Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

Bu prosedürün genel amacı, solucan davranışsal tepkilerinin ve solucan gen ekspresyonunun kinetiğinin izlenmesi için kontrollü çevresel koşullar altında yetişkin nematodlardaki dinamik süreçleri uzunlamasına görüntülemektir. Bu yöntem, hayvanların temel davranışlardaki farklılıklar, gen ekspresyonu, hafıza ve öğrenme dahil olmak üzere çevrelerindeki değişikliklere nasıl adapte olduklarına dair temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknik, dinamik olarak kontrol edilen ortamlar altında tek tek hayvanların çok katlı boylamsal gözleminin yanı sıra, adaptasyonun birden çok yönünün yüksek çözünürlükte aynı anda örneklenmesine izin verir.

Bu tekniğin anlamı, yüksek hassasiyetli kinetik verilerin elde edilmesi, matematiksel modellemeyi ve karmaşık hipotezlerin formülasyonunu ve test edilmesini kolaylaştırabileceğinden, hayvan adaptasyonunun nicel bir anlayışına doğru uzanır. Cihazı prosedür için ayarlamak için, önce çıkış şırınga ucunu 50 santimetrelik bir şırınga tüpüne bağlayın. Bir adaptör iğnesi yapmak için, iğne milini 20 gauge yarım inçlik bir iğnenin iğne göbeğinden çekmek için pense kullanın ve kalan plastik kalıntıyı çıkarmak için bir Bunsen brülörü kullanın.

İğnenin her iki ucunu pense ile tutarak, adaptör iğnesini deney düzeneğinin geometrisine göre bükün ve iğneyi çıkış şırınga tüpünün diğer ucuna yarıya kadar takın. Daha sonra, bir tampon giriş şırınga ucunu doğrudan üç bir vanaya bağlayın ve bir tampon giriş şırıngasını bir metrelik bir şırınga tüpüne bağlayın. Adaptör iğnesini tüpün açık ucuna yarıya kadar sokarak, tampon değişim şırıngasını şırınga ucu aracılığıyla 50 santimetrelik bir şırınga tüpüne bağlayın.

Şırınga tüpünü üç vananın kalan portuna bağlayın ve vanayı kapatın. Bir adaptör iğnesi kullanarak, solucan giriş şırıngasını az önce gösterildiği gibi bir metrelik bir şırınga tüpüne bağlayın. Ardından, tüm malzemeleri iki kez S-medium ile durulayın ve durulanan şırıngaları ve tüpleri yeni S-medium ile doldurun ve hava kabarcıklarını gidermeye dikkat edin.

Şimdi, çıkış şırınga tüpünü cihaz çıkışına bağlayın ve çıkış şırınga tüpünün ucundaki adaptör iğnesini çıkış portuna takın. S-ortamı hem tampondan hem de solucan girişlerinden çıkana kadar cihazı doldurmak için çıkıştan küçük bir hacimde S-ortamı enjekte edin. Tampon giriş şırınga tüpünü cihazın tampon giriş portuna bağlayın ve sonsuz vida girişini, otuz saniye çapında paslanmaz çelik bir dübel pimi ile takın.

Mikroakışkan cihazı, motorlu bir kademeye sahip ters çevrilmiş bir floresan mikroskobuna monte edin ve pompanın sallanırken sallanmaması için bir şırınga pompasını mikroskobun yakınındaki bir çalkalayıcıya bantlayın. Ardından, tampon giriş şırıngasını şırınga pompasına yükleyin ve pompayı, dakikada üç mikrolitre akış hızında cihaza sürekli bir S-ortamı akışı sağlayacak şekilde ayarlayın. Bakterileri mikroakışkan cihaza yüklemek için önce yüksek yoğunluklu E.coli OP50 süspansiyonuna sahip yeni bir şırınga yükleyin.

Şırıngayı dikey olarak çevirin ve şırınganın üst kısmındaki tüm hava kabarcıklarını toplamak için namluya birkaç kez vurun. Orbital çalkalayıcıyı kapatın ve tampon giriş şırıngalarının üç valfini kapatın. Tampon giriş şırıngasını bakteri yüklü şırınga ile değiştirin ve şırınganın üst kısmında toplanan tüm havayı, bakteri süspansiyonunun bir kısmı tampon değişim sistemine girene ve OP50 yüklü şırıngada veya valfte kabarcık kalmayana kadar dışarı itin.

Valf kapalıyken, bakteri yüklü şırıngayı şırınga pompasına bağlayın ve orbital çalkalayıcıyı açın. Çalkalama hızını yaklaşık 200 RPM'ye ve akış hızını dakikada 100 mikrolitreye ayarlayın. OP50 arabelleği cihaza yayıldıktan sonra, akış hızını dakikada üç mikrolitreye geri ayarlayın.

Cihazı nematodlarla doldurmak için, önce 650 mikrolitrelik düşük bağlayıcı bir mikro santrifüj tüpünü 100 mikrolitre taze OP50 süspansiyonu ile doldurun ve 20 ila 30 yaşla senkronize genç yetişkin solucanı bir nematod büyüme ortamı agar plakasından tüpe ayrı ayrı aktarmak için bir solucan toplama kullanın. Solucan giriş şırıngasını ve şırınga tüpünü taze OP50 süspansiyonu ile doldurun ve mikro santrifüj tüpüne yaklaşık 500 mikrolitre süspansiyon enjekte edin. Ardından, solucan süspansiyonunu solucan giriş şırınga tüpüne çekin ve solucan giriş şırıngasını solucan girişine bağlayın.

Tüm solucanları solucan giriş şırınga tüpünden mikroakışkan cihaza enjekte edin ve solucan giriş şırıngasını ve şırınga tüpünü ayırın. Sonsuz vida girişini bir pim ile tıkayın ve tampon giriş şırıngasını mekanik pompadan ayırın. Solucanları kanallara manuel olarak taşımak için tampon giriş şırıngasını ve gerektiğinde solucan hareketini tersine çevirmek için çıkış şırıngasını kullanın.

Hayvanların yüklenmesi biraz koordinasyon gerektirir. Kanalla aynı hizaya gelmek için şırınga pistonlarına hafifçe itin ve solucanı tamamen içeri sürmek için biraz daha güçlü bir itme kullanın. Ardından, bir deneye başlamadan önce solucanların iki ila üç saat boyunca yeni ortamlarına uyum sağlamasına izin verin.

Solucanlar kanallarıyla sınırlıdır, ancak hareketsiz değildirler. Çoğu solucan, deney süresince kanallarında kalacaktır, ancak bazıları mikrofissürlerden kaçabilir veya dolaşabilir. Burada, cihazda on saat boyunca tek bir temsili solucanın parlak alan görüntüleri gözlemlenebilir.

P.Aeruginosa, PA14 enfeksiyonu üzerine, bağışıklık tepkisi geni bir promotör altında GFP'yi eksprese eden transgenik solucanlar kullanılarak, patojene maruz kalmanın ilk beş saati boyunca solucanın orta gövdesinde ve kuyruğunda GFP ekspresyonu gözlenir ve sonraki beş saat içinde sağlam, tam vücut ifadesine yükselir. Her bir solucanın toplam floresansını enfeksiyon sonrası zamanın bir fonksiyonu olarak çizmek, immün yanıt geninin bir indüksiyonun dinamiklerini ve indüksiyonun zamanlaması ve kapsamındaki solucandan solucana değişkenliği gösterir. Solucanlar tarafından her bir kanalda bırakılan yumurtaların hızlandırılmış görüntülemesi, enfeksiyon sonrası zamanın bir fonksiyonu olarak her bir solucan tarafından bırakılan kümülatif yumurta sayısının çizilmesine izin verir ve enfeksiyon ilerledikçe yumurtlamada hayvandan hayvana değişkenliğin yanı sıra patojen kaynaklı düşüşü yakalar.

Bir kez ustalaştıktan sonra, mikroakışkan cihaz bir saat içinde hazırlanabilir ve yüklenebilir. Cihaz yüklendikten ve solucanlar alıştırıldıktan sonra, nematod nöronal ve genetik sistemlerin kontrolü ile ilgili ek soruları yanıtlamak için solucanlara belirli ilaçlar veya ilgili kimyasal ipuçları gibi diğer reaktifler verilebilir. Geliştirildikten sonra, biz ve işbirlikçilerimiz bu tekniği, nematod beslenme davranışlarının yanı sıra çeşitli ortamlarda ısı-şok enfeksiyonu ve açlığa karşı solucan genetik tepkilerini incelemek için kullandık.

Bu videoyu izledikten sonra, uzunlamasına denemeler yapmak için mikroakışkan bir cihazın nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.