Name: Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Keşfedin, taze insan beyin dokusundan kan-beyin bariyeri fonksiyonunu incelemek için beyin kapilleri izolasyon protokolü. Bu yöntem, sağlık ve hastalık durumlarında bariyer mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz teşekkür ederiz ve Dr Peter Nelson ve Sonya Anderson tüm insan beyin doku örnekleri sağlamak için UK-ADC beyin doku Bankası kabul (NIH izni numarası: P30 AG028383 yaşlanma Ulusal Enstitüsü). Matt Hazzard ve Tom Dolan, bilgi teknoloji hizmetleri, akademik teknoloji ve fakülte nişan, Kentucky Üniversitesi grafik yardım için teşekkür ederiz. Bu proje (BB için) hibe numara 1R01NS079507 sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur ve grant numara 1R01AG039621 yaşlanma Ulusal Enstitüsünden (için A.M.S.H.) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur veya Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini yaşlanma temsil etmiyor. Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Aşağıdaki bilgileri geçerli güvenlik ve Kentucky Üniversitesi, Lexington, KY, ABD düzenleyici standartlara dayanmaktadır. Bir güvenlik önlemi olarak, kurumun biyolojik güvenliği programı ve en güncel yönetmelik ve öneriler için insan dokusu ile çalışmaya başlamadan önce bakın.
Dikkat: İnsan dokusu insan immün yetmezlik virüsü (HIV), Hepatit B virüsü (HBV), Hepatit C virüsü (HCV) ve diğerleri de dahil olmak üzere, kan yoluyla bulaşan patojenler bir kaynağı olabilir. İnsan dokusu ile çalışma patojenler kan yoluyla enfeksiyon riski. Bu nedenle, belirli bir düzenleyici ve güvenlik uygulaması insan dokusu ile laboratuar personeli korumaya çalışırken zorunludur. ABD insan dokusu ile çalışma bir Biyogüvenlik seviye 2 Laboratuvar yanı sıra güvenlik önlemleri ve NIH Bölüm IV-B-7, OSHA 1970 yan tümce 5(a)(1) ve kullanıcının kurumsal biyolojik güvenliği programı yasası uyarınca eğitim gerektirir. Genel olarak, kurumsal Biyogüvenlik kurulu ve/veya kurumsal İnceleme Kurulu onayı insan malzemeleri (doku, vücut sıvıları) içeren herhangi bir araştırma önce alınmalıdır. Eğitim insan malzeme ile çalışan tüm personel için gereklidir ve temel laboratuvar güvenlik eğitimi, Örneğin, kimyasal hijyen ve laboratuvar güvenliği, hem de biyolojik güvenlik, tehlikeli atık ve insan üzerinde özel eğitim içerir kan kaynaklı patojenler. İnsan malzeme ile çalışan tüm personelin hepatit B aşıları, önce insan malzeme ile çalışan almak için kesinlikle önerilir. Personel insan malzemelerle, e.gçalışırken belirli kişisel koruyucu donanımları gereklidir., kelepçeli bir önlük ve kalkan ve her zaman eldiven giymek bir yüz. İçinde bir Biyogüvenlik kabini (sınıf 2) gerçekleştirilmiş tüm işleri. İnsan malzemeler ile temas ve herhangi bir atık insan malzemelerden gelir tüm ekipman kirlenme ve/veya personel enfeksiyonu önlemek için uygun şekilde ele alınır. Tüm ekipman ve yüzeyler ile % 10 çamaşır suyu ve % 75 etanol insan malzemeler içeren her yordam aşağıdaki temizlenir. Bir sızıntı insan malzeme ile hemen temizlenmesi gerekir. Züccaciye Mağazaları her kullanımdan sonra autoclaved. Sabitlenmemiş insan dokusu, dahil olmak üzere atık, etiketli biohazard atık çantaya toplanan ve autoclaved. "Sharps" olarak biyolojik etiketli bir delik ve sızıntı geçirmez kap içinde toplanır. İnsan malzemelerden tüm atık kurumun biyolojik güvenlik yönetmeliklerine göre atıldı.
Not: Bizim laboratuvar taze frontal korteks örnekleri yaşlanma Sanders-kahverengi Merkezi aracılığıyla vefat eden bireyler elde eder (IRB #B15-2602-M). Dahil ölçütlerdir: kayıt UK-ADC boyuna otopsi kohort çalışma ve bir Post-Mortem aralığı (PMI) ≤4 s64. Otopsi standart bir protokol izleyin ve tüm yordamları NIH Biospecimen en iyi pratik kurallar65için uygun. Az 4 h kısa bir PMI yalıtım sonra kapiller canlılığı sağlamak için yüksek önem taşımaktadır. Dondurulmuş ve taze doku kullanılabilir. Donma gerekli ise, taze elde edilen insan beyin dokusu şok sıvı azot içinde donmuş olmalı ve-80 ° C'de depolanan Taze veya çözdürülen doku içinde yalıtım tampon (aşağıya bakınız) depolanabilir ve hızlı bir şekilde işlenebilir. Biz o 10 g taze insan dokusu verimleri yaklaşık 100 mg beyin kapiller (ıslak ağırlık) bulabilirsiniz.
1. Kurulum
<ol><li>
Arabellek hazırlık Not: Gerekli arabellek hacmi doku miktarına bağlıdır. Tüm arabellek güç aşağıdaki protokol içinde insan beyin korteksi doku 10 g üzerinde temel alır.<ol>
<li>L izolasyon arabellek: 1, 5 L Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS; 2.7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 0.9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) kullanın ve ek 5 mM D-glikoz (1.35 g ) ve 1 mM sodyum pyruvate (0,165 g). Glikoz ve pyruvate ekledikten sonra sodyum hidroksit ile pH 7.4 için ayarlayın. Serin ve 4 ° C kullanmadan önce arabelleğe saklayın.</li>
		<li>Sığır Serum Albumin (BSA): yalıtım arabelleği bir son BSA konsantrasyonu % 1 1 L 10 g BSA tozu ekleyin. Bubbles kaçınmak, pH 7.4 ayarlamak ve gecede 4 ° C'de depolamak için yavaş yavaş ilave edin. Hemen kullanmadan önce hafifçe karıştırın; albümin denatürasyon önlemek için kabarcıklar oluşturan kaçının.</li>
		<li>Yoğunluk gradient Orta: bir cam şişe içine yoğunluk gradient orta 18 g tartmak ve manyetik heyecan çubuğu ekleme. Yalıtım arabellek 60 mL ekleyin ve tüm toz askıya kadar 5 dk şiddetle çalkalanır. Mağaza gecede 4 ° C'de geçiyoruz yoğunluk degrade orta izin vermek için. Kullanmadan önce 10 dakika karıştırın.</li>
		<li>4 ° C'de tüm arabellekleri depolar; Tüm araçlar ve buz arabellekleri tüm yalıtım işlem sırasında tutmak. Kullanmadan önce tüm arabellekleri karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deneysel Kur
	<ol>
<li>Potter-Elvehjem doku değirmeni elektronik havai karıştırıcı üzerine havaneli bağlayın. Potter-Elvehjem doku değirmeni ve Dounce homogenizer başlık altında buzda havaneli ile yerleştirin. 300 µm filtre mesh (5 x 5 cm2) hazırlamak, bir koni katlayın ve eklemek ve 50 mL Falcon tüp bandı (Şekil 1A) ile ekleyin.</li>
		<li>Bağlantı halkaları yerleştirin ve zorlanma filtreleri hücre (gözenek boyutu: 30 µm) 50 mL Falcon tüpler üzerinde. Biyolojik atık torbaları hazırlayın. Gerekli tüm ekipman Biyogüvenlik kabini yerleştirin (bkz. Tablo malzeme).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. beyin numune hazırlama
Not: Şekil 1A aşağıda açıklanan tüm yalıtım yordamı iş akışı grafiğini gösterir. İnsan beyin dokusu korteks herhangi bir yerinden kök olabilir ve taze veya dondurulmuş kullanılabilir. Donmuş beyin dokusu oda sıcaklığında (arabellek yok; ~ 30 dk 10 g için) çözülmüş. Benzer sonuçlar elde etmek için beyin dokusu her deneme için aynı beyin bölgesinden alınmalıdır. Bu iletişim kuralı için taze optimize edilmiştir (PMI < 4 h) değil donmuş halde insan beyin korteksi.
<ol><li>İnsan beyin dokusunun hazırlanması: beyin dokusunun ağırlık belge. Aşağıdaki iletişim kuralı tüm numaraları 10 g taze insan beyin doku için uygundur. Beyin dokusu bir 100 mm Petri kabına yerleştirin. Dikkatli bir şekilde tüm meninkslerde forseps ile çıkarın. Bir neşter beyaz madde kesmek için kullanın.</li>
	<li>İnsan beyin dokusunun kıyma: dikkatle beyin dokusu kadar kesin ve neşterle kıyma. Yaklaşık 5 dk (2-3 mm adet) kıyma. Beyin dokusu Potter-Elvehjem doku değirmeni aktarın. Yalıtım arabellek 30 mL ekleyin. Not: Kıyılmış doku parçaları lapa kıyma sürecinde beyin dokusu dönüşüyor beri görmek zordur.</li>
</ol>3. homojenizasyon
<ol><li>Potter-Elvehjem doku değirmeni (izni: 150-230 µm): her örnek, 50 rpm homogenizer hızında 100 darbeleri ile homojenize. Zaman her 25 konturlar ve 100 vuruş için gereken toplam süreyi belge. Tablo 1 için önerilen homojenizasyon Protokolü Bkz:; insan frontal korteks 10 g homojenizasyon için toplam 22 dk zamanı. Hava kabarcıkları önlemek için heyecan değil.</li>
	<li>Dounce homogenizer (izni: 80-130 µm): homogenate Dounce homogenizer buzda Transfer. 20 vuruş (~ 6 s/kontur, ~ 2 dk toplam) ile süspansiyon lunaparkçı. Bubbles kaçınmak.</li>
</ol>4. Santrifüjü
<ol><li>Beyin homogenate dört 50 mL aralıklarla tüpler ve belge homogenate hacmi eşit olarak dağıtın. Yoğunluk gradient arabelleği 50 mL aralıklarla tüpler (12,5 mL tüp başına) içine dağıtmak. Yalıtım arabellek 10 mL Havan tokmağı ve homogenizer durulama ve dört Santrifüjü tüpler (~2.5 mL tüp başına) içine dağıtmak için kullanın.</li>
	<li>Santrifüj tüpleri kapakları sıkıca kapatın. Homogenate, yoğunluk gradient orta ve arabellek şiddetle tüpler sallayarak karıştırın. Vasıl 5,800 x g 4 ° c (sabit açılı rotor); 15 dakika santrifüj kapasitesi Tüp bağlı Pelet tutmak için bir orta yavaşlama hızı seçin. Süpernatant atın ve her Pelet 2 mL % 1 BSA resuspend.</li>
</ol>5. filtrasyon
Not: kırmızı kan hücreleri ve diğer hücre artıkları kılcal ayırt etmek birkaç filtrasyon adımlar gereklidir.
<ol><li>300 µm kafes: Pelet yeniden askıya sonra süspansiyon 300 µm kafes aracılığıyla filtre. Daha büyük gemiler ve daha büyük beyin enkaz mesh kalır, ancak kılcal ağ, filtre uygulanır. Dikkatle mesh ilâ 50 mL % 1 BSA ile yıkayın. Mesh atmak. Not: Bu filtrasyon adım kapiller süspansiyon herhangi bir büyük damarları ya da beyin enkaz parçalarını temizler.</li>
	<li>
30 µM hücre zorlanma filtre Not: Bu filtrasyon adım kılcal kırmızı kan hücreleri ve diğer beyin enkaz ayırır.<ol>
<li>Adım 6.1 beş 30 µm hücre zorlanma süzgeçleri (kapiller filtrate hücre zorlanma filtre başına yaklaşık 10 mL) üzerindeki kapiller filtrate dağıtın. Oysa kırmızı kan hücreleri, diğer tek hücreleri ve küçük beyin enkaz filtreden geçmek ve filtrate içinde toplanan kılcal geri Bu filtre tarafından tutulur.</li>
		<li>Her filtre 25 mL % 1 BSA ile yıkayın. Daha sonra tüm filtrates verimi artırmak için altıncı filtre dökün. Her filtre 50 mL % 1 BSA ile yıkayın; zorlanma filtreleri ile kılcal içeren hücreyi tutmak ve filtrate atın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. kılcal koleksiyonu
<ol><li>Filtreler ters çevirin ve 50 mL tüpler içine kılcal 50 mL her filtre için % 1 BSA ile yıkayın. Yavaşça pipettor 5 mL damlalıklı ucu ile basınç uygulayın ve beyin kılcal yıkamak için filtre arasında taşıyın.</li>
	<li>Özellikle filtre RIM tüm beyin kılcal kapalı yıkayın emin olun. Kabarcıklar kaçının beri bu filtrasyon işlemi daha zor hale getirir ve kapiller kaybı olasılığı artar.</li>
</ol>7. çamaşır
<ol><li>Kılcal topladıktan sonra 1.500 x g (kova rotor sallanan) 4 ° C'de 3 min için tüm örnekler santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak ve Pelet yalıtım arabellek yaklaşık 3 mL yeniden askıya alma. 15 mL konik tüp içinde bir örnek tüm resuspended çökeltilerini birleştirmek ve yalıtım arabellek ile doldurun. Yine 1500 x g 4 ° C'de 3 dk de santrifüj kapasitesi ve iki kez daha yıkayın.</li>
	<li>Kapiller saflık ile mikroskop (100 X büyütme) ve fotoğraf makinesi (Şekil 1B) belge. Not: Beyin kapiller insan beyin dokusunun 10 g den genellikle yaklaşık 100 mg verimidir. İzole beyin kılcal şimdi işlenen deneyler için kullanılabilir (Örn., lysate, membran izolasyon), veya flash donmuş ve-80 ° c en az 6-12 ay (birden çok donma-çözülme döngüsü önlemek) için cryotubes içinde saklı.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mevcut protokolünü sağlam ve kalıcı insan beyin kapiller taze dokusundan yalıtım açıklar. Bu bölümde, biz aşağıda ayrıntılı olarak ele: 1) değişiklikleri protokolü, 2) yaygın hataları giderme, 3) Teknik sınırlamaları, 4) modeli ile ilgili mevcut ve alternatif kan - beyin bariyerini modelleri, önemi ve 5). izole insan beyin kılcal damarlar için potansiyel uygulamalar.
Burada açıklanan protokol 10 g taze insan frontal korteks doku için optimize edilmiştir. Ancak, bu yordam için değiştirmek olduk...

Kan - beyin bariyerini kan ve ne gider ve beyin dışarı geliyor belirler beyin arasındaki sıkı şekilde denetlenen bir arabirimdir. Anatomik olarak, endotel hücreleri kan - beyin bariyerini oluşturmak ve karmaşık, sürekli kılcal ağ oluşturur. Fizyolojik açıdan, bu kılcal ağ aynı anda karbon dioksit ve metabolik atık ürünlerin atılması sırasında beyin oksijen ve besin sağlar. Önemlisi, kanıt bariyer değişikliklere Alzheimer hastalığı, epilepsi ve kontur1,2,3,4,5 de dahil olmak üzere çok sayıda patolojiler için katkıda destekler , 6 , 7. endotel hücreleri de hizmet tedavi için bir engel olarak beyne, Örneğinilaç alımı bloke ederek beyin., kemoterapi glioblastoma multiforme Tümör rezeksiyonu8,9, takip 10. Bu bağlamda, izole insan beyin kılcal damarlar çok bariyer fonksiyonu ve sağlıkta disfonksiyon eğitim veren bariyer özellikleri içinde vivo benzeyen bir benzersiz ex vivo kan - beyin bariyerini modeli temsil ve hastalık. Bu makalede, biz--dan sürekli yüksek kapiller kalitede insan beyin beyin kılcal yalıtmak ve kan - beyin bariyerini çalışmaya verim için bir protokol sağlar.
1969 yılında, Siakotos ve ark. 11 ilk beyin kapiller yoğunluk gradient Santrifüjü ve cam boncuk sütun ayrımı yöntemi kullanılarak sığır ve insan beyin dokusundan yalıtım rapor edildi. Daha sonra Goldstein vd. 12 bu yöntem doku sıçanlarından emir, glikoz taşıma metabolik aktivite koruyarak izole beyin kılcal çalışma için gerekli azaltmak için birden fazla filtrasyon adımları ekleyerek geliştirilmiş. O zamandan beri araştırmacılar çok kez, yöntemi ve beyin kapiller modeli her yineleme13,14,15ile iyileştirilmesi kapiller yalıtım yordamı optimize edilmiştir. Örneğin, Pardridge ve ark. 16 sığır kılcal mekanik homojenizasyon yerine enzimatik sindirim kullanarak izole ve sonra daha sonra 210 µm gözenekli filtre ve cam boncuk sütun kılcal bir süspansiyon geçti. Bu değişiklikler trypan mavi dışlama leke izole beyin kapiller geliştirilmiş ve böylece, endotel hücre canlılığı arttı. 1990'ların başında Dallaire ve ark. 17 nöronal kirlenme açıktı ve γ-glutamil transpeptidase (γ-GTase) ve alkalen fosfataz metabolik aktivite yapılmaktadır sığır ve sıçan kılcal izole. 2000'de, Miller ve ark. 18, izole sıçan ve domuz beyin kılcal confocal mikroskobu ile birlikte taşıma yüzeylerde birikimi kılcal lümen içine göstermek için kullanılır. Daha sonra bizim laboratuvar beyin kapiller yalıtım yordamı optimize etmek devam etmiştir ve P-glikoprotein (P-gp)19,20,21, meme kanseri belirlemek için taşıma deneyleri kurduk direnç protein (BCRP)22,23ve çoklu ilaç direnci protein 2 (Mrp2)24 taşıma etkinlik. 2004 yılında, biz nereye biz izole sıçan beyin kılcal çeşitli sinyal yolları araştırmak için kullanılan iki raporlar yayınlandı. Hartz ve ark. 21, peptid endotelin-1 P-gp taşıma işlevinde beyin kılcal (PKC) endotelin reseptör B (ETB) reseptör, nitrik oksit sentaz (NOS) ve protein kinaz C üzerinden hareket ederek hızla ve geri dönülebilir olarak azaltılmış bulduk. Bauer vd. 19, nükleer reseptör pregnane X reseptör (PXR) ifade ve P-gp ifade ve taşıma fonksiyonunu kullanabilirsiniz beyin kılcal gösterdi PXR modülasyon gösterdi. Deneylerde transgenik insanlaşmış PXR fareler ile bu satırı araştırma, genişletilmiş ve in vivo etkinleşmiş P-gp ile hPXR harekete geçirmek25tarafından bariyer sıkma gösterdi. 2010 yılında, Hartz ve ark. P-gp protein ifade geri yüklemek ve etkinlik mutlu overexpress transgenik insan amiloid precursor protein (mutlu) farelerde taşımak için bu yaklaşım 26 ' yı kullandık. Ayrıca, P-gp mutlu içinde geri fareler amiloid beta (Aβ)40ve Aβ42beyin düzeyleri azaltılacağını.
Sinyal yolları eğitim ek olarak, izole beyin kılcal biz kapiler kaçak başvuran kapiller permeabilite değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir. Özellikle, Texas kırmızı sızıntı tahlil zaman ve bu veriler üzerinde kılcal lümen Texas kırmızıdan sonra kaçak oranları analiz etmek için kullanılan floresan boya kaçağı değerlendirmek için kullanılır. Bu denetim kılcal kıyasla artmış kapiller sızıntı kan - beyin bariyerini2fiziksel bütünlüğünü değişimler gösterir. Çok sayıda hastalık durumlarında bariyer bozulma, e.gile ilişkili olduğundan bu değerlidir., epilepsi, multipl skleroz, Alzheimer hastalığı ve travmatik beyin hasarı27,28,29, 30. Diğer grupları da protein ifade ve proteinler31,32,33,34taşıma faaliyetleri düzenleyen sinyal yolları ayırt etmek izole kılcal kullanılmıştır, 35,36,37. Son olarak, bu yöntem insan beyin kapiller yalıtım için optimize etmek devam etmiştir ve son zamanlarda, biz artan P-gp ifade insan kan - beyin bariyerini hastalarda, epilepsi nöbet ücretsiz kontrol bireylere38 karşılaştırıldığında ile gösterdi . Birlikte ele alındığında, bu gelişmeler izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu eğitim için çok yönlü bir model olarak hizmet verebilir göstermektedir.
Çeşitli içinde vivo, ex vivove in vitro kan - beyin bariyerini modelleri temel araştırma ve endüstriyel uyuşturucu tarama, esas olarak ilaç dağıtım beyin39,40,41 test amacı ile kullanılmıştır ,42,43,44. İzole ex vivo beyin kılcal yanı sıra, geçerli kan - beyin bariyerini modelleri dahil silico modelleri, vitro hücre kültürü izole beyin kapiller endotel hücreleri veya çeşitli ölümsüzleştirdi hücre satırlarından türler, vitro kültür insan pluripotent kök beyin kapiller endotel hücreleri ve mikrosıvısal modelleri bir yonga üzerinde içine hücre (hPSC).
Silico modelleri tahmin edilen emme, dağıtım, metabolizması ve atılımı (ADME) özellikleri dayalı ilaç adaylarının seçmek için ilaç geliştirme içinde en yaygın olarak kullanılır. Niceliksel yapısı-özelliği ilişki (QSPR) modelleri ve niceliksel yapısı-etkinlik ilişkisi (QSAR) modelleri gibi yöntemleri kütüphanelerin yüksek üretilen iş tarama beyin penetrasyon ilaç adaylarının tahmin etmek için kullanılan popüler yöntem vardır 45 , 46. bu modeller ekran moleküllere bariyer penetrasyonu özellikleri için yararlıdır.
Betz vd. 47 monolayers kültürlü beyin kapiller endotel hücrelerinin bir vitro kan - beyin bariyerini modeli kurulmuş. Vitro hücre kültür modelleri taze doku veya ölümsüzleştirdi endotel hücre hatları gibi insan beyin microvessel endotel hücreleri (hCMECs) kullanarak beyin penetrasyon veya mekanik çalışmaları için başka bir yüksek üretilen iş tarama aracı olabilir. Ancak, beyin kapiller endotel hücre kültür modelleri fizyolojik kesme stres kan akımı kapiller lümen içinde eksikliği, genel olarak biyolojik karmaşıklığı sınırlıdır ve değişiklikleri ifade ve yerelleştirme önemli bariyer bileşenlerinin meydana sıkı kavşak proteinler gibi yüzey reseptörlerinin, ışınlayıcılar, enzimler ve iyon kanalları48,49,50. Diğer taraftan, endotel monolayers hPSCs türetilmiş, hCMEC/D3 kültürlere göre düşük sükroz geçirgenliği var ve bazı kan - beyin bariyerini taşıyıcılar, adezyon molekülleri ve sıkı kavşak51, polarize ifade içeren 52. ancak, bu hücreler aynı zamanda kültür özellikleri değiştirme tabi, ve sistem içinde vivo bariyer özellikleri52onun tekrarlama için doğrulanması gerekir.
Kan - beyin bariyerini araştırma daha yeni eğilimler mikrosıvısal cihazlar üretmek için organ-on-chip teknolojisini kullanarak veya içi boş fiber teknolojisi53, kullanan yapay kılcal damarlar, oluşturmak için 3D doku kültürü sistemleri kullanan dahil 54 , 55. yapay kılcal damarlar, ancak, önemli ölçüde daha büyük çaplarda (100 – 200 µm) beyin kılcal damarlar (3-7 µm) daha vardır. Bu nedenle, kesme kuvvetleri vitro değil tamamen benzer vivo içinde durum. Bu "blood-brain-barrier-on-a-chip" mikrosıvısal cihazlar, Yapay membran formu "kan" ve "beyin" bölmeleri ve sıvıları mikrosıvısal kesme kuvvetleri bu cihazlar aracılığıyla nerede pompalanır ele olduğunu. Benzer şekilde, astrocytes ile çeşitli kombinasyonlarda endotel hücreleri ve vasküler düz kas hücreleri ortak kültürleri de hollow fiber teknolojisi ile rheological parametreleri vivo içinde koşullar56 altında mevcut yeniden oluşturmak için kullanılmıştır , 57 , 58. ancak, ne kadar iyi bu modeli kan - beyin bariyerini taşıma, metabolizma, sinyal ve diğerleri gibi diğer özelliklerini yansıtır belli değildir. Bu yapay kılcal ve chip modelleri ilaçların yüksek üretilen iş tarama için uygundur, ancak bu modeller oluşturmak için kullanılan hücrelere de kültür sırasında değiştirilebilir.
Dondurulmuş ve sabit beyin dilimler veya birincil beyin kapiller endotel hücre kültürlerindeinsan microvasculature çalışma5,59,60,61için kullanılabilecek ek modellerdir. Örneğin, immünhistokimya sabit beyin dokusunun protein yerelleştirme belirlemek için kullanılır ve sağlıklı ifadede hastalıklı dokusu ile karşılaştırıldığında.
Dokusu dilimlerin ve vitro modelleri yanı sıra yukarıda açıklanan, taze izole beyin kılcal kan - beyin bariyerini işlev eğitim için yararlı olabilir. Bu izole kapiller modelin sınırlamaları içerir taze insan beyin dokusu, elde etmek için zorluk olmaması astrocytes ve nöronlar ve nispeten zaman alan ayırma işlemi. Bir avantajdır izole beyin kapiller modeli bu modeli çok benzeyen vivo içinde durum ve bu nedenle, bariyer fonksiyonu ve fonksiyon bozukluğu karakterize etmek için kullanılabilir. Önemlisi, bu da sinyal mekanizmalarını deneyleri ve moleküler teknikleri3,19,62,63çok sayıda kullanma ayırt için kullanılabilir.
Bizim Laboratuvar her iki taze ve donmuş insan beyin dokusu yaşlanma Sanders-kahverengi Merkezi aracılığıyla erişebilir (IRB #B15-2602-M)64. Bu bağlamda, standart bir protokol otopsi izle, beyin içinde elde edilen < 4 h ve tüm yordamları uygun NIH Biospecimen en iyi pratik kurallar65için. Bu benzersiz erişim insan beyin dokusu ile göz önüne alındığında, biz kurulan ve beyin kılcal sağlam, uygun insan beyin kılcal yüksek bir verim içinde sonuçları insan beyin dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş. Protein ifade ve etkinliğini belirlemek için iki ortak bitiş noktası ilgi vardır. Bu bağlamda, biz ve diğerleri ile izole beyin kapiller protein ifade ve aktivite düzeyleri kullanılabilir çeşitli deneyleri kurduk. Bu deneyleri Western blot, basit Western tahlil, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA), Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), zymography, taşıma faaliyet deneyleri, içerir ve Kapiler kaçak deneyleri. Bu deneyleri araştırmacılar bariyer fonksiyonu insan patolojik koşullarında değişimler çalışma, protein ifade ve etkinlik düzenleyen yolları belirlemek ve kan - beyin bariyerini ilişkili tedavisi için farmakolojik hedefleri belirlemek izin hastalıklar.
Alınan birlikte, taze izole beyin kılcal kan - beyin bariyerini sağlam ve tekrarlanabilir model olarak hizmet verebilir. Özellikle, bu model bir yelpazeye bariyer fonksiyonu çalışma için bitiş noktaları belirlemek için birçok farklı deneyleri ile kombine edilebilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD)</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Grip Plus Lateks Eldivenler, Microflex Medium</td><td>VWR, Radnor, PA, ABD</td><td>32916-636</td><td>KKD</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Koruyucu Laboratuvar Önlükleri</td><td>VWR, Radnor, PA, ABD</td><td>470146-214</td><td>KKD; İnsan kaynaklı malzemenin doğası gereği, tek kullanımlık laboratuvar önlüğü kullanılması önerilir</td></tr><tr><td>Yüz Kalkanı, tek kullanımlık</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>19460102</td><td>KKD; İnsan kaynaklı materyalin doğası gereği, tek kullanımlık bir yüz siperi kullanılması önerilir</td></tr><tr><td>Güvenlik Malzemeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clavies Yüksek Sıcaklık Otoklav Torbaları 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>Versi Kuru Tezgah Kağıdı 18" x 20"</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>14-206-32</td><td>çalışma alanlarını kapsayacak şekilde</td></tr><tr><td>VWR Sharps Konteyner Sistemleri</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>75800-272</td><td>kullanılmış neşterler için</td></tr><tr><td>Çamaşır suyu %8.2 Clorox Antiseptif 64 oz.</td><td>Birleşik Krallık Tedarik Merkezi, Lexington, KY, ABD</td><td>323775</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Buzdolabı</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Accume BASIC AB15 pH Metre Thermo</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Kontrol</td><td>Heidolph, Elk Grove Köyü, IL, ABD</td><td>501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall LEGEND XTR Santrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Leica L2 Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, ABD</td><td></td><td>meninksleri çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>POLYTRON PT2500 Homojenizatör</td><td>Kinematica AG, Luzern, İsviçre</td><td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>Terazisi P-403</td><td>Denver Enstrümanı, Bohemya, NY, ABD</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>Standart mini Karıştırma</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>1151050</td><td></td></tr><tr><td>Termo-Şişeler Sıvı Nitrojen Dewar</td><td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, ABD</td><td>11-670-4C</td><td>dokuyu dondurmak için kullanılır mı?</td></tr><tr><td>Voyager Pro Analitik Terazi</td><td>OHAUS, Parsippany, NJ, ABD</td><td>VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axiovert Microcope</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, ABD</td><td></td><td>izole edilmiş kılcal damarları kontrol etmek için kullanılır</td></tr><tr><td><güçlü>Aletler ve Cam Eşyalar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipet II Pipet 1-5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>21377823T1</td><td>kılcal damarları yıkayın filtre</td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipet 100-1.000 ve mikro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>21377821T1</td> BSA Pipet Boy Integra, Hudson, NH, <td>ABD'de pelet yeniden askıya alındı</td></tr><tr><td></td><td></td><td>739658</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tüpleri 25 / raf - 500 / cs</td><td>VWR, Radnor, PA, ABD</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>EISCO Neşter Bıçakları</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>Beyin dokusu kıyma</td><td>S95938C</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR, Radnor, PA, ABD</td><td>52858-000</td><td>beher ve hacimsel şişeyi kapsayacak şekilde</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finntip Pipet Uçları 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>21-377-304</td><td>filtredeki kılcal damarları yıkamak için</td></tr><tr>Luer-Lok <td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, ABD</td><td>ile</td><td>60 mL şırınga</td> BD309653 <td>kılcal damarları filtrelemek için konektör halkası ile kullanılır</td></tr><tr><td>Neşter Sapı #4</td><td>Güzel Bilim Aletleri, Foster City, CA, ABD</td><td>10060-13</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forseps #5</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, ABD</td><td>11251-10</td><td>meninksleri çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Doku Öğütücü</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, ABD</td><td>3431E25</td><td>50 mL hacim, boşluk: 150-230 &mu; m</td></tr><tr><td>Dounce Homojenizatör</td><td>VWR, Radnor PA USA</td><td>62400-642</td><td>15 mL hacim, boşluk: 80-130 &mu; m</td></tr><tr><td>Spectra/Mesh Dokuma Filtreler (300 & mikro; m)</td> <td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, ABD</td><td>146424</td><td>Pluri bırakılabilecek herhangi bir meninksleri çıkarmak için kılcal süspansiyonu filtrelemek için</td></tr><tr><td>kullanılırSüzgeçler (gözenek boyutu: 30 ve mikro; m)</td><td>pluriSelect Yaşam Bilimleri, Leipzig, Almanya</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>Konnektör Halkası</td><td>pluriSelect Yaşam Bilimleri, Leipzig, Almanya</td><td>41-50000-03</td><td>Birden çok kez yeniden kullanım</td></tr><tr><td>İzolasyon Tamponunun hazırlanması için</td><td>1 L Hacimsel Şişe</td><td></td><td></td></tr><tr>%<td>1 BSA</td>Karıştırma Çubuğu<td></td> hazırlamak için 1 L Beher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>% 1 BSA ve Ficoll&reg; hazırlanması için Ficoll </td></tr><tr>&reg; hazırlanması için <td>Schott Şişesi (60 mL);</td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr>Her <td>şeyi soğuk tutmak için</td> <td>Buz Kovası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beyin dokusunun kıyılması için</td><td>100 mm Petri kabı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü Hücre Sıyırıcı</td><td>VWR, Radnor, PA, ABD</td><td>89260-222</td>, <td>santrifüjlemeden sonra süpernatanı çıkarmak için</td></tr><tr><td><güçlü>Kimyasallar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Fraksiyonu V, A-9647</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD</td><td>A9647-500g</td>, <td>DPBS'de Ca 2 + & Mg2+ önceki gün. Hazırlık sırasında kabarcıklardan kaçının. Buzdolabında saklayın. Kullanmadan önce 10 dakika yavaşça karıştırın.</td></tr><tr><td>Ca2+ & ile DPBS Mg2+</td><td>Hyclone</td><td>SH30264.FS</td><td>DPBS - İzolasyon Tamponunun bir parçası</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD</td><td>F4375</td><td>Burada kesin ölçüm önemlidir. Karıştırma çubuğu ile şişede tartın. DPBS'yi ekledikten sonra kuvvetlice çalkalayın. Buzdolabında O / N olarak saklayın. Sabah hava açık olacak. Kullanmadan önce 10-15 dakika hafifçe karıştırın. Kullanana kadar buz üzerinde tutun.</td></tr><tr><td>Glikoz (D-(+) Dekstroz)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD</td><td>G7528</td><td>Glikoz (D-(+) Dekstroz) Konsantrasyon: 5 mM</td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit Standart Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD</td><td>DPBS Sodyum Pirüvatın pH'ını ayarlamak için</td><td>71474</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD</td><td>P2256</td><td>Konsantrasyon: 1 mM</td></tr></tbody></table>

yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Anlayış kan - beyin bariyerini işlevi fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında beyin ilaç dağıtım geliştirmek için beyin korumasını geliştirmek ve beyin tedavi sözü tutun yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemlidir bozuklukları. Ancak, insan kan - beyin bariyerini işlev eğitim meydan okuyor. Böylece, uygun modelleri için kritik bir ihtiyaç vardır. Bu bağlamda, beyin kılcal insan beyin dokusundan izole bariyer fonksiyonu olarak insan vivo içinde durum mümkün olduğunca yakın çalışma için eşsiz bir araç temsil eder. Burada, kılcal bir yüksek verimli ve tutarlı kalite ve saflık insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir protokolü açıklar. Kılcal mekanik homojenizasyon, yoğunluğu-gradient Santrifüjü ve filtrasyon kullanma taze insan beyin dokusundan izole edilmiştir. Yalıtım sonra insan beyin kapiller protein ifade ve işlev, enzim aktivitesi veya hücre içi sinyal çalışmaya sızıntı deneyleri, canlı hücre görüntüleme ve bağışıklık tabanlı deneyleri gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. İzole insan beyin kılcal insan kan - beyin bariyerini işlevi Yönetmeliği aydınlatmak için benzersiz bir model vardır. Bu model CNS hastalıkları tedavisi için tedavi edici stratejiler geliştirilmesine yardımcı olacak merkezi sinir sistemi (MSS) patogenezinde kazandırabileceğini.

İnsan beyin dokusundan izolasyonların insan beyin kılcal (Şekil 1B) zenginleştirilmiş bir süspansiyon daha büyük gemiler, kırmızı kan hücreleri, diğer tek hücreleri ve bazı hücre artıkları küçük miktarlarda verim. Bazı kılcal dallı ve bazı, kırmızı kan hücreleri kılcal lümen entrapped. Tipik kılcal bir 3-7 µm çapı ve yaklaşık 100-200 µm uzun ile açık lümen; çoğu kapiller biter daraltılır. Confocal mikroskobu kullanılarak, izole insan beyin kılcal borulu, sağl...

İnsan beyin dokusundan izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında çalışmaya preklinik model olarak kullanılabilir. Burada, beynin kılcal taze insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Bu yöntem, kan-beyin bariyeri disfonksiyonu, bariyer sızıntısı ve insan kan-beyin bariyerine özgü sinyal yolları gibi kan-beyin bariyeri araştırması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, taze insan beyin dokusundan izole edilmiş sağlam, fizyolojik olarak aktif insan beyni kılcal damarlarının incelenmesine izin vermesidir. Bu işleme başlamak için, yaklaşık 10 gram olması gereken insan beyin dokusunun ağırlığını belgeleyin.Mikroskop altında, tüm meninksleri forseps ile dikkatlice çıkarın ve beyaz maddeyi kesmek için bir neşter kullanın. Daha sonra beyin dokusunu dikkatlice kesin ve yaklaşık beş dakika boyunca bir neşter ile kıyın. Beyin dokusunu doku öğütücüye aktarın ve 30 mililitre izolasyon tamponu ekleyin.Ardından, her bir numuneyi 50 rpm'de 100 vuruşla homojenize edin. Kabarcıkları önlemek için havayı karıştırmayın. Her 25 vuruşta bir geçen süreyi ve 100 vuruş için gereken toplam süreyi belgeleyin.Daha sonra homojenatı buz üzerinde bir Dounce homojenizatöre aktarın. Süspansiyonu yaklaşık 20 vuruş homojenize edin ve kabarcıkları önleyin. Daha sonra beyin homojenatını dört adet 50 mililitrelik santrifüj tüpüne eşit olarak dağıtın.Ve homojenatın toplam hacmini belgeleyin. Doğru miktarda Ficoll eklediğinizden emin olun. Çok az veya çok fazla Ficoll, kılcal damarları hücresel kalıntılardan ayırmak için yanlış bir yoğunluğa neden olacak ve böylece kılcal paleti azaltacak ve verimi sınırlayacaktır.Havaneli ve homojenizatörü durulamak için 10 mililitre izolasyon tamponu kullanın ve dört santrifüj tüpüne dağıtın. Ardından, santrifüjleme tüplerine 50 mililitre yoğunluk gradyan tamponu dağıtın. Santrifüj tüplerini kapaklarla sıkıca kapatın.Daha sonra homojenatı, yoğunluk gradyanlı ortamı ve tamponu tüpleri kuvvetlice çalkalayarak karıştırın. Dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 5, 800 kez yerçekiminde santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atın ve her peleti iki mililitre% 1 BSA içinde yeniden süspanse edin.Peleti yeniden askıya aldıktan sonra, süspansiyonu 300 mikrometre ağından süzün. Kılcal damarlar ağ boyunca süzülürken, daha büyük damarlar ve daha büyük beyin kalıntıları ağ üzerinde kalır. Ağı 50 mililitreye kadar% 1 BSA ile dikkatlice yıkayın.Ardından ağı atın. Kılcal damarları kırmızı kan hücrelerinden ve diğer beyin kalıntılarından ayırmak için, kılcal filtratı beş adet 30 mikrometre hücre süzme filtresine dağıtın. Kılcal damarlar bu filtre tarafından tutulurken, kırmızı kan hücreleri, diğer tek hücreler ve küçük beyin artıkları filtreden geçer ve süzüntüde toplanır.Daha sonra her filtreyi 25 mililitre% 1 BSA ile yıkayın. Verimi artırmak için tüm filtratları altıncı filtrenin üzerine dökün. Her filtreyi 50 mililitre% 1 BSA ile yıkayın.Kılcal damarları içeren hücre suş filtrelerini saklayın ve süzüntüyü atın. Ardından filtreleri ters çevirin ve kılcal damarları 50 mililitre% 1 BSA ile 50 mililitrelik tüplere yıkayın. Pipet ucuyla nazikçe baskı uygulayın ve beyin kılcal damarlarını yıkamak için filtrenin üzerinde hareket ettirin.Tüm beyin kılcallarını, özellikle filtrenin kenarından yıkadığınızdan emin olun. Kabarcıklardan kaçının, çünkü bu filtrasyon işlemini daha zor hale getirir ve kılcal damar kaybı olasılığını artırır. Kılcal damarları topladıktan sonra, tüm numuneleri dört santigrat derecede üç dakika boyunca yerçekiminin 1.500 katı sıcaklıkta santrifüjleyin.Süpernatanı çıkarın ve peleti yaklaşık üç mililitre izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, bir numuneden alınan tüm yeniden askıya alınmış peletleri 15 mililitrelik konik bir tüpte birleştirin ve izolasyon tamponu ile doldurun. Dört santigrat derecede üç dakika boyunca yerçekiminin 1.500 katında tekrar santrifüjleyin ve iki kez daha yıkayın.Kılcal saflığı 100 kat büyütmede mikroskop ve kamera ile belgeleyin. İzole edilmiş beyin kılcal damarları artık deneyler için kullanılabilir, işlenebilir veya dondurulabilir ve eksi 80 santigrat derecede kriyotüplerde en az altı ila 12 ay saklanabilir. Bu şekil, bağlı bir perisit ve lümende bir kırmızı kan hücresi bulunan bir insan beyni kılcal damarının temsili olarak iletilen bir ışık görüntüsünü göstermektedir.İzole edilen insan beyni kılcal damarı, primer antikor olarak C219 kullanılarak PGP için immün boyandı ve çekirdekler DAPI ile karşı boyandı. Bu prosedürü denerken, iyi bir kılcal verim elde etmek için pipetleme ve filtreleme adımları sırasında kılcal damar kaybını önlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, izole edilmiş insan beyni kılcal damarları, farmakolojik ve fizyolojik çalışmaların yanı sıra genomik, proteomik ve selomik çalışmalar gibi çok çeşitli çalışmalar için kullanılabilir.Bu teknik, kan-beyin bariyeri alanındaki araştırmacıların, insan beyni kılcal damarlarındaki bariyer fonksiyonunu insanın in vivo durumuna mümkün olduğunca yakın bir şekilde incelemelerinin yolunu açtı. İnsan beyin dokusu ile çalışmanın kan yoluyla bulaşan patojenlerden enfeksiyon riski taşıdığını unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken laboratuvar önlüğü, yüz siperi ve eldiven giymenin yanı sıra doku örneklerinin BSL-2 ortamında kullanılması gibi güvenlik önlemleri alınmalıdır.

isolation-of-cerebral-capillaries-from-fresh-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve enzimatik sindirim yöntemlerinin bir kombinasyonunu kullanarak bir sıçan beyninden mikro damarların izolasyonunu sunar. İzole edilen mikro damarlar, endotel hücre kolonileri elde etmek için kollajen ve fibronektin matrisi ile önceden kaplanmış bir kültür şişesinde kültürlenebilir.

Sıçan Beyin Mikrodamarlarından Endotel Hücre Kültürü: Sıçan Beyninin Mikro Damarlarından Endotel Hücrelerini İzole Etme ve Kültür Prosedürü

Bu videoda, endotel hücre kontaminasyonu olmadan sığır beyin kılcal damarlarından perisitleri izole etme ve kültürleme prosedürünü gösteriyoruz.

Primer Beyin Perisitlerinin İzolasyonu ve Kültürü: Endotel Hücre Kontaminasyonu Olmadan Sığır Beyin Kılcal Damarlarından Perisitleri İzole Etme ve Kültür Prosedürü

Bu video, taze bir insan beyin dokusundan serebral kılcal damarların izolasyonunu sunar. İzole edilmiş kılcal damarlar daha sonra bir ex vivo kan beyin bariyeri modeli oluşturmak için kullanılabilir.

Serebral Kılcal Damarların İnsan Beyninden İzolasyonu: İnsan Beyin Dokusundan Serebral Kılcal Damarları Çıkarmak İçin Optimize Edilmiş Bir Yöntem

Bu video, nöronlar ve glial hücrelerle birlikte kan-beyin bariyerini (BBB) oluşturan bir farenin beyninden sağlam damarların izolasyonunu göstermektedir. İzole edilmiş damarlar, beyin homeostazının korunmasındaki rollerini incelemek için in vitro bir model olarak kullanılabilir.

Fare Beyin Damarlarının İzole Edilmesi: Murin Beyin Örneğinden Sağlam Damarları İzole Etmek İçin Bir Protokol

Bu video, kılcal damarların taze domuz beyinlerinden izolasyonunu göstermektedir. İşlem, meninkslerin çıkarılmasını, gri maddenin beyin dokusundan izole edilmesini, kılcal damarları izole etmek için gri maddenin homojenleştirilmesini ve filtrelenmesini ve son olarak kılcal damarları daha da saflaştırmak için enzimatik sindirimin kullanılmasını içerir.

Domuz beyninden kılcal damarların temizlenmesi

Bu video, ötenazi uygulanmış sıçanlardan beyin mikro damarlarını izole etme sürecini göstermektedir. Beynin diseksiyonunu, dokunun temizlenmesini ve mekanik sindirimi ve ardından mikro damarların saf fraksiyonunu izole etmek için tekrarlanan santrifüjlemeyi içerir.

Sıçan Beyninden Nörovasküler Ünitelerin İzolasyonuna Yönelik Bir Yöntem

Fare beyninin damar bölmesinin saflaştırılmasına izin veren bir protokol tarif ediyoruz. İzole beyin damarları, sıkı bağlantılarla bağlanmış ve sürekli bir bazal lamina, perisitler, vasküler düz kas hücreleri ve ayrıca perivasküler astroglial membranlarla çevrili endotel hücrelerini içerir.

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

Bu el yazması, basınç miyografisi, immünofloresan, biyokimya ve moleküler çalışmalarda kullanılmak üzere farelerden intraserebral arteriyollerin (parankimal arteriolleri, penetran arteriolleri ve pre-kılcal arteriolleri kapsayan bir grup kan damarı) izolasyonu için basit ve tekrarlanabilir bir protokolü açıklamaktadır.

İzolasyon ve Serebral Parankimal arteriollerin kanülasyonu

Biz murine serebral perisit lerin çıkarılması için bir protokol sıyoruz. Antibiyotiksiz zenginleştirme odaklı perisit çıkarma dayanarak, bu protokol, böylece kullanılan deneysel hayvan sayısını azaltarak, yüksek saflık ve yüksek verim sağlayan in vitro çalışmalar için değerli bir araçtır.

Serebral Perisitleri Fareden Ayırmak Için Yüksek Çıkış Yöntemi

Mevcut el yazması, hipokampal arteriyol ve kılcal damarları fare beyninden nasıl izole edilebildiğini ve basınç miyografisi, immünoresans, biyokimya ve moleküler çalışmalar için nasıl basınçlandırılabildiğini ayrıntılarıyla anlatmaktadır.

Fonksiyonel Çalışma için Ex Vivo Basınçlı Hipokampal Kapiller-Parenkimal Arteriyol Hazırlığı

Beyin kılcal perisitler kan-beyin bariyer özellikleri ve kan akışının düzenlenmesinde önemli oyunculardır. Bu protokol, beyin kapiller perisitlerin nasıl izole edilebildiğini, kültürlü, hücre tipine göre karakterize ve floresan problarla hücre içi kalsiyum sinyalizasyonunun araştırılması için nasıl uygulanabileceğini açıklamaktadır.

Sitosolik Kalsiyum Ölçümleri ve Kalsiyum Görüntüleme Çalışmaları için Beyin Kılcal Perisit Kültürü

Keşfedin, taze insan beyin dokusundan kan-beyin bariyeri fonksiyonunu incelemek için beyin kapilleri izolasyon protokolü. Bu yöntem, sağlık ve hastalık durumlarında bariyer mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Daha fazla video keşfet