Name: Lipid bolluk ve değerlendirme Lipid dağılımı Nil kırmızı ve O kırmızı petrol boyama tarafından Caenorhabditis elegans miktar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Öğrenin Caenorhabditis elegans'ta Nile red ve Oil red O boyama ile lipid bolluğunu nicel olarak ölçme ve lipid dağılımını değerlendirme yöntemlerini. Bu basit ve ekonomik teknikler lipid metabolizması araştırmalarında temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NIH grant tarafından mümkün yapıldı: R01GM109028 (S.P.C.)

1. Nil kırmızı (NR) lipitler boyama
<ol><li>5 mg/mL NR hisse senedi çözüm hazırlanması<ol>
<li>500 mL şişe NR tozu 100 mg 200 mL % 100 aseton ekleyin.</li>
		<li>Işık için herhangi bir maruz önlemek için alüminyum folyo ile şişe kapağı.</li>
		<li>Önce kullanma, belgili tanımlık eriyik için 2 h karanlıkta karıştırın.</li>
		<li>Uzun süreli kullanım için NR hisse senedi çözüm olmadan herhangi bir ışık pozlama sıkıca kapalı bir şişede saklayın. Ölçek NR hisse senedi araştırma gereksinimlerinize uygun bir çözüm. Aynı hisse senedi çözüm NR boyama deneyler tutarlı boyama ve sonuçları görüntüleme elde etmek için kullanıldığından emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR çalışma çözüm hazırlanması<ol>
<li>% 40 isopropanol (v/v) her 1 mL için 6 µL NR hisse senedi çözüm ekleyin.</li>
		<li>NR çalışma çözüm 600 µL her örnek için hazırlayın. Not: taze NR boyama önce çözüm değil çalışma yapmak. NR hisse senedi çözüm ihtiyaçlarınıza bağlı olarak, kullanım 15 mL veya 50 mL konik tüp mezun oldu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR lipid boyama için hazırlanması solucanlar<ol>
<li>Solucanlar için erken L4 sahneye geç günlük OP50 E. coliile seribaşı nematodunun büyüme orta (NGM) 20 ° C'de büyümek.</li>
		<li>1 mL 1 x fosfat tamponlu tuz + % 0,01 Triton X-100 (PBST) çözüm ile plaka kapalı solucanlar yıkama ve 1.5 mL microfuge tüpte solucan süspansiyon koymak.</li>
		<li>Santrifüj 560 x g 1 dk. de süpernatant ve tekrar bu adım E. coli kadar temizlenir süspansiyon solucanlarını.</li>
		<li>% 40 isopropanol 100 µL solucan Pelet ekleyin ve 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Santrifüj kapasitesi 560 x g 1 dk. için de kurt ve solucan Pelet aksatmadan süpernatant kaldırın. Not: Eğer solucanlar plakaları kapalı yıkamayı PBST kullanımı daha yüksek hacimli büyük tabak kullanarak veya plaka başına daha fazla solucanlar boyama. Solucanlar örnek fiksasyon önce 15 dk içinde PBST daha yıkama yok. Süpernatant bakteri temizlenmez ise ek yıkama yapar. Bir nutator veya rocker kullanarak % 40 isopropanol kuluçka yerine getirir. Her zaman tam örnek ajitasyon oluştuğunu emin olmak için tüpler monitör.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipid NR ile boyama<ol>
<li>Karanlıkta, her örnek için 600 µL NR çalışma çözüm ekleyin. Tüpler üç kez ters çevir ve tam solucanlar NR çözüm içinde karıştırın.</li>
		<li>Örnek 2 h için oda sıcaklığında karanlıkta döndürün.</li>
		<li>Kuluçka, solucanlar, 560 x g 1 dk. için santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
		<li>PBST 600 µL ekleyin ve aşırı NR leke kaldırmak 30 dk için karanlıkta örnekleri kuluçkaya.</li>
		<li>560 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi ve tüm yaklaşık 50 µL süpernatant, kaldırın. Not: NR kuluçka ajitasyon gerektirmez. Kurtlardan yerleşme bu adımı sırasında yaygındır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slaytların hazırlanması için mikroskop düşsel<ol>
<li>Solucan Pelet kalan süpernatant resuspend.</li>
		<li>Solucan süspansiyonun 5 µL mikroskop slayt üzerinde yerleştirin ve bir coverslip dikkatli herhangi bir hava kabarcıkları yakalama önlemek için koymak.</li>
		<li>Coverslip tırnak cilası ile solucanlar Imaging önce kapatın.</li>
		<li>Sadece birkaç slayt teker teker hazırlayın. Bu NR görüntüleme örnekler üzerindeki sabit kalır garanti eder. NR lekeli görüntü kalitesini 6 h. ayrık lipid damlacıkları gözlemlemek zor ve arka plan Floresans artar, hangi NR sinyal algılama ile müdahale sonra azalır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR lekeli Worms görüntüleme<ol>
<li>Görüş alanı başına birkaç hayvan yakalamak için 5 X büyütme, solucanlar görüntü.</li>
		<li>Bireysel Worms daha iyi miktar için 10 X büyütme geçin.</li>
		<li>NR lekeli solucanlar görüntü ve miktar için en uygun koşulları belirlemek için farklı pozlama kez denemek için FITC/GFP kanal kullanın.</li>
		<li>Dosyaları sıkıştırma nedeniyle veri kaybını önlemek için TIF biçiminde kaydedin. Not: Tipik pozlama bir en uygun pozlama süresi sahip 100-1000 Bayan arasında değişen zaman, tüm örnekleri için görüntüleme tutarlılığı korumak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR boyama görüntü miktar<ol>
<li>Filmler ImageJ için yükleyin. Eğer belgili tanımlık imge eğe değil tanınan Eklentiler aşağı açılır menüsünden biyo-biçimleri işlevini kullanın.</li>
		<li>Yığın fonksiyonu altında görüntü aşağı açılır menüde resim yığını birkaç Filmler karşılaştırıldığında görüntü yığını oluşturmak için kullanın.</li>
		<li>Aynı aşağı açılır menüde parlaklık/kontrast görüntü yığını olarak ayarlayın ve Uygula tıklayarak tüm görüntüleri değişiklikleri yaymak.</li>
		<li>Her görüntülü solucan betimlemek ve floresan yoğunluğu NR tarafından yayılan ölçmek için Analysis açılan menü altında ölçü işlevini kullanın için Çokgen seçim aracını kullanır.</li>
		<li>Her resim için beş arka plan yerlerde ölçmek ve ortalama arka plan floresan yoğunluğu hesaplayın.</li>
		<li>Arka plan floresan yoğunluğu formül N kullanarak her görüntülü solucan üzerinden çıkarma = G - (A B x), N net Floresan, brüt floresan için G, toplam solucan alan için A ve B için ortalama arka plan Floresans nerede anlamına gelir.</li>
		<li>Floresan yoğunluğu solucan boyutuna göre normalize etmek her solucan'ın net Floresans Rumeli tarafından bölün. Sonuçlar floresan yoğunluğu, rasgele birimleri (yapıyordum), piksel başına olarak rapor edilir. Not: resimleri JPEG formatında dışa aktarma kaçının. Sıkıştırma dosyaları depolamak için daha kolay yönetilebilir yapar iken, veri bütünlüğü bu biçim tarafından güvenilir değil. Tüm görüntüleri değiştirilmiş ve aynı şekilde analiz emin olun. Düzgün farklı büyüklüklerde boyutta değerlendirmek için bir ölçek çubuğu eklemeyi unutmayın. ImageJ kullanarak floresan yoğunluğu farklılıkları daha iyi görselleştirmek için 8-bit RGB görüntü türünden geçiş ve yangın görüntü arama tabloları (LUT) menüsünden seçin. Bu artan hangi renk parlaklığı artmış floresan yoğunluğu ile ilişkili olan bir ısı haritası görüntü oluşturur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. yağ kırmızı O (ORO) lipidler boyama
<ol><li>ORO hisse senedi çözüm hazırlanması<ol>
<li>250 mL şişe ORO toz 500 mg 100 mL % 100 isopropanol ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
		<li>Bir kez hazırlanan, hiçbir ışık pozlama ile sıkı kapalı çözüm saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ORO çalışma çözüm hazırlanması<ol>
<li>Su (3:2) için % 60 isopropanol ORO hisse senedi çözümde sulandırmak.</li>
		<li>Kullanmadan önce çalışan ORO çözüm 0.2 µm selüloz asetat steril enjektör filtre ile filtre. Not: En iyi çözüm kalite için çalışan ORO çözüm önceki gün hazırlamak ve gecede karışımı sağlar. Ancak, çözüm gerekli aynı gün ise seyreltik ve ORO çözüm üzerinde bir rocker kullanmadan önce en az 2 h için karıştırın. Sallanan önce parafin kaseti ORO çözüm kaçağı önlemek için konik tüp sarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanlar ORO lipid boyama için hazırlanması<ol>
<li>20 ° C'de solucanlar nematodunun büyüme orta (NGM) günlük geç OP50 E. coli için istenilen hayat sahne ile seribaşı büyümek.</li>
		<li>1 mL PBST çözeltisi plakasına eklemek ve tüm solucanlar tabağını olana girdap. Plaka eğim ve PBST 1 mL ile yıkayın. Solucan süspansiyon 1.5 mL microfuge tüp aktarın.</li>
		<li>Santrifüj 560 x g 1 dk. de süpernatant Pelet ve çamaşır adım PBST 1 mL ile üç kez tekrar rahatsız etmeden solucanlarını. Tüm süpernatant ama 100 µL kaldırın.</li>
		<li>% 40 isopropanol 600 µL solucan Pelet ekleyin ve 3 dakika oda sıcaklığında salla.</li>
		<li>G 30 s ve Kaldır tüm süpernatant ama 100 µL x 560, solucanlar solucan Pelet aksatmadan santrifüj kapasitesi. Not: Eğer yüksek üretilen iş Boyama yaparken solucanlar plakaları kapalı yıkamak için PBST daha yüksek miktarda kullanın. Solucanlar örnek fiksasyon önce 15 dk içinde PBST daha yıkama yok. Süpernatant bakteri temizlenmez ek yıkama yapın. Kuluçka nutator veya rocker kullanarak % 40 isopropanol içinde yerine getirir. Her zaman tam örnek ajitasyon oluştuğunu emin olmak için tüpler monitör.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipid ORO ile boyama<ol>
<li>600 µL ORO çalışma çözüm her örnek için ekleyin. Tüp üç kez ters çevir ve de ORO de solucan karıştırın.</li>
		<li>Örnekleri için oda sıcaklığında 2 h 30 RPM döndürme.</li>
		<li>560 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi ve tüm süpernatant ama 100 µL ortadan kaldırmak.</li>
		<li>Örnekleri PBST 600 µL içinde resuspend ve tüpler aşırı ORO leke kaldırmak 30 dk 30 RPM döndürün.</li>
		<li>560 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi ve tüm 50 µL süpernatant, ortadan kaldırmak.</li>
		<li>Hayvan germline ve bağırsak hücreleri konumunu daha iyi ayırt etmek için leke çekirdeği 1 µL ekleyerek (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indol-6-carboxamidine) (DAPI) her 1 mL ORO çalışma çözeltisi için. Slayt görüntüleme için montaj öncesinde DAPI ekleyerek 2 h için ORO boyama dışarı taşımak. Bağırsak çekirdek boyutu daha büyük ve erbezi gelişmekte olan germ hücreleri tarafından ayırt edilir. Not: boyama ORO sonra solucan microfuge tüp taraf için uygun ve göze çarpan bir Pelet oluşturmak başarısız. Bu durumda, solucanlar tekrar santrifüj kapasitesi ve solucanlar yerçekimi tarafından en az 10 dakikadır yerleşmek izin vermeyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging solucan için slaytların hazırlanması<ol>
<li>Solucanlar kalan süpernatant içinde resuspend ve çözüm karıştırın.</li>
		<li>Solucan süspansiyonun 5 µL mikroskop slayt üzerinde koymak ve bir coverslip dikkatle, havasız formu kabarcıklar sağlanması yer.</li>
		<li>Coverslip tırnak cilası ve görüntü solucanlar ile kapatın. Not: sabitleme ve boyama sonra solucanlar çok sert ve pipet zor olabilir. Bu sorunu çözecek, onların ipuçları keserek wide-geçişli Pipetler olun.</li>
		<li>Hemen boyama sonra görüntüleme değil Eğer bir mikro-santrifüj raf için en fazla 24 Saat 4 ° C'de slaytları saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ORO lekeli Worms görüntüleme<ol>
<li>Bir renk özellikli kamera görüntü ORO lekeli solucanlar için kullanın.</li>
		<li>5 X büyütme bir görüş alanı içinde çeşitli solucanları görüntü için kullanın.</li>
		<li>Bireysel solucanlar daha iyi incelenmesi için 10 X büyütme geçin.</li>
		<li>Sıkıştırma nedeniyle veri kaybını önlemek için TIF biçimdeki görüntüleri dışa aktarın. Not: boyama ORO + DAPI, renk özellikli kamera Floresans yakalayabilir bir geçiş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Worms ORO lekeli görüntü analizi<ol>
<li>Micrograph(s) ImageJ için yükleyin. Eğer belgili tanımlık imge eğe değil tanınan Eklentiler aşağı açılır menüsünden biyo-biçimleri işlevini kullanın.</li>
		<li>Yığın fonksiyonu altında görüntü aşağı açılır menüde resim yığını birkaç Filmler karşılaştırıldığında görüntü yığını oluşturmak için kullanın.</li>
		<li>Parlaklık/Kontrast lipid damlacıkları görünürlüğünü artırmak için aynı açılan menü altında ayarlayın.</li>
		<li>Görüntüleri lipid birikimi hayvanın vücut boyunca veya belirli dokulara göre kategorize.</li>
		<li>Lipid yerelleştirme daha iyi değerlendirilmesi ve belirsiz görüntü eserler ImageJ kullanarak tanımlanması için görüntü aşağı açılır menüsünden renk işlevi seçin ve yığın RGB sinyalleri her RGB bileşeninin göstermek için tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+red%3A+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li>
<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).</li>
<li>Horobin, R. W., Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorobin%2C+RW+%22Conn%27s+biological+stains%3A+a+handbook+of+dyes%2C+stains+and+fluorochromes+for+use+in+biology+and+medicine%22">Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine</a>. , BIOS Scientific Publishers. (2002).</li>
<li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+the+worm%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li>
<li>Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+for+mafr-1+in+reproduction+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis.</a> Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).</li>
<li>Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+and-6+fatty+acids+allocate+somatic+and+germline+lipids+to+ensure+fitness+during+nutrient+and+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).</li>
<li>Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1+and+Nrf2+couples+proline+catabolism+with+lipid+metabolism+during+nutrient+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
<li>Saltiel, A. R., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signalling+and+the+regulation+of+glucose+and+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism.</a> Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).</li>
<li>Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+lipidome%3A+A+primer+for+lipid+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).</li>
<li>Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+fat+storage+quantitation+in+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+label+and+label-free+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods.</a> PloS One. 5 (9), e12810(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+and+functional+study+of+lipid+metabolic+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 14 (1), 164(2013).</li>
<li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-stokes+Raman+Scattering+%28CARS%29+and+Stimulated+Raman+Scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li>
<li>Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Obezite ve metabolik hastalık oranları artış C. elegans hücre ve dokuların yağ birikimi düzenleyen mekanizmalar çalışmaya uygun bir model haline getirir. Son kanıtlar lipid düzeyleri değişiklikleri8, hormon reseptörleri2, üreme çıktı5aktivasyonu sinyal insülin arasında değişen hücresel süreçleri ile ilişkili gösteriyor. Etiket içermeyen mikroskobu ve Nil kırmızı ve petrol Kromatografi yöntemleri ile karşılaştırıldığında kırmızı O solucan nöt...

Lipidler yaşam için gerekli. Membranlar ayrılmaz bileşeni vardır, ikincil haberci hareket ve güç çeviriciler sinyal ve enerji depolama alanında çok önemli işlevlere sahiptir. Lipid metabolizma dysregulated olduğunda, obezite ve tip II diyabet, halk sağlığı sorunları9tuşuna basarak gibi hastalıklara yol açar. Caenorhabditis elegans (C. elegans) hangi nispeten kısa bir yaşam döngüsü, şeffaf bir beden, bilinen hücre soy ve tam sıralı genom olduğundan lipid metabolizma çalışmaya bir mükemmel model organizmadır. Öncelikle bir hermafrodit, C. elegans araştırmacılar isogenic hayvanlar çok sayıda kısa süreler metabolik genler ve yollar4geniş bir dizi çalışmaya carryout yüksek üretilen iş ileri genetik filtrelerine yükseltmek için izin verir. Bu yaklaşım koruma genlerdeki 273 C. elegans lipid metabolizma insanlar, fare, sıçan ve drosophila arasında yüksek derecede ortaya koymuştur. Ayrıca, metabolik sendrom11' e ilgisi olmayan hastalıklar ile ilişkili olan insan orthologues C. elegans 300'den fazla lipid genlerinde var. Geleneksel olarak, lipid depolama incelenmesi C. elegans içinde çoğunlukla lipid birikimi hakkında sağlam bilgi boya etiketli deneyleri üzerinde güvendi. Daha az ortak bir nerede lipidler yerelleştirilmesine ve lipid bereket ölçülen farklılıkları dokular arasında açıklamasıdır. Ancak, son iş lipid dağıtım olarak lipid birikimi6önemli olabilir ortaya koymuştur.
Son zamanlarda, çalışmaları gibi yüksek performanslı sıvı Kromatografi-Kütle spektrometresi (HPLC-MS), Gaz Kromatografi-Kütle spektrometresi (GC-MS) yöntemlerle entegre başlamıştır ve tutarlı anti-Raman saçılması (CARS) mikroskopi adresine stokes eksiklikleri doğrudan lipid özleri, belirli lipid fraksiyonları ve lipid mevduat, sırasıyla10,11içeriğini analiz tarafından leke tabanlı yaklaşımlar. Ayrıca, arabalar mikroskobu Nil kırmızı yalnızca hedef kapalı otomatik floresan organelleri10/ boyama için hayati bir leke yol açar gibi bir sabitleştirici boya kullanımı için kullanıldığında yağ birikimi için bir proxy olarak hizmet verebilir ortaya koymuştur. Ancak, gerekli teknik uzmanlık ve maliyetleri bu Kromatografi ile ilişkili ve mikroskopi yöntemleri bunların kullanımı için birçok araştırma soruları savunulamaz yapabilirsiniz. Bu makalede, biz rahat ve güvenilir bir yöntem bağlamak ve Nil kırmızı kullanarak C. elegans yataklarında tarafsız lipid leke ve lipid bereket bütün hayvanlar ve belirli dokuları ayırt etmek için kırmızı O petrol tartışıyorlar.
Nil, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, kolayca çeşitli organik çözücüler çözülür, ama çoğunlukla suda çözünmeyen bir benzophenoxazone boya kırmızıdır. Trigliserit gibi nötr lipitler leke için mükemmel lysochrome boya kullanılan ya da kolesterol esterleri güçlü bir renk kullandığından de lipidler solubilizes, dokuları çevreleyen ile ihmal edilebilir etkileşim ve çözücü içinde daha az çözünür lipidler. 450-500 ve 520 nm, sırasıyla1uyarma ve emisyon maxima vardır. C. elegans kırmızı lekeli Nil için yeşil Floresans görüntülenirken, ayrık lipid organları bağırsak ve diğer dokuların içinde her iki kümeleri gözlenen olabilir veya eşit dağınık, hayvanın genotip veya deneysel tedavi bağlı olarak 7.
Yağ kırmızı O bir lysochrome, trigliserid ve lipoproteinler leke için kullanılan yağda çözünen boya olduğunu. Azo boya denir, çünkü onun kimyasal yapısı üç aromatik yüzük için bağlı iki azo grubu içerir. Hangi yağlar içinde yüksek oranda çözünür işler iyonize zordur. Leke rengi kırmızı ve onun ışık emilimi en fazla 518 nm 3. C. elegans yağ kırmızı O göstermek farklı dokuların6arasında lipid dağıtım nitel değerlendirilmesi kolaylaştırır hayvanın şeffaf vücut karşı öne kırmızı lipid damlacıkları ile lekeli.

<table><tbody><tr><td>Imager.M2m Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>Floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>ERC5s kamera</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Renk özellikli</td></tr><tr><td>MRm kamera</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Floresan özellikli</td></tr><tr><td>Nil kırmızısı</td><td>Thermo Fisher</td><td>N1142</td><td>Lipid Leke</td></tr><tr><td>Yağı kırmızı O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12989</td><td>Lipid Lekesi</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td>DNA lekesi</td></tr><tr><td>İzopropil Alkol</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td>Fiksatif çözelti</td></tr><tr><td>0.2 ve mikro; m seterile şırınga filtresi</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Selüloz asetat filtre</td></tr><tr><td>Santrifüj 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5428000015</td><td>Santrifüj</td></tr><tr><td>Çalkalayıcı Döner</td><td>Laboratuvarı Quake</td><td>400110Q</td><td>Çalkalayıcı</td></tr><tr><td>Tüp Döndürücü</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td>Döndürücü</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-11-4</td><td>NGM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>NGM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>7786-30-3</td><td>NGM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td>NGM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Teknova</td><td>L9110</td><td>NGM</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3147</td><td>Bakteri üremesi</td></tr></tbody></table>

lipid bolluk ve değerlendirme lipid dağılımı nil kırmızı ve o kırmızı petrol boyama tarafından caenorhabditis elegans miktar

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans hangi lipid metabolizması ve enerji homeostazı çalışmaya bir olağanüstü model organizmadır. Birçok onun lipit genlerin insanlarda korunmuş ve metabolik sendrom veya diğer hastalıklar ile ilişkili. Bu organizma lipid birikimi incelenmesi sabitleştirici boyalar veya etiket içermeyen yöntemleri tarafından yürütülen olabilir. Sabitleştirici lekeleri gibi Nil kırmızı ve kırmızı O petrol ucuz, güvenilir yolu kantitatif lipid düzeyleri ölçmek için ve niteliksel lipid dağıtım dokular arasında sırasıyla gözlemlemek için vardır. Ayrıca, bu lekelerin çeşitli lipid metabolizma genler ve yolları yüksek üretilen iş tarama için izin verir. Ayrıca, hidrofobik doğaları lipid çözünürlük kolaylaştırır, dokuları çevreleyen ile etkileşim azaltır ve ayrılma çözücü içine önler. Bu yöntemler genel lipid içeriğin incelenmesi etkili olmasına rağmen onlar kimyasal bileşimi ve lipid mevduat çeşitliliği hakkında ayrıntılı bilgi vermeyin. Bu amaçlar, GC-MS ve araçların mikroskobu gibi yöntemler etiket içermeyen daha iyi için uygundur, maliyetlerini rağmen.

BZip, cytoprotective transkripsiyon faktörü homoloji memeli NRF2 ile paylaşan ve yağ asidi oksidasyon arabuluculuk göstermiştir SESN-1 dir. Onların yiyecek glikoz konsantrasyonu bağlı olarak yapısal aktif skn-1 gen kurtlarla ne zaman Nil kırmızı7ile lekeli farklı lipid düzeyleri göster. Şekil 1A -c aktif skn-1 hayvanlar lipid düzeyleri artan yol koşullarına maruz gösterir. NR Floresans FITC/GFP kanal ...

Nil sabit Caenorhabditis elegans boyama kırmızı tarafsız lipid mevduat, nicel ölçüm için bir yöntem ise petrol kırmızı O boyama doku arasında lipid dağıtım nitel değerlendirilmesi kolaylaştırır.

Lipid bolluk ve değerlendirme Lipid dağılımı Nil kırmızı ve O kırmızı petrol boyama tarafından Caenorhabditis elegans miktar

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Bu boyama yöntemlerinin genel amacı, hücre içi lipid bolluğunu ölçmek ve farklı dokular arasındaki lipid dağılımını değerlendirmektir. Bu yöntem, lipitlerin genetik ve biyokimyasal olarak nasıl düzenlendiği ve bunun lipid homeostazını hangi hastalık durumuna göre düzenlediği gibi lipid metabolizmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gerçekleştirilmesinin nispeten basit ve ucuz olmasıdır.Nil Kırmızısı lipid boyamasını gerçekleştirmek için, geç log OP50 E.coli ile tohumlanmış Nematod Büyüme Ortamı veya NGM üzerinde plaka kurtları ve solucanları 20 santigrat derecede erken L4 aşamasına kadar büyütün. Solucanları bir milimetre PBST solüsyonu ile yıkayın ve solucan süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın. Solucanları bir dakika boyunca 560 kez yerçekiminde santrifüjleyin.Ardından süpernatanı çıkarın ve E.coli süspansiyondan temizlenene kadar PBST yıkamasını tekrarlayın. Daha sonra, solucan peletine 100 mikrolitre %40 izopropanol veya ORO boyama için %60 ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. İzopropanol ilavesi, boyamadan önce solucanların uygun şekilde geçirgenleşmesi için çok önemlidir.Solucanları bir dakika boyunca 560 kez yerçekiminde santrifüjleyin ve solucan peletini bozmadan süpernatanı çıkarın. Santrifüjleme adımları sırasında ışığa maruz kalmayı en aza indirmek önemlidir. Şimdi karanlıkta, her numuneye 600 mikrolitre önceden hazırlanmış NR çalışma solüsyonu ekleyin.Tüpleri üç kez ters çevirin ve solucanları ve çözeltiyi tamamen karıştırın. Daha sonra numuneyi karanlıkta oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Kuluçka işleminden sonra solucanları santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.Daha sonra 600 mikrolitre PBST ekleyin ve fazla NR lekesini çıkarmak için numuneleri karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Numuneleri daha önce olduğu gibi tekrar döndürdükten sonra, yaklaşık 50 mikrolitre süpernatan hariç hepsini çıkarın ve kalan çözeltide solucan peletini yeniden süspanse edin. Slaytları görüntüleme için hazırlamak için, beş mikrolitre solucan süspansiyonunu bir mikroskop lamına pipetleyin ve herhangi bir hava kabarcığı sıkışmasını önlemek için dikkatlice bir lamel uygulayın.NR lekeli solucanları görüntülemek için FITC GFP kanalını kullanarak ve farklı pozlama sürelerini deneyerek, görüş alanı başına birkaç hayvanı yakalamak için solucanları beş kat büyütmede görüntüleyin. Ardından, tek tek solucanların daha iyi ölçülmesi için 10 kat büyütmeye geçin. Görüntüleri ölçmek için mikrografları ImageJ'ye yükleyin.Görüntü açılır menüsünde, görüntü destesinin parlaklığını, kontrastını ayarlayın ve uygula'yı tıklayarak değişiklikleri tüm görüntülere yayın. Görüntülenen her bir solucanı tanımlamak için çokgen seçim aracını kullanın ve analiz açılır menüsünün altında, NR tarafından yayılan floresan yoğunluğunu nitelendirmek için ölçüm işlevini kullanın. Her görüntü için beş arka plan konumunu ölçün ve ortalama arka plan floresan yoğunluğunu hesaplayın. Her numuneye 600 mikrolitre Yağ Kırmızısı O veya ORO çalışma çözeltisi ekleyin ve solucanları ve ORO'yu iyice karıştırmak için tüpü üç kez ters çevirin.Örnekleri 30 RPM'de döndürün ve iki saat boyunca RT'ye alın. Numuneleri bir dakika boyunca 560 kez yerçekiminde santrifüjleyin ve 100 mikrolitre hariç tüm süpernatanı aspire edin. Daha sonra numuneleri yeniden süspanse etmek için 600 mikrolitre PBST kullanın ve fazla ORO lekesini çıkarmak için tüpleri 30 dakika boyunca 30 RPM'de döndürün.Hayvanların germ hattının bağırsak hücrelerindeki yerini daha iyi ayırt etmek için, her bir mililitre ORO çalışma çözeltisi için bir mikrolitre DAPI ekleyerek çekirdekleri boyayın. Daha sonra görüntüleme için slaytlar hazırlamak için, solucanları ve kalan süpernatanı yeniden süspanse edin ve çözeltiyi iyice karıştırın. Bir mikroskop lamına beş mikrolitre solucan süspansiyonu koyun ve hava kabarcığı oluşmadığından emin olmak için dikkatlice bir lamel uygulayın.ORO lekeli solucanları görüntülemek için, bir görüş alanında birkaç solucanı görüntülemek için beş kat büyütmede renk özellikli bir kamera kullanın. Ardından, tek tek solucanların daha iyi incelenmesi için 10 kat büyütmeye geçin. Son olarak, görüntüleri ImageJ'e yükledikten ve metin protokolüne göre bir görüntü destesi oluşturduktan sonra, görüntüleri hayvanın vücudundaki veya belirli dokulardaki lipit birikimine göre kategorilere ayırın.SKN-1, memeli Nrf2 ile homolojiyi paylaşır ve yağ asidi oksidasyonuna aracılık ettiği gösterilmiştir. Bu şekil, lipid seviyelerinin artmasına neden olan koşullara maruz kalan aktive edilmiş SKN-1 hayvanlarını göstermektedir. Bu görüntülerde görüldüğü gibi, FITC GFP kanalı kullanılarak yakalanan NR floresansı bağırsak boyunca belirgindir, ancak baş, kuyruk ve bağırsak lümeninde daha sönüktür.Solucanları Yaşa Bağlı Somatik Yağ Tükenmesi veya ASDF'nin varlığına veya yokluğuna göre kategorize etmek kolay olsa da, orta düzeyde yağ kaybı olan hayvanları tanımlamak zor olabilir. Az sayıda yarı saydam alana sahip vücut boyunca parlak kırmızı lekelenme gösteren ASDF olmayan hayvanlarla karşılaştırıldığında, ASDF solucanları bağırsak hücrelerinde gözle görülür yağ tükenmesi gösterir. ASDF geliştirme sürecindeki hayvanlar genellikle yağ kaybının çoğunun meydana geldiği yarı saydam noktalar gösterir.Ayrıca, ASDF solucanları baş ve kuyruk bölgelerinde hala parlak kırmızı lekelenmeye sahip olabilir, çünkü fenotip tam somatik yağ kaybı ile değil, yaşlanmamış hayvanlara göre geniş yağ tükenmesi ile tanımlanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat artı görüntüleme süresinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, boyamadan en fazla 30 dakika önce solucanları yıkamayı ve geçirgen hale getirmeyi unutmamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, her bir teknolojinin tanımladığı lipit türlerinin türünü karşılaştırmak ve belirli soru türleri için hangi yöntemin daha uygun olduğunu belirlemek için CARS mikroskobu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, Nil Kırmızısı ve Yağ Kırmızısı O boyaması ve ardından ImageJ mikrograf analizi kullanarak lipitlerin nasıl ölçüleceğini ve solucanlardaki lipit dağılımının nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

quantification-lipid-abundance-evaluation-lipid-distribution

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, Nil Kırmızısı boyası kullanılarak lipitleri bütün, sabit solucanlar halinde boyamak için bir protokol açıklanmaktadır. Lipid damlacıklarının çekirdeğindeki nötr lipidleri spesifik olarak görüntülemek için, lekeli C. elegans'ın yeşil emisyon spektrumlarını görüntüleyin.

C. elegans'ın Nil Kırmızısı Boyanması: Sabit Hayvanlarda Lipid Damlacıklarını Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Bu video, alg hücrelerindeki nötr lipidleri Nil kırmızısı boyası ile boyayarak tespit etmek ve ölçmek için bir protokol gösterir.

Nil kırmızısı boyama: alglerde hücre içi nötr lipidleri tespit etmek ve ölçmek için bir teknik

Biz eğitim için sağlam biyokimyasal ve mikroskobik yöntemler...

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Bir Nile Red boyama prosedürü kullanılarak alg hücrelerinin nötral lipid içeriğini belirlemek için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu zaman tasarrufu tekniği geleneksel gravimetrik esaslı lipid miktar protokoller için bir alternatif sunuyor. Bu izleme biyoproses performansı belirli bir uygulama için tasarlanmıştır.

Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Burada, lipit damlacılığa özgü floresan boya olan BODIPY 493/503 kullanılarak Drosophila larvalarında oenositlerin diseksiyon ve lipid damlacık boyama sıyrıklarının diseksiyonu ve lipid damlacık boyaması için ayrıntılı yöntemler sunulmuştur.

Drosophila Larvalarında Oenositlerin Diseksiyonu ve Lipid Damlacık Boyaması

Uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskopisi, spesifik kimyasal moieties'in seçici, etiketsiz görüntülenmesini sağlar ve lipit moleküllerini in vivo olarak görüntülemek için etkili bir şekilde sunulmuştır. Burada, SRS mikroskopi prensibine kısa bir giriş sağlıyoruz ve Caenorhabditis elegans'talipid depolama görüntülemede kullanımı için yöntemleri açıklıyoruz.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Mevcut protokol, Caenorhabditis elegans için sıvı ve plaka üstü kültürlerde lipit takviyesi yöntemlerini, uzunlamasına çalışmalar ve toplu veya birkaç solucan ve solucan dokusundan gen transkripsiyonel analizi ile birlikte tanımlamaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Uzun Ömürlülük ve Gen Transkripsiyonel Analizi için Lipid Takviyesi

Burada, karaciğer dokusunda lipid damlacık karakterizasyonu için optimize edilmiş bir BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol gösterilmektedir. Ortogonal projeksiyonların ve 3D rekonstrüksiyonların kullanılmasıyla, florofor mikro-veziküler ve makroveziküler steatoz arasında başarılı bir ayrım yapılmasına izin verir ve hepatik steatoz değerlendirmesi için klasik histolojik protokollere tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil edebilir.

Hepatik Steatoz Değerlendirmesi için Floresan Boyalı Lipit Damlacıklarının 3D Rekonstrüksiyon ile Analizi

Gözün retina pigment epitel tabakasını etkileyen dejeneratif göz hastalıkları monogenik ve poligenik kökenlidir. Çeşitli hastalık modelleri ve bir yazılım uygulaması olan LipidUNet, hastalık mekanizmalarını ve potansiyel terapötik müdahaleleri incelemek için geliştirilmiştir.

LipidUNet-Machine Learning Tabanlı iPSC Kaynaklı Retinal Pigment Epiteli Kullanılarak Lipid Birikintilerinin Karakterizasyonu ve Nicelleştirilmesi Yöntemi

Lipofaji, lipid damlacıklarının bozulmasını içeren seçici bir otofaji şeklidir. Bu süreçteki işlev bozuklukları kanser gelişimi ile ilişkilidir. Bununla birlikte, kesin mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol, otofaji, lipid metabolizması ve kanser ilerlemesi arasındaki etkileşimi daha iyi anlamak için kantitatif görüntüleme yaklaşımlarını açıklar.

Lipofaji Yoluyla Lipid Damlacık Katabolizmasının Düzenlenmesinin Araştırılması

Burada, geniş alan mikroskobu görüntülerinde tek tek solucanların otomatik segmentasyonu için geliştirdiğimiz bir derin öğrenme sistemi olan SegElegans'ın daha sonra ImageJ gibi görüntü analiz yazılımlarında kullanılmak üzere etkin bir şekilde kullanılmasına ilişkin talimatlar sunuyoruz. Sistemi hem çevrimiçi hem de çevrimdışı kullanmanın yollarını sunuyoruz.

SegElegans Kullanarak C. elegans Floresan Görüntülerinin Otomatik Analizi

Öğrenin Caenorhabditis elegans'ta Nile red ve Oil red O boyama ile lipid bolluğunu nicel olarak ölçme ve lipid dağılımını değerlendirme yöntemlerini. Bu basit ve ekonomik teknikler lipid metabolizması araştırmalarında temel oluşturur.

Lipid bolluk ve değerlendirme Lipid dağılımı Nil kırmızı ve O kırmızı petrol boyama tarafından Caenorhabditis elegans miktar

Daha fazla video keşfet