50 mikrolitresi ile doldurun.

Her titratör satırını en az iki kopya olarak gerçekleştirin. Bu örnekte, her titratör satırı dört kopya olarak gerçekleştirilir. Plakayı folyo ile kapatın ve plakayı gece boyunca dört derece Celsius'ta bırakın.

Ertesi gün, kaplama çözeltisini çıkarın ve her kuyucuğu TBS magnezyum klorür tamponunun 15 mikrolitresi ile doldurun. Yıkama çözeltisini çıkarın ve kuyuları yeni yıkama çözeltisi ile doldurun. Yıkamalar, plastik yüzeye fiziksel absorpsiyon ile immobilize edilmemiş olan çözünür reseptör moleküllerini çıkaracaktır.

Bir sonraki adım, her kuyucuğa TBS magnezyum klorür tamponunda bir yüzde BSA çözeltisinin 50 mikrolitresini ekleyerek spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmektir. Plakayı yeniden kapatın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Mikrotitre plakanın kuyuları BSA ile bloke edilirken, ligand Rhodocetin'in seri bir seyreltmesini hazırlayın.

Bu durumda 243 minesi yıpranmış Rhodocetin'den başlayan bir konsantrasyon ve 2,3'lük bir seyreltme faktörü kullanılır. Bu deneydeki sekiz titrasyon eğrisi için, bir yüzde TBS magnezyum klorür içinde Rhodocetin çözeltisinin en yüksek konsantrasyonunu test tüpü numara bir üzerinde 920 mikrolitre hazırlayın. Diğer on test tüpüne ikiden on birine kadar olan yedi test tüpüne TBS magnezyum klorür içinde bir yüzde BSA çözeltisinin 520 mikrolitresini pipetleyin.

Rhodocetin çözeltisinin 400 mikrolitresini test tüpünden test tüpü iki'ye aktarın. Her iki çözeltiyi çat-ter-a-syon ile karıştırın ve ardından bu karışımdan 400 mikrolitreyi test tüpü üç'e aktarın. Test tüpü on bir'e kadar bu seri seyreltmeyi sürdürün.

Bu prosedürün başarısı için, kuyuların kurumaması için her kuyucuğu hızlı bir şekilde çözelti ile doldurmanız önemlidir. Bir saatlik inkübasyonun tamamlanmasından sonra, blokaj çözeltisini mikrotitre plakanın kuyularından çıkarın. Hemen test tüpü bir'den 50 mikrolitre Rhodocetin çözeltisi kolonu bir kuyularına, test tüpü iki'den çözeltiyi kolonu iki kuyularına ekleyin ve on bir kolonu boyunca devam edin.

Kolon on iki kuyularına, bir ligand içermeyen kontrol olarak, bir yüzde BSA ve TBS magnezyum klorür ekleyin. Plakayı yeniden kapatın ve oda sıcaklığında bir buçuk saat boyunca inkübe edin. Bağlanmamış ligand moleküllerini çıkarmak için bağlanma çözeltisini çıkarın ve her kuyucuğu HBS magnezyum klorür tamponunun 50 mikrolitresi ile doldurun.

Ardından HBS tamponunu çıkarın ve yeni HBS tamponu ekleyin. Reseptörü ve bağlı ligandı kimyasal olarak sabitlemek için, mikrotitre plakanın her kuyucuğunu HBS magnezyum klorür tamponunda iki buçuk yüzde glutaraldehit çözeltisinin 50 mikrolitresi ile doldurun. Mikrotitre plakayı oda sıcaklığında on dakika inkübe edin.

Fiksasyon çözeltisini çıkarın ve fazla glutaraldehiti inaktive edin ve her kuyucuğu TBS magnezyum klorür tamponunun 50 mikrolitresi ile doldurun. Yıkama tamponunu çıkarın ve her kuyucuğa yeni yıkama tamponu ekleyin. Bu tahlili başlatmak için, yıkama tamponunu mikrotitre plakanın tüm kuyularından çıkarın ve her kuyucuğa bir yüzde BSA TBS magnezyum klorür içinde bir ila iki bin ile seyreltilmiş birincil antikor çözeltisinin 50 mikrolitresini ekleyin.

Plakayı yeniden kapatın ve oda sıcaklığında inkübe edin. Birincil antikor çözeltisini tüm kuyularından çıkarın ve her kuyucuğa TBS magnezyum klorür tamponunun 50 mikrolitresini ekleyin. TBS magnezyum klorür tamponu ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, TBS magnezyum klorür içinde bir yüzde BSA ile bir ila iki bin ile seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisinin 50 mikrolitresini her kuyucuğa ekleyin. Plakayı yeniden kapatın ve oda sıcaklığında bırakın. İkincil antikor çözeltisini kuyularından çıkarın ve her kuyucuğa TBS magnezyum klorür tamponunun 50 mikrolitresini ekleyin.

Üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, tüm sıvı izlerini çıkarmak için mikrotitre plakayı bir doku bezine hafifçe vurun. Mikrotitre plakanın her kuyucuğuna