Yanıt koku nöronlar Optogenetic uyarılması olarak Drosophila larva davranışını izlemek

Bu metodolojinin genel amacı, koku alma nöronlarının aynı anda optogenetik uyarılmasına yanıt olarak drosophila larvasının seyir davranışını analiz etmektir. Bu yöntem, koku alma devresi fonksiyonunun kapsamlı bir şekilde incelenmesini sağlar ve koku alma devresi fonksiyonunun davranış tepkisine nasıl dönüştüğü üzerine yapılan çalışmaları tamamlar. Bu tekniğin temel avantajı, bireysel koku alma nöronlarını aktive etmek için geleneksel koku gradyanları yerine bir ışık kullanarak özgüllüğü ve zamansal kontrolüdür.

Deneye başlamak için, ışıktan yoksun bir davranış alanı oluşturun. Üç milimetre kalınlığında, siyah renkli pleksiglas akrilik levhalardan yapılmış, 89 x 61 x 66 santimetre boyutlarında bir kutu oluşturun. Kutuyu davranış odasındaki bir masanın üzerine yerleştirin.

Ardından, kara kutunun tavanının ortasına bir IR Longpass 830 nanometre filtre ve sekiz milimetre F1.4 C montaj lensi ile donatılmış tek renkli bir USB 3.0 CCD kamera monte edin. Karanlık arenada larvaları aydınlatmak için masanın üzerine iki kızılötesi LED şeridi yerleştirin. Sonra, bir elde edin 22 santimetre x 22 LED platformunu oluşturmak için santimetre kare alüminyum levha.

Plakanın ortasında, CCD kameranın etrafına sığacak kadar büyük bir delik açmak için metal bir kesici kullanın. Metal plakayı kırmızı LED şerit ışıklarıyla örtün. LED ışık şeridi kablolarını seri olarak lehimleyin ve şerit tellerini bir Raspberry Pi 2B mikroişlemci tarafından kontrol edilen bir optokuplör rölesine besleyin.

Ardından, LED platformunu CCD kameranın etrafına monte edin. Ardından, optokuplör rölesini LED şeritlere bağlamadan önce Raspberry Pi işlemcisine Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux tabanlı bir işletim sistemi kurun ve yapılandırın. LED şeritlere ve optokuplöre güç sağlamak için bir güç kaynağı bağlayın.

Davranış alanında CCD kameranın etrafındaki çeşitli noktalarda homojen bir ışınım olduğundan emin olun. Bir spektrometre yardımıyla arenanın yüzeyindeki mutlak ışınımı sağlayın ve arena yüzeyi boyunca metrekare başına yaklaşık 1,3 watt olarak belirleyin. Sinekleri standart sinek yemi üzerinde 25 santigrat derecede, 12 saatlik, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde% 50 ila 60 bağıl nemde tutun.

CsChrimson'ı tek bir ORN çiftinde ifade etmek için, bakire dişileri bir UAS-IVS-CsChrimson hattından bir ORX-GAL4 hattından erkeklere çaprazlayın. Bir çaprazdaki erkek ve dişi sineklerin 48 saat boyunca çiftleşmesine ve yumurtlamasına izin verildikten sonra, yetişkinleri taze bir şişeye aktarın. Yumurta içeren gıda şişesinin yüzeyine, damıtılmış suda çözülmüş 89 milimolar sükroz içinde dimetil sülfoksit veya DMSO içinde çözünmüş 400 mikromolar all-trans-retinal veya ATR içeren bir karışımın 400 mikrolitre ekleyin.

Yumurta içeren gıda şişelerine ATR eklendikten sonra, şişeleri karanlıkta 72 saat daha inkübe edin. İnkübasyondan sonra, yüksek yoğunluklu% 15 sükroz çözeltisi kullanarak yüzdürerek sinek yeminin yüzeyinden üçüncü instar larvalarını çıkarın. Bir P1000 mikro pipet kullanarak, sakaroz çözeltisinin yüzeyinde yüzen larvaları 1.000 mililitrelik bir cam behere ayırın.

Her seferinde cam beherde 800 mililitre taze damıtılmış su değiştirerek larvaları dört kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, larvaları davranış testine tabi tutmadan önce 10 dakika dinlenmeye bırakın. Davranış tahlili için, davranış odasında tutarlı bir sıcaklık ve nem sağlayın.

150 mililitre erimiş% 1.5 agarozu 22 santimetreye 22 santimetre karelik bir Petri kabına dökerek larva tarama ortamını hazırlayın. Davranış tahlilinde kullanmadan önce agarozun Petri kaplarında bir ila iki saat katılaşmasına ve soğumasına izin verin. Agaroz katılaştıktan sonra, hazırlanmış üçüncü instar larvalarının 20'den fazlasını Petri kabının ortasına aktarın ve Petri kabını kapağıyla kapatın.

Petri kabını CCD kameranın altındaki davranış alanına yerleştirin. Videodaki larvaları görselleştirmek için 850 nanometre kızılötesi LED ışık kaynağını açın. Larva hareketini kaydetmek için CCD kamerayı başlatın.

Son olarak, veri işleme ve analizine geçin. CsChrimson'u eksprese eden ORN 7a ışıkla uyarıldığında, kontrol hayvanlarına kıyasla çalışma uzunluğunda önemli bir azalma oldu. Tersine, CsChrimson'u ifade eden ORN 42a ışıkla uyarıldığında, kontrol hayvanlarına kıyasla çalışma uzunluğunda önemli bir artış oldu.

ORN 42a için, farklı zamansal ışık stimülasyon modellerinin farklı davranışsal tepkiler ortaya çıkardığını bulduk. Bu yöntemi birinci dereceden koku alma reseptör nöronları için göstermiş olsak da, yöntemimiz aynı zamanda projeksiyon nöronları ve yerel nöronlar gibi aşağı akış nöronlarının larva davranışı üzerindeki etkisini ölçmek gibi gelecekteki çeşitli uygulamalara da izin verir. Bu tekniğin, larva koku alma devresi fonksiyonunun kapsamlı bir diseksiyonunun önünü açmasını bekliyoruz.