Name: Boyuna Imagingde Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Keşfedin Caenorhabditis elegans için özel mikroakışkan cihaz kullanarak canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, davranışsal yanıtları ve gen ifadesi kinetiğini uzunlamasına izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma hibe PHY-1205494 aracılığıyla Ulusal Bilim Vakfı ve MCB-1413134 (EL) ve Ulusal Araştırma Vakfı Kore grant 2017R1D1A1B03035671 tarafından desteklenmiştir (KSL).

İletişim kuralı aşağıdaki WormSpa5, daha önce açıklanan mikrosıvısal aygıt Worms boyuna görüntüleme için kullanır. WormSpa (istek üzerine yazarlardan elde CAD dosyaları ile başlayan) imalatı basit ama bazı uzmanlık gerektirir. Çoğu durumda, imalat kolayca bir çekirdek tesis veya gibi hizmetler sağlar ticari bir şirket tarafından yapılabilir. Cihaz imalatı, belgili tanımlık şekil yüksekliği 50 µm olduğunu belirtmek emin olun.
1. deneysel Kur
<ol><li>Motorlu bir sahne ile bir ters Floresans mikroskobu mikrosıvısal aygıt bağlama.</li>
	<li>Orbital Çalkalayıcı mikroskop yakın yerde ama titreşim shaker dan mikroskop doğrudan etkilemez emin olun. Örneğin, görme duyusuyla ilgili tablo ile hiçbir temas yapar bir duvar üzerinde sabit bir raf shaker koymak.</li>
	<li>Bir şırınga pompa üzerinde orbital Çalkalayıcı yerleştirin. Sallayarak süre Jikleyi değil shaker pompa teyp.</li>
</ol>2. mikrosıvısal ortamı hazırlanması
Not: deneme sırasında dört şırınga mikrosıvısal aygıt yolu ile şırınga tüpler, şekil 1' de belirtildiği gibi bağlanır. Bu adımı bu şırınga hazırlanması açıklar. Aksi takdirde mezkur onları gergin yapmadan şırınga tüpler olabildiğince kısa tutmak.
<ol><li>Bir çıkış şırınga ve bir şırınga tüp hazırlayın. Bu şırınga ( şekil 1' deki S1) daha sonra olacak şırınga tüpünden cihazın çıkışına bağlı ve sıvı cihazınızdan geçici depolama için kullanılır.<ol>
<li>Bir bağdaştırıcı iğne sadece iğne (metal parça) tutmak bir 20 G x 1/2 inç şırınga ucu plastik parçaları kaldırarak olun. Plastik ve metal parçalar pense ile tutarak ve onları ayrı çekerek bunu. İğne üzerinde kalan plastik kalıntı Bunsen burner ile ebilmek yanmak.</li>
		<li>Deneysel Kur geometrisini göre iğne pense ile iki uçlarından tutarak viraj. Burada açıklanan tasarımında ortasından iğnede ~ 110 ° açı için bükme en uygundur.</li>
		<li>Bağdaştırıcı iğne yarım tüp içine takın. Diğer yarısı daha sonra cihazın içine takılı. Şırınga tüp bir sızıntı (örneğin, boru 0,86 mm iç çap ve 1.32 mm dış çapı ile) olmadan bir 20 G şırınga ucu ile uyumlu olmalıdır. Önerilen boru uzunluğu ~ 50 cm'dir.</li>
		<li>Bir 10 mL radarı-kilit şırınga şırınga tüp 20 G x 1/2 inç şırınga ucu üzerinden (açık) diğer ucunu bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arabellek girişi şırınga hazırlamak ve tüpler şırınga. Bu şırınga biri ( şekil 1' deki S2) için goes içine belgili tanımlık aygıt ve enjeksiyon akışını kontrol etmek için sıvı su deposu olarak kullanılır. Diğer şırınga (S3 şekil 1' deki) adım 3.2 açıklandığı gibi arabellek alışverişi için gerekli.<ol>
<li>Bir 10 mL radarı-kilit şırınga (S2) doğrudan bir 3-yollu vana bağlanmak ve bir şırınga tüp (şekil 1) ile aynı Vana başka bir şırınga (S3) bağlanmak: S3 tüp bir şırınga ucu üzerinden bağlanmak ve tüp valf başka bir şırınga ucu üzerinden bağlanmak. Not: Bu malzemelerin bağlandığı sırası önemli değil.</li>
		<li>Bir şırınga tüp 3-yollu vana kalan bağlantı noktasına bağlayın. Adım 2.1.2 olduğu gibi başka bir bağdaştırıcı iğne hazırlamak ve yarım iğne şırınga tüp (açık) diğer ucunu takın.</li>
		<li>Adım 2.2.2 ve S2 şırınga tüp bağlı S3 kapalı iken kapak ayarlayın (şekil 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir solucan-giriş şırınga ve bir şırınga tüp hazırlayın. Bu şırınga (S4 şekil 1' deki) solucanlar cihazın içine yüklemek için kullanılır.<ol>
<li>Bir uzun şırınga tüp 10 mL radarı-kilit şırınga (S4) bağlayın. Bu yükleme için kullanılacak olan sıvı hacmi tüpünden belirlemek; Örneğin, 100 cm hortumunun üzerinde 2 mL sıvı destekler (Ayrıca, bkz: adım 4.2).</li>
		<li>Adım 2.1.2 olduğu gibi başka bir bağdaştırıcı iğne hazırlamak ve ayaklardan biri iğne şırınga tüp diğer (açık) sonuna yarısı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şırıngalar ve boru S-Orta12 ile iki kez yıkayın. Şırıngaları ve tüpler S-Orta tüm hava kabarcıkları kaldırmak için dikkat çekici doldurun.</li>
	<li>Çıkış şırınga tüp cihazı prize bağlayın.<ol>
<li>Bağdaştırıcı iğne şırınga tüp çıkış bağlantı noktasına sonunda takın.</li>
		<li>Küçük bir S-Orta arabellek giriş ve solucan giriş dışarı gelene kadar aygıt, doldurmak için çıkış S-orta küçük bir birim enjekte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arabellek girişi şırınga tüp solucan-giriş (1/32-inç çapında paslanmaz çelik dübel PIN) PIN'i ile tıkalı ise cihazın tampon-giriş bağlantı noktasına bağlayın.</li>
	<li>Sürekli bir akış arabellek cihazın içine enjekte. Bir şırınga pompa13üzerine tampon-giriş şırınga S2 yük ve S2 ortamda sürekli bir akış hızı 3 µL/dk at cihaz içine enjekte edilir pompa ayarlayın.</li>
</ol>3. yükleme bakteri içine mikrosıvısal aygıt
<ol><li>S-Orta12' askıya Escherichia coli OP50 hazırlayın.<ol>
<li>Standart bir protokol, bir 250 mL şişe 50 mL LB ve bir koloni ile aşılamak ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Gecede kültür 4000 devirde 10 dakika santrifüj kapasitesi ve Pelet 30 mL S-Orta resuspend.</li>
		<li>Süspansiyon 5 mikron şırınga filtre ile filtre. 600 optik yoğunluğu tarafından bakteri konsantrasyonu ölçmek nm (OD600) ve 3 bir OD600 konsantrasyonu ayarlayın. Bu yüksek yoğunluklu kurtlar besili tutmak için gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OP50 süspansiyon aygıtla arabellekte değişimi.<ol>
<li>Temiz bir şırınga (S5) OP50 süspansiyon ile dolu hazırlayın. Şırınga dikey tutun ve üstündeki tüm hava baloncuklar toplamak için birkaç kez dokunun.</li>
		<li>3-yollu vana aygıtına bağlantıyı kapatmak için arabellek giriş şırıngaların açın ve iki şırınga, S2 ve S3 bağlayın. S2 şırınga pompa devreden çıkar.</li>
		<li>S2 Vana dan çıkarıp S5 kapak için takın. Biraz OP50 arabellek S3 gidene S5 üst kısmında S3 için vana toplanan tüm hava dışarı itin. Bunu yaparken, hiçbir hava kabarcığı S5 veya kapak kalır emin olun.</li>
		<li>3-yollu vana S3 ve S5 arasındaki bağlantıyı kapatmak ve S5 cihaza iletişime geçmek için yeniden orijinal konumuna gelmek. S5 şırınga pompa yükleyin. Pompa tutan orbital Çalkalayıcı üzerinde açın. Yaklaşık 200 rpm sallama hızını ayarlar.</li>
		<li>100 µL/dk'ya olmak akış hızını ayarlayın. İçinde belgili tanımlık aygıt solucanlar ulaşması için yeni tampon için gereken zaman arabellek giriş şırınga tüp (yaklaşık 5 dakika yukarıda açıklanan boru ile) uzunluğunu bağlıdır. Daha hızlı bir tampon değişimi gerekli ise bir daha yüksek akış hızı istihdam edilebilir.</li>
		<li>Bir kez OP50 arabellek cihazın yayılır, akış hızı 3 µL/dak için geri ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. yükleme solucanlar mikrosıvısal cihazın içine
<ol><li>Bir küçük düşük bağlama microcentrifuge tüp (650 µL) hazırlamak ve OP50 süspansiyon 100 µL ile doldurun. Çevresinde transferi tek solucan ile seçerek (46 saat sonrası L1 larva tutuklama 25 ° C'de) Yetişkin solucanlar bir NGM (nematodunun büyüme orta) agar plaka tüp almak 20-30 yaş senkronize genç. Yaş-eşitleme standart protokol12yapılabilir.</li>
	<li>Solucan-giriş doldurmak şırınga ve şırınga tüp (S4 şekil 1' deki) OP50 süspansiyon ile. ~ 500 µL sıvının Kurtlarla microcentrifuge tüp içine enjekte. Süspansiyon ile solucanlar solucan-giriş şırınga tüp içine çizin. Şırınga tüp yeterince uzun olduğundan emin olun (> 1 m) ve çizilmiş solucanlar şırınga tüp içinde kalmak ve yapmak değil yapmak şırınga S4 sonuna kadar.</li>
	<li>S4 solucan-koya bağlayın. Tüm solucanlar solucan-giriş şırınga tüp mikrosıvısal cihazın içine enjekte. S4 ve şırınga tüp çıkarın. Solucan-giriş bir iğne ile takın.</li>
	<li>S2 arabellek giriş şırıngadan mekanik pompa ( Resim 1) kapatın ve el ile S1 ve S2 tüm solucanlar ayrı kanal içine itmek için kontrol edin. S1 basmak onları ters yönde ilerlemeye neden olur iken S2 basmak solucanlar kanallarına ilerlemeye neden olur. Bir kanal yüklendikten sonra solucan her kanaldaki diğer solucanları girişini engeller.</li>
	<li>Solucanlar 2-3 saat için yeni ortamına ayarlamak izin.</li>
</ol>5. bir görüntüleme Protokolü kurma
<ol><li>Güvenli belgili tanımlık aygıt içinde yer alan tüm solucanlar bulmak ve her-in onları içinde senin mikroskop denetler görüntü edinme yazılım için bir görüntüleme konumu ayarlayın. Unutmayın bazı durumlarda (örneğin daha yüksek büyütme istendiğinde veya fotoğraf makinesi ile daha küçük bir CCD sensör kullanırken) birden çok görüntüleme pozisyonlar her kanal için gereklidir. Not: Bu el ile yapılabilir iken, bazı satın alma yazılım paketleri görüntüleri nereden alınacağını konumlarını listeleyen bir metin dosyası yükleyebilirsiniz. Bu pozisyonlar düzenli olarak WormSpa içinde sıralanır beri bir kullanıcı (Örneğin, Python veya ticari yazılım) otomatik olarak böyle bir liste oluşturduğu küçük bir betik yazabilirsiniz. Bu komut dosyası hassas biçimi edinme yazılım (bakınız ek malzeme 1örnekte bir) tarafından beklenen dosya biçimi bağlıdır.</li>
	<li>Hızlandırılmış görüntüleme gerekli sıklığını ayarlayın. Örneğin, görüntüleme bağışıklık gen yanıt enfeksiyon kare başına 10 dakika bir frekansta yapılır. Tüm gerekli kanal (örneğin parlak alan ve GFP floresan) her zaman noktasında iktisap emin olun.</li>
</ol>6. ana bilgisayar yanıt Pseudomonas enfeksiyon
Not: Bu ana bilgisayar-patojen etkileşimleri eğitim için belirli bir adımdır. Alternatif olarak, bir faiz (biyotik ve abiyotik stres, ilaçlar, sinyal molekülleri, vb) diğer çevre ipuçları içeren bir arabellek hazırlayabilirsiniz.
<ol><li>SK-orta14' te askıya Pseudomonas aeruginosa PA14 hazırlayın.<ol>
<li>50 mL LB ve bir koloni ile 250 mL şişe aşılamak ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Başka bir 250 mL şişe 50 mL lb ve bir aliquot kültür aşılamak ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Gecede kültür 4000 devirde 10 dakika santrifüj kapasitesi ve Pelet 10 mL SK-orta resuspend. Bakteri konsantrasyonu ölçümü ve konsantrasyon OD600 ayarlamak = 4.</li>
		<li>Süspansiyon için temiz bir şişeye aktarmak ve 24 saattir 37 ° c ve 25 ° c sallayarak süre başka bir 24 saat kuluçkaya. Bu adımı tahlil14öldürme standart plaka-kuluçka adımda taklit eder.</li>
		<li>Süspansiyon 5 mikron şırınga filtre ile filtre. Bu cihazın tıkanma bakteriyel toplamları önlemektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cihazın OP50 süspansiyon aşağıdaki adım 3.2 olduğu gibi aynı yordamı PA14 süspansiyon ile değiştirin. 10 saat için Imaging tutmak.</li>
</ol>

<ol><li>Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+gene+expression+to+changing+environments%3A+from+rapid+responses+to+evolutionary+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).</li>
<li>de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+gene+expression+in+response+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Controlling gene expression in response to stress.</a> Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+Streamlining+discovery+in+worm+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology.</a> Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).</li>
<li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li>
<li>Kopito, R. B., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+spatiotemporal+surveillance+of+Caenorhabditis+elegans+response+to+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues.</a> Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).</li>
<li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+Responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998(2014).</li>
<li>Grisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+spectroscopy+of+single+sub-nL+ova+with+inductive+ultra-compact+single-chip+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes.</a> Sci Rep. 7, 44670(2017).</li>
<li>Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-enabled+phenotyping%2C+imaging%2C+and+screening+of+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms.</a> Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).</li>
<li>Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+manipulation+of+neural+activity+in+freely+moving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HandKAchip+-+Hands-free+killing+assay+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip.</a> Sci Rep. 6, 35862(2016).</li>
<li>Lee, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin-dependent+kinetics+of+feeding+bursts+underlie+a+graded+response+to+food+availability+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans.</a> Nat Commun. 8, 14221(2017).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sisweb.com/lc/new-era-ne1000.htm">NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps</a>. , New Era Pump Systems Inc. (2017).</li>
<li>Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+Caenorhabditis+elegans+by+Pseudomonas+aeruginosa+used+to+model+mammalian+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li>
<li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2 (11), 183(2006).</li>
<li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li>
<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+I.+Wild-type+growth+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).</li>
<li>Chalancon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+gene+expression+noise+and+regulatory+network+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture.</a> Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).</li>
<li>Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in gene expression.</a> Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).</li>
<li>Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Switching+of+Cell+Fate+in+Microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).</li>
<li>Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+genetic+networks+and+identifying+compound+mode+of+action+via+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling.</a> Science. 301 (5629), 102-105 (2003).</li>
<li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li>
<li>Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malate+and+Fumarate+Extend+Lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58345(2013).</li>
<li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19997/">C. elegans II</a>. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).</li>
<li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652(2017).</li>
<li>Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+method+for+automatically+measuring+pharyngeal+pumping+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans.</a> J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).</li>
<li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mikrosıvısal araçları solucanlar eğitim birden çok yarar sağlar. Bir PDMS görüntüleme aygıt standart NGM agar plaka ile karşılaştırıldığında daha yüksek görüntü kalitesi sunar. Birden çok görüntüyü hangi hayvanlar plaka aldı ve mikroskop slayt görüntüleme için monte geleneksel yöntemler aksine tek bir solucan alınabilir. Buna ek olarak, solucanlar bulunduğu microenvironment sabit veya istediğiniz ortamı bileşimi ve hayvanların yanıt arasındaki eşlemeyi kesin izin kadar modüle tutulabilir.
Bura...

Çevre koşulları değişiklikler genetik programlar indüksiyon ve baskı belirli genler1,2ifadenin eşliğinde aktivasyonu neden olabilir. Bu kinetik değişiklikler doku aynı hayvanlarda ve farklı hayvanlar arasında arasında değişken olabilir. Çalışmalar genetik gibi programlar bu nedenle bireysel hayvanların boyuna görüntüleme izin ve çevre koşulları hassas dinamik kontrol sağlar yöntemler için ara.
Son yıllarda, microfabricated sıvı aygıtlar yanıt ve davranış küçük hayvanlarda, solucanlar, sinekler, su ayılar ve daha fazla3,4,5,6de dahil olmak üzere birçok açıdan incelemek için kullanılmıştır, 7. Uygulamalar içerir, örneğin, derin fenotipleme, kimyasal uyaranlara yanıt olarak nöronal aktivite kayıt ve hareket ve pompa8,9,10 gibi motor davranışların optogenetic , 11.
Yanıt-e doğru yerel microenvironment, bakım sağlayan esnek tasarım hassas dinamik kontrol dahil olmak üzere, çevre yardımlar uzun vadeli uzunlamasına görüntüleme faydalı olacağını pek çok özellik mikrosıvısal tabanlı yaklaşımlar tutun bireysel hayvanlar ayrı üç aylık dönemler ve görüntüleme için olumlu nitelikleri. Ancak, onların iyi varlıklar üzerinde en az yan etki ile uzun bir süre bir mikrosıvısal odası hayvanlarda Bakımı mikrosıvısal cihazın tasarımının yanı sıra deneme yürütülmesi özel dikkat gerektirir bir meydan okumadır.
Burada WormSpa, bir mikrosıvısal aygıt Caenorhabditis elegansboyuna görüntüleme için kullanımını göstermektedir. 5 bireysel solucanlar odasında sınırlı. Sıvı ve bakteriyel süspansiyon sürekli bir düşük akış garanti eder iyi beslenmiş ve iyi bir sağlık bakımı ve stresi hafifletmek için yeterince aktif solucanlar ve yumurtalarını bırakmak solucanlar odaları yapısını sağlar. Tasarımın sadeliği ve WormSpa işletme araştırmacılar ile hayır önceki deneyim havacilik bu cihaz kendi araştırma planları dahil etmek için izin vermelidir.

<table><tbody><tr><td>WormSpa N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td>WormSpa için CAD dosyası Levine laboratuvarından temin edilebilir.</td></tr><tr><td>Bileşik Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td> Motorlu kademeli Şırınga Pompalı ters <td>çevrilmiş bir floresan mikroskobu</td></tr><tr><td></td><td>New Era Pompa Sistemleri</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Boru SCI</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0,034 inç (0,86 mm) İç Çap x 0,052" (1,32 mm) OD</td></tr><tr><td>Şırınga Ucu</td><td>CMLsupply</td><td>901-20-050</td><td>20 Ölçer x 1/2 "künt uç paslanmaz çelik kanül</td></tr><tr><td>Şırınga Filtre</td><td>PALL</td><td>4650</td><td>Acrodisc 32 mm Şırınga Filtresi, 5 um Supor Membran</td></tr><tr><td>Şırıngalı</td><td>Qosina</td><td>C3307</td><td>10 mL Erkek Luer Kilit Şırınga</td></tr><tr><td>3 Vana</td><td>ColeParmer</td><td>FF-30600-23</td><td>Büyük delikli 3, erkek kilitli, musluklar, 10/paket, Steril Olmayan</td></tr><tr><td>Dübel Pimi</td><td>McMaster-Carr</td><td>90145A317</td><td>18-8 Paslanmaz Çelik Dübel Pimleri (1/32" Çap x 1/2" Lg.)</td></tr><tr><td>Düşük Bağlayıcı Mikrosantrifüj Tüpü</td><td>Corning</td><td>CL S3206</td><td>0.65 mL düşük bağlayıcı çıtçıtlı kapaklı mikrosantrifüj tüpü</td></tr></tbody></table>

boyuna imaging'de caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal platform

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Son on yılda, mikrosıvısal teknikleri küçük hayvanlar Caenorhabditis elegans, Yuvarlak solucanlar da dahil olmak üzere, çalışma için başvuran ve uygun bir canlı görüntüleme platformu için hassas kontrol sağlar yararlı kanıtladık deneysel koşullar içinde gerçek zaman. Bu makalede, biz bireysel Worms WormSpa, daha önce yayımlanmış özel mikrosıvısal aygıt istihdam canlı görüntüleme göstermek. Cihazda, birden çok solucanlar chambers, çeşitli biyolojik süreçlerin çoğaltılmış boyuna gözetim sağlayan ayrı ayrı ayrı sınırlı. Belgili tanımlık yeteneklilik göstermek için biz solucan içinde belgili tanımlık aygıt patojen bakteri ile enfekte ve bağışıklık yanıtı genler ve yumurta atarken ifadesi dinamiklerini sürekli bireysel takip kanıt prensibi deneyler gerçekleştirilen hayvanlar. Basit tasarım ve işletme bu cihazın uygun mikrosıvısal tabanlı deneyleri ile önceki deneyimi olmayan kullanıcılar için yapmak. Önerdiğimiz bu yaklaşım pek çok araştırmacı iyi tanımlanmış koşullar altında biyolojik süreçlerin boyuna gözlemler ilgilenen yararlı olacaktır.

(46 saat sonrası L1 larva tutuklama 25 ° c)12 iletişim kuralında tanımlanan olarak cihazda yüklü yaş senkronize genç yetişkin solucanlar. Solucanlar ayrı ayrı ayrı kanalları, hayvanların yanıt patojeni boyuna ölçümü etkinleştirme yer. Deneme başarılı olduğunda, Solucanların çoğu onların kanallarında deneme süresince kalır. Bu durumda, bireysel solucanlar görüntülerini aktif olarak hayvan bulma gereksinimini kaçınarak görüntüleme yolundaki onların kanal yerleştirere...

Bu makalede, biz bireysel Worms özel mikrosıvısal aygıt istihdam canlı görüntüleme göstermek. Cihazda, birden çok solucanlar chambers, çeşitli biyolojik süreçlerin çoğaltılmış boyuna gözetim sağlayan ayrı ayrı ayrı sınırlı.

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Bu prosedürün genel amacı, solucan davranışsal tepkilerinin ve solucan gen ekspresyonunun kinetiğinin izlenmesi için kontrollü çevresel koşullar altında yetişkin nematodlardaki dinamik süreçleri uzunlamasına görüntülemektir. Bu yöntem, hayvanların temel davranışlardaki farklılıklar, gen ekspresyonu, hafıza ve öğrenme dahil olmak üzere çevrelerindeki değişikliklere nasıl adapte olduklarına dair temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknik, dinamik olarak kontrol edilen ortamlar altında tek tek hayvanların çok katlı boylamsal gözleminin yanı sıra, adaptasyonun birden çok yönünün yüksek çözünürlükte aynı anda örneklenmesine izin verir.Bu tekniğin anlamı, yüksek hassasiyetli kinetik verilerin elde edilmesi, matematiksel modellemeyi ve karmaşık hipotezlerin formülasyonunu ve test edilmesini kolaylaştırabileceğinden, hayvan adaptasyonunun nicel bir anlayışına doğru uzanır. Cihazı prosedür için ayarlamak için, önce çıkış şırınga ucunu 50 santimetrelik bir şırınga tüpüne bağlayın. Bir adaptör iğnesi yapmak için, iğne milini 20 gauge yarım inçlik bir iğnenin iğne göbeğinden çekmek için pense kullanın ve kalan plastik kalıntıyı çıkarmak için bir Bunsen brülörü kullanın.İğnenin her iki ucunu pense ile tutarak, adaptör iğnesini deney düzeneğinin geometrisine göre bükün ve iğneyi çıkış şırınga tüpünün diğer ucuna yarıya kadar takın. Daha sonra, bir tampon giriş şırınga ucunu doğrudan üç bir vanaya bağlayın ve bir tampon giriş şırıngasını bir metrelik bir şırınga tüpüne bağlayın. Adaptör iğnesini tüpün açık ucuna yarıya kadar sokarak, tampon değişim şırıngasını şırınga ucu aracılığıyla 50 santimetrelik bir şırınga tüpüne bağlayın.Şırınga tüpünü üç vananın kalan portuna bağlayın ve vanayı kapatın. Bir adaptör iğnesi kullanarak, solucan giriş şırıngasını az önce gösterildiği gibi bir metrelik bir şırınga tüpüne bağlayın. Ardından, tüm malzemeleri iki kez S-medium ile durulayın ve durulanan şırıngaları ve tüpleri yeni S-medium ile doldurun ve hava kabarcıklarını gidermeye dikkat edin.Şimdi, çıkış şırınga tüpünü cihaz çıkışına bağlayın ve çıkış şırınga tüpünün ucundaki adaptör iğnesini çıkış portuna takın. S-ortamı hem tampondan hem de solucan girişlerinden çıkana kadar cihazı doldurmak için çıkıştan küçük bir hacimde S-ortamı enjekte edin. Tampon giriş şırınga tüpünü cihazın tampon giriş portuna bağlayın ve sonsuz vida girişini, otuz saniye çapında paslanmaz çelik bir dübel pimi ile takın.Mikroakışkan cihazı, motorlu bir kademeye sahip ters çevrilmiş bir floresan mikroskobuna monte edin ve pompanın sallanırken sallanmaması için bir şırınga pompasını mikroskobun yakınındaki bir çalkalayıcıya bantlayın. Ardından, tampon giriş şırıngasını şırınga pompasına yükleyin ve pompayı, dakikada üç mikrolitre akış hızında cihaza sürekli bir S-ortamı akışı sağlayacak şekilde ayarlayın. Bakterileri mikroakışkan cihaza yüklemek için önce yüksek yoğunluklu E.coli OP50 süspansiyonuna sahip yeni bir şırınga yükleyin.Şırıngayı dikey olarak çevirin ve şırınganın üst kısmındaki tüm hava kabarcıklarını toplamak için namluya birkaç kez vurun. Orbital çalkalayıcıyı kapatın ve tampon giriş şırıngalarının üç valfini kapatın. Tampon giriş şırıngasını bakteri yüklü şırınga ile değiştirin ve şırınganın üst kısmında toplanan tüm havayı, bakteri süspansiyonunun bir kısmı tampon değişim sistemine girene ve OP50 yüklü şırıngada veya valfte kabarcık kalmayana kadar dışarı itin.Valf kapalıyken, bakteri yüklü şırıngayı şırınga pompasına bağlayın ve orbital çalkalayıcıyı açın. Çalkalama hızını yaklaşık 200 RPM'ye ve akış hızını dakikada 100 mikrolitreye ayarlayın. OP50 arabelleği cihaza yayıldıktan sonra, akış hızını dakikada üç mikrolitreye geri ayarlayın.Cihazı nematodlarla doldurmak için, önce 650 mikrolitrelik düşük bağlayıcı bir mikro santrifüj tüpünü 100 mikrolitre taze OP50 süspansiyonu ile doldurun ve 20 ila 30 yaşla senkronize genç yetişkin solucanı bir nematod büyüme ortamı agar plakasından tüpe ayrı ayrı aktarmak için bir solucan toplama kullanın. Solucan giriş şırıngasını ve şırınga tüpünü taze OP50 süspansiyonu ile doldurun ve mikro santrifüj tüpüne yaklaşık 500 mikrolitre süspansiyon enjekte edin. Ardından, solucan süspansiyonunu solucan giriş şırınga tüpüne çekin ve solucan giriş şırıngasını solucan girişine bağlayın.Tüm solucanları solucan giriş şırınga tüpünden mikroakışkan cihaza enjekte edin ve solucan giriş şırıngasını ve şırınga tüpünü ayırın. Sonsuz vida girişini bir pim ile tıkayın ve tampon giriş şırıngasını mekanik pompadan ayırın. Solucanları kanallara manuel olarak taşımak için tampon giriş şırıngasını ve gerektiğinde solucan hareketini tersine çevirmek için çıkış şırıngasını kullanın.Hayvanların yüklenmesi biraz koordinasyon gerektirir. Kanalla aynı hizaya gelmek için şırınga pistonlarına hafifçe itin ve solucanı tamamen içeri sürmek için biraz daha güçlü bir itme kullanın. Ardından, bir deneye başlamadan önce solucanların iki ila üç saat boyunca yeni ortamlarına uyum sağlamasına izin verin.Solucanlar kanallarıyla sınırlıdır, ancak hareketsiz değildirler. Çoğu solucan, deney süresince kanallarında kalacaktır, ancak bazıları mikrofissürlerden kaçabilir veya dolaşabilir. Burada, cihazda on saat boyunca tek bir temsili solucanın parlak alan görüntüleri gözlemlenebilir.P.Aeruginosa, PA14 enfeksiyonu üzerine, bağışıklık tepkisi geni bir promotör altında GFP'yi eksprese eden transgenik solucanlar kullanılarak, patojene maruz kalmanın ilk beş saati boyunca solucanın orta gövdesinde ve kuyruğunda GFP ekspresyonu gözlenir ve sonraki beş saat içinde sağlam, tam vücut ifadesine yükselir. Her bir solucanın toplam floresansını enfeksiyon sonrası zamanın bir fonksiyonu olarak çizmek, immün yanıt geninin bir indüksiyonun dinamiklerini ve indüksiyonun zamanlaması ve kapsamındaki solucandan solucana değişkenliği gösterir. Solucanlar tarafından her bir kanalda bırakılan yumurtaların hızlandırılmış görüntülemesi, enfeksiyon sonrası zamanın bir fonksiyonu olarak her bir solucan tarafından bırakılan kümülatif yumurta sayısının çizilmesine izin verir ve enfeksiyon ilerledikçe yumurtlamada hayvandan hayvana değişkenliğin yanı sıra patojen kaynaklı düşüşü yakalar.Bir kez ustalaştıktan sonra, mikroakışkan cihaz bir saat içinde hazırlanabilir ve yüklenebilir. Cihaz yüklendikten ve solucanlar alıştırıldıktan sonra, nematod nöronal ve genetik sistemlerin kontrolü ile ilgili ek soruları yanıtlamak için solucanlara belirli ilaçlar veya ilgili kimyasal ipuçları gibi diğer reaktifler verilebilir. Geliştirildikten sonra, biz ve işbirlikçilerimiz bu tekniği, nematod beslenme davranışlarının yanı sıra çeşitli ortamlarda ısı-şok enfeksiyonu ve açlığa karşı solucan genetik tepkilerini incelemek için kullandık.Bu videoyu izledikten sonra, uzunlamasına denemeler yapmak için mikroakışkan bir cihazın nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

a-microfluidic-platform-for-longitudinal-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Bu makale, nematod embriyogenezisin erken olayların görselleştirme için kullanılan bir...

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için...

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Içinde isteğe bağlı hareket ikna etmek için bir yarı-otomatik mikro-elektro-akışkan...

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Hayvanın hareketsiz hale getirilmeden uzun zaman ölçeklerinde davranışı ve nöral aktiviteyi görüntülemek, davranışı anlamak için bir ön koşuldur. Agaroz mikroakışkan odacıkların görüntülenmesi (), Caenorhabditis elegans'ın tüm yaşam evreleri için nöral aktivite ve davranışı görüntülemek için kullanılabilir.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

C. elegans erkeklerin verimli kalsiyum görüntüleme için bir adapte "koku çip" kullanımı burada açıklanmıştır. Gliserol ve bir feromon erkek maruz çalışmaların da gösterilir.

Yanıt olarak erkek C. Elegans baş nöronlar Feromonlar nöronal aktivite görüntüleme için adapte mikrosıvısal koku kozu kullanımı

Burada, nörogelişme sırasında tek hücreli dinamikleri anlamak için C. elegans embriyoları yaşayan yüksek çözünürlüklü mikroskobik, Hesaplamalı araçlar ve tek hücreli etiketleme kullanarak bir Kombinatoryal yaklaşım sunuyoruz.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Protokol, 36 saate kadar sürekli bir gıda arzı varlığında C. elegans yetiştirmek için kullanılan basit bir mikroakışkan çip tasarımını ve mikrofabrikasyon metodolojisini açıklamaktadır. Büyüme ve görüntüleme cihazı ayrıca, birkaç gün boyunca geliştirme sırasında hücresel ve hücre altı süreçlerin aralıklı uzun süreli yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Burada, yaşam boyu fizyolojik parametre takibi ve floresan ölçümü için katı ortam üzerinde izole edilmiş bireysel nematodların kültürlenmesine yönelik bir protokol sunuyoruz. Bu kültür sistemi, hayvanların kaçmasını önlemek için tek solucan kuyularının etrafında bir palmitik asit bariyeri içerir ve patojenik bakteriler ve kimyasal stresörler de dahil olmak üzere önleyici müdahalelerin kullanılmasına izin verir.

Uzunlamasına floresan izleme ve aversif müdahaleler için katı ortam üzerinde bireysel caenorhabditis elegans'ın uzun süreli kültürü

Bu protokol, tüm embriyonik sonrası gelişim boyunca mikroakışkan tabanlı C. elegans hızlandırılmış görüntülemeyi tanımlar.

Tüm larva aşamalarında yüksek çözünürlüklü C. elegans görüntüleme

Keşfedin Caenorhabditis elegans için özel mikroakışkan cihaz kullanarak canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, davranışsal yanıtları ve gen ifadesi kinetiğini uzunlamasına izlemeyi sağlar.

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

Daha fazla video keşfet