Yanıt koku nöronlar Optogenetic uyarılması olarak Drosophila larva davranışını izlemek
21 Mart 2018
Bu iletişim kuralı Drosophila larva yanıt onun koku nöronlar eşzamanlı optogenetic uyarılması için gezinme davranışını analiz eder. 630 nm dalga boyunda ışık kırmızı kaymıştır kanal rhodopsin ifade bireysel koku nöronlar etkinleştirmek için kullanılır. Larva hareketi aynı anda izlenir, dijital olarak kaydedilmiş ve özel olarak yazılmış yazılım kullanılarak analiz.
Bu metodolojinin genel amacı, koku alma nöronlarının aynı anda optogenetik uyarılmasına yanıt olarak drosophila larvasının seyir davranışını analiz etmektir. Bu yöntem, koku alma devresi fonksiyonunun kapsamlı bir şekilde incelenmesini sağlar ve koku alma devresi fonksiyonunun davranış tepkisine nasıl dönüştüğü üzerine yapılan çalışmaları tamamlar. Bu tekniğin temel avantajı, bireysel koku alma nöronlarını aktive etmek için geleneksel koku gradyanları yerine bir ışık kullanarak özgüllüğü ve zamansal kontrolüdür.
Deneye başlamak için, ışıktan yoksun bir davranış alanı oluşturun. Üç milimetre kalınlığında, siyah renkli pleksiglas akrilik levhalardan yapılmış, 89 x 61 x 66 santimetre boyutlarında bir kutu oluşturun. Kutuyu davranış odasındaki bir masanın üzerine yerleştirin.
Ardından, kara kutunun tavanının ortasına bir IR Longpass 830 nanometre filtre ve sekiz milimetre F1.4 C montaj lensi ile donatılmış tek renkli bir USB 3.0 CCD kamera monte edin. Karanlık arenada larvaları aydınlatmak için masanın üzerine iki kızılötesi LED şeridi yerleştirin. Sonra, bir elde edin 22 santimetre x 22 LED platformunu oluşturmak için santimetre kare alüminyum levha.
Plakanın ortasında, CCD kameranın etrafına sığacak kadar büyük bir delik açmak için metal bir kesici kullanın. Metal plakayı kırmızı LED şerit ışıklarıyla örtün. LED ışık şeridi kablolarını seri olarak lehimleyin ve şerit tellerini bir Raspberry Pi 2B mikroişlemci tarafından kontrol edilen bir optokuplör rölesine besleyin.
Ardından, LED platformunu CCD kameranın etrafına monte edin. Ardından, optokuplör rölesini LED şeritlere bağlamadan önce Raspberry Pi işlemcisine Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux tabanlı bir işletim sistemi kurun ve yapılandırın. LED şeritlere ve optokuplöre güç sağlamak için bir güç kaynağı bağlayın.
Davranış alanında CCD kameranın etrafındaki çeşitli noktalarda homojen bir ışınım olduğundan emin olun. Bir spektrometre yardımıyla arenanın yüzeyindeki mutlak ışınımı sağlayın ve arena yüzeyi boyunca metrekare başına yaklaşık 1,3 watt olarak belirleyin. Sinekleri standart sinek yemi üzerinde 25 santigrat derecede, 12 saatlik, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde% 50 ila 60 bağıl nemde tutun.
CsChrimson'ı tek bir ORN çiftinde ifade etmek için, bakire dişileri bir UAS-IVS-CsChrimson hattından bir ORX-GAL4 hattından erkeklere çaprazlayın. Bir çaprazdaki erkek ve dişi sineklerin 48 saat boyunca çiftleşmesine ve yumurtlamasına izin verildikten sonra, yetişkinleri taze bir şişeye aktarın. Yumurta içeren gıda şişesinin yüzeyine, damıtılmış suda çözülmüş 89 milimolar sükroz içinde dimetil sülfoksit veya DMSO içinde çözünmüş 400 mikromolar all-trans-retinal veya ATR içeren bir karışımın 400 mikrolitre ekleyin.
Yumurta içeren gıda şişelerine ATR eklendikten sonra, şişeleri karanlıkta 72 saat daha inkübe edin. İnkübasyondan sonra, yüksek yoğunluklu% 15 sükroz çözeltisi kullanarak yüzdürerek sinek yeminin yüzeyinden üçüncü instar larvalarını çıkarın. Bir P1000 mikro pipet kullanarak, sakaroz çözeltisinin yüzeyinde yüzen larvaları 1.000 mililitrelik bir cam behere ayırın.
Her seferinde cam beherde 800 mililitre taze damıtılmış su değiştirerek larvaları dört kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, larvaları davranış testine tabi tutmadan önce 10 dakika dinlenmeye bırakın. Davranış tahlili için, davranış odasında tutarlı bir sıcaklık ve nem sağlayın.
150 mililitre erimiş% 1.5 agarozu 22 santimetreye 22 santimetre karelik bir Petri kabına dökerek larva tarama ortamını hazırlayın. Davranış tahlilinde kullanmadan önce agarozun Petri kaplarında bir ila iki saat katılaşmasına ve soğumasına izin verin. Agaroz katılaştıktan sonra, hazırlanmış üçüncü instar larvalarının 20'den fazlasını Petri kabının ortasına aktarın ve Petri kabını kapağıyla kapatın.
Petri kabını CCD kameranın altındaki davranış alanına yerleştirin. Videodaki larvaları görselleştirmek için 850 nanometre kızılötesi LED ışık kaynağını açın. Larva hareketini kaydetmek için CCD kamerayı başlatın.
Son olarak, veri işleme ve analizine geçin. CsChrimson'u eksprese eden ORN 7a ışıkla uyarıldığında, kontrol hayvanlarına kıyasla çalışma uzunluğunda önemli bir azalma oldu. Tersine, CsChrimson'u ifade eden ORN 42a ışıkla uyarıldığında, kontrol hayvanlarına kıyasla çalışma uzunluğunda önemli bir artış oldu.
ORN 42a için, farklı zamansal ışık stimülasyon modellerinin farklı davranışsal tepkiler ortaya çıkardığını bulduk. Bu yöntemi birinci dereceden koku alma reseptör nöronları için göstermiş olsak da, yöntemimiz aynı zamanda projeksiyon nöronları ve yerel nöronlar gibi aşağı akış nöronlarının larva davranışı üzerindeki etkisini ölçmek gibi gelecekteki çeşitli uygulamalara da izin verir. Bu tekniğin, larva koku alma devresi fonksiyonunun kapsamlı bir diseksiyonunun önünü açmasını bekliyoruz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, koku nöronlarının eş zamanlı optogenetik stimülasyonuna yanıt olarak Drosophila larvasının navigasyon davranışını analiz etmektedir. Kırmızıya kaydırılmış bir kanal rodopsini eksprese eden spesifik koku nöronlarını aktive etmek için 630 nm dalga boyunda bir ışık kullanarak, koku devresi fonksiyonunun ve davranışsal yanıtın ayrıntılı çalışmalarına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Davranışsal Nörobilim
- Optogenetik
- Drosophila Genetiği
Arka Plan
- Bu metodoloji, koku alma devresi fonksiyonunun davranışsal tepkilerle nasıl ilişkili olduğunun araştırılmasına olanak tanır.
- Geleneksel koku gradyanları yerine ışık kullanarak aktivasyon üzerinde zamansal kontrol sağlar.
- Bu yaklaşım, Drosophila koku alma sistemindeki spesifik nöronların incelenmesini kolaylaştırır.
Çalışmanın Amacı
- Koku devrelerinin işlevini hassasiyetle analiz etmek.
- Hedeflenmiş nöronal stimülasyona karşı larval davranışsal tepkileri gözlemlemek.
- Bireysel koku nöronlarının navigasyonel seçimleri nasıl etkilediğine dair içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışmada, larval hareket analizleri için özel olarak tasarlanmış bir davranış arenası kullanılmaktadır.
- Koku reseptör nöronlarında (ORN'ler) CsChrimson eksprese eden Drosophila larvaları ışıkla stimüle edilmiştir.
- Davranışsal analiz, agaroz sürünme ortamının hazırlanmasını ve larval hareketlerin video kaydını içerir.
- Önemli adımlar arasında arenanın kurulması, ekipmanın monte edilmesi ve larvaların spesifik koşullar altında hazırlanması yer almaktadır.
Ana Sonuçlar
- Belirli koku reseptör nöronlarının ışıkla uyarılması, larva yürüme uzunluğunda önemli varyasyonlara yol açarak farklı davranışsal tepkileri ortaya koymuştur.
- Uyarılmanın farklı zamansal paternleri, navigasyon davranışı üzerinde farklı etkiler oluşturmuştur.
- Bu yöntem, downstream nöronal etkilerin larva davranışı üzerindeki gelecekteki araştırmalarını kolaylaştırmaya hazırdır.
Sonuçlar
- Çalışma, koku alma devrelerini ve bunların davranışsal etkilerini analiz etmek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.
- Araştırmacıların, canlı bir organizma bağlamında hedeflenen nöronların spesifik rollerini incelemesine olanak tanır.
- Bu bulgular, duyusal işleme ve davranışta nöronal mekanizmalara dair anlayışımızı geliştirmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu yöntem, koku uyaranlarını optogenetik kontrolle değiştirerek koku devresi fonksiyonunun hassas bir şekilde analiz edilmesini sağlar ve davranışsal çıktıların belirli nöronal aktivitelerle ilişkilendirilmesi gereken hedef doğrulamadaki temel bir zorluğa çözüm sunar. Bireysel koku reseptör nöronlarının navigasyon davranışına olan katkısını izole ederek erken keşif aşamasındaki mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler ve hedef seçimindeki öngörülebilirlik güvenini artırır. Bu yaklaşım, moleküler hedeften devre düzeyindeki fenotipe geçişteki translasyonel sürekliliği geliştirerek, nörobilim odaklı keşif programlarındaki hedeflerin risklerini azaltmak için önem taşır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Belirli olfaktör nöron aktivasyonunu tanımlanmış davranışsal çıktılarla ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Işık tabanlı stimülasyon kullanarak nöronal hedeflerin fonksiyonel doğrulaması için tekrarlanabilir bir sistem sağlar.
- Bilimsel Değer: Larval navigasyon davranışındaki rollerini açıklığa kavuşturmak için bireysel ORN'lerin izole manipülasyonu aracılığıyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Nöronal modülasyon etkilerinin standartlaştırılmış değerlendirmesine olanak tanıyan kantitatif davranışsal çıktılar (örneğin, koşu uzunluğu değişiklikleri) üretir.
- Operasyonel Değer: Olfaktör devre fonksiyonlarının genetik veya farmakolojik modülatörlerinin taranması için ölçeklenebilir bir analiz platformu kurar.
- Bilimsel Değer: Optogenetik stimülasyon aracılığıyla kokulu maddelerin uçuculuğunu ve iletim değişkenliğini ortadan kaldırarak analiz standartlaştırmasını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Genetik olarak yönetilebilir bir organizmada duyusal girdi-davranış çevriminin analizine olanak tanıyarak hastalıkla ilişkili sistem modellemesini destekler.
- Operasyonel Değer: Memeli doğrulaması öncesinde nöronal hedef etkilerinin davranış üzerindeki etkilerini değerlendirmek için preklinik uyumlu bir iş akışı sağlar.
- Bilimsel Değer: Üst akış nöronal aktivitenin alt akış davranışsal fenotiplere nasıl dönüştüğünü netleştirerek mekanistik risk azaltmaya olanak tanır.
Süreç ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, davranışsal fenotipleme yoluyla hedef doğrulamasını destekleyerek ve ölçülebilir çıktıları yönlendiren nöronal hedefleri netleştirerek öncü bileşik tanımlama sürecine bilgi sağlayarak, erken keşif sürecinin bir parçası olarak yer alır.
- Keşif Biyolojisi: Larval navigasyon davranışını yönlendiren bireysel olfaktör nöron fonksiyonunun hipotez testlerini yapmayı sağlar.
- Tarama: Bileşik veya genetik modülatör değerlendirmesine uygun, kantitatif ve tekrarlanabilir davranışsal metrikler (koşu uzunluğu) sunar.
- Analitikler: İzlenebilir davranışsal çıktılar ve uyarılmış koşullar ile kontrol koşulları arasında istatistiksel karşılaştırmalar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Nöronal devre aktivitesini davranışsal yanıtlarla ilişkilendirerek, daha yüksek mertebeli modellere ekstrapolasyonu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Olfaktör ve diğer duyusal devrelerdeki nöronal hedeflerin sistematik sorgulanması için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nöronal aktivasyon ile davranışsal sonuçlar arasındaki bağlantıdaki belirsizliği azaltarak öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Değişken koku stimülasyonlarının yerini alan optogenetik kontrol sayesinde tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Hedefler ve davranışsal fenotipler arasında daha net mekanistik bağlantılar sağlayarak git/gitme (go/no-go) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Keşifle ilgili bir sistemde valide edilmiş davranışsal etkiye dayalı olarak, riskten arındırılmış hedef önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Drosophila genetiği, optogenetik ve davranışsal deney tasarımı konularında uzmanlık gerektirir.
- Davranış arenası, IR aydınlatma, CCD kamera ve Raspberry Pi tabanlı stimülasyon kontrolü dahil olmak üzere özel cihazlara bağımlıdır.
- Larva hazırlama, agaroz ortam hazırlama ve video takip protokolleri için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Farklı nöron tiplerine (örneğin, projeksiyon nöronları, lokal nöronlar) veya gelişim evrelerine genişletilirken adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Model sistemdeki genetik erişilebilirlik ve retinal besleme ihtiyacı ile sınırlıdır; bu durum, Drosophila dışındaki sistemlere ölçeklenebilirliği kısıtlayabilir.
