Lipid bolluk ve değerlendirme Lipid dağılımı Nil kırmızı ve O kırmızı petrol boyama tarafından Caenorhabditis elegans miktar

Bu boyama yöntemlerinin genel amacı, hücre içi lipid bolluğunu ölçmek ve farklı dokular arasındaki lipid dağılımını değerlendirmektir. Bu yöntem, lipitlerin genetik ve biyokimyasal olarak nasıl düzenlendiği ve bunun lipid homeostazını hangi hastalık durumuna göre düzenlediği gibi lipid metabolizmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gerçekleştirilmesinin nispeten basit ve ucuz olmasıdır.

Nil Kırmızısı lipid boyamasını gerçekleştirmek için, geç log OP50 E.coli ile tohumlanmış Nematod Büyüme Ortamı veya NGM üzerinde plaka kurtları ve solucanları 20 santigrat derecede erken L4 aşamasına kadar büyütün. Solucanları bir milimetre PBST solüsyonu ile yıkayın ve solucan süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın. Solucanları bir dakika boyunca 560 kez yerçekiminde santrifüjleyin.

Ardından süpernatanı çıkarın ve E.coli süspansiyondan temizlenene kadar PBST yıkamasını tekrarlayın. Daha sonra, solucan peletine 100 mikrolitre %40 izopropanol veya ORO boyama için %60 ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. İzopropanol ilavesi, boyamadan önce solucanların uygun şekilde geçirgenleşmesi için çok önemlidir.

Solucanları bir dakika boyunca 560 kez yerçekiminde santrifüjleyin ve solucan peletini bozmadan süpernatanı çıkarın. Santrifüjleme adımları sırasında ışığa maruz kalmayı en aza indirmek önemlidir. Şimdi karanlıkta, her numuneye 600 mikrolitre önceden hazırlanmış NR çalışma solüsyonu ekleyin.

Tüpleri üç kez ters çevirin ve solucanları ve çözeltiyi tamamen karıştırın. Daha sonra numuneyi karanlıkta oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Kuluçka işleminden sonra solucanları santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.

Daha sonra 600 mikrolitre PBST ekleyin ve fazla NR lekesini çıkarmak için numuneleri karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Numuneleri daha önce olduğu gibi tekrar döndürdükten sonra, yaklaşık 50 mikrolitre süpernatan hariç hepsini çıkarın ve kalan çözeltide solucan peletini yeniden süspanse edin. Slaytları görüntüleme için hazırlamak için, beş mikrolitre solucan süspansiyonunu bir mikroskop lamına pipetleyin ve herhangi bir hava kabarcığı sıkışmasını önlemek için dikkatlice bir lamel uygulayın.

NR lekeli solucanları görüntülemek için FITC GFP kanalını kullanarak ve farklı pozlama sürelerini deneyerek, görüş alanı başına birkaç hayvanı yakalamak için solucanları beş kat büyütmede görüntüleyin. Ardından, tek tek solucanların daha iyi ölçülmesi için 10 kat büyütmeye geçin. Görüntüleri ölçmek için mikrografları ImageJ'ye yükleyin.

Görüntü açılır menüsünde, görüntü destesinin parlaklığını, kontrastını ayarlayın ve uygula'yı tıklayarak değişiklikleri tüm görüntülere yayın. Görüntülenen her bir solucanı tanımlamak için çokgen seçim aracını kullanın ve analiz açılır menüsünün altında, NR tarafından yayılan floresan yoğunluğunu nitelendirmek için ölçüm işlevini kullanın. Her görüntü için beş arka plan konumunu ölçün ve ortalama arka plan floresan yoğunluğunu hesaplayın. Her numuneye 600 mikrolitre Yağ Kırmızısı O veya ORO çalışma çözeltisi ekleyin ve solucanları ve ORO'yu iyice karıştırmak için tüpü üç kez ters çevirin.

Örnekleri 30 RPM'de döndürün ve iki saat boyunca RT'ye alın. Numuneleri bir dakika boyunca 560 kez yerçekiminde santrifüjleyin ve 100 mikrolitre hariç tüm süpernatanı aspire edin. Daha sonra numuneleri yeniden süspanse etmek için 600 mikrolitre PBST kullanın ve fazla ORO lekesini çıkarmak için tüpleri 30 dakika boyunca 30 RPM'de döndürün.

Hayvanların germ hattının bağırsak hücrelerindeki yerini daha iyi ayırt etmek için, her bir mililitre ORO çalışma çözeltisi için bir mikrolitre DAPI ekleyerek çekirdekleri boyayın. Daha sonra görüntüleme için slaytlar hazırlamak için, solucanları ve kalan süpernatanı yeniden süspanse edin ve çözeltiyi iyice karıştırın. Bir mikroskop lamına beş mikrolitre solucan süspansiyonu koyun ve hava kabarcığı oluşmadığından emin olmak için dikkatlice bir lamel uygulayın.

ORO lekeli solucanları görüntülemek için, bir görüş alanında birkaç solucanı görüntülemek için beş kat büyütmede renk özellikli bir kamera kullanın. Ardından, tek tek solucanların daha iyi incelenmesi için 10 kat büyütmeye geçin. Son olarak, görüntüleri ImageJ'e yükledikten ve metin protokolüne göre bir görüntü destesi oluşturduktan sonra, görüntüleri hayvanın vücudundaki veya belirli dokulardaki lipit birikimine göre kategorilere ayırın.

SKN-1, memeli Nrf2 ile homolojiyi paylaşır ve yağ asidi oksidasyonuna aracılık ettiği gösterilmiştir. Bu şekil, lipid seviyelerinin artmasına neden olan koşullara maruz kalan aktive edilmiş SKN-1 hayvanlarını göstermektedir. Bu görüntülerde görüldüğü gibi, FITC GFP kanalı kullanılarak yakalanan NR floresansı bağırsak boyunca belirgindir, ancak baş, kuyruk ve bağırsak lümeninde daha sönüktür.

Solucanları Yaşa Bağlı Somatik Yağ Tükenmesi veya ASDF'nin varlığına veya yokluğuna göre kategorize etmek kolay olsa da, orta düzeyde yağ kaybı olan hayvanları tanımlamak zor olabilir. Az sayıda yarı saydam alana sahip vücut boyunca parlak kırmızı lekelenme gösteren ASDF olmayan hayvanlarla karşılaştırıldığında, ASDF solucanları bağırsak hücrelerinde gözle görülür yağ tükenmesi gösterir. ASDF geliştirme sürecindeki hayvanlar genellikle yağ kaybının çoğunun meydana geldiği yarı saydam noktalar gösterir.

Ayrıca, ASDF solucanları baş ve kuyruk bölgelerinde hala parlak kırmızı lekelenmeye sahip olabilir, çünkü fenotip tam somatik yağ kaybı ile değil, yaşlanmamış hayvanlara göre geniş yağ tükenmesi ile tanımlanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat artı görüntüleme süresinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, boyamadan en fazla 30 dakika önce solucanları yıkamayı ve geçirgen hale getirmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, her bir teknolojinin tanımladığı lipit türlerinin türünü karşılaştırmak ve belirli soru türleri için hangi yöntemin daha uygun olduğunu belirlemek için CARS mikroskobu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, Nil Kırmızısı ve Yağ Kırmızısı O boyaması ve ardından ImageJ mikrograf analizi kullanarak lipitlerin nasıl ölçüleceğini ve solucanlardaki lipit dağılımının nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.