Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Bu yöntem, araştırmacıların gelişimsel immünoloji alanındaki temel soruları yanıtlamak için yeterli sayıda hücre tipi elde etmelerini sağlayabilir. Bu tekniğin ana avantajı, geleneksel olarak ex vivo olarak düşük sayılarda bulunan çok sayıda hücreyi izole etmek için birkaç seçilmiş işaretleyiciye dayanmasıdır. Bu tekniğin anlamı, terapötik kemik iliği transplantasyonuna kadar uzanır, çünkü çok sayıda progenitörün izolasyonuna izin verir.

Protokole başlamak için, önceden hazırlanmış bir farenin arka bacaklarını ve gövdesini %75 etanol ile doyurun ve kavisli doku makası ile kalça eklemi etrafındaki deriden sığ kesimler yapın. Ardından arka ayakları çıkarın ve soyun. Forseps kullanarak, cildi kalçadan ayak bileğine doğru sıkıca çekin, kası ortaya çıkarın ve cilt flebini çıkarmak için makas kullanın.

Femur ve kalça ekleminin hemen üstünden kesin ve kemiği keserek tüm arka bacağını çıkarın. Steril bir biyogüvenlik kabininde çalışarak, bacakları önceden hazırlanmış petri kaplarından birine aktarın. Ayak bileğinin hemen altını kesmek için makas kullanın ve mümkün olduğunca çok kas ve elastik bağ dokusunu dikkatlice çıkarın.

Temizlenmiş kemiği hazırlanan ikinci petri kabına aktarın. Ardından, uyluk kemiğini, dizini ve tibiayı ayırın. Forseps kullanarak bacağınızı dizden tutun ve uyluk kemiğinin üst kısmındaki kemik boşluğunun içinde ve kaval kemiğinin sonuna doğru soluk kırmızı bir çizgi olan iliği bulun.

Makasla, kemik iliğinin bittiği yerin hemen üstündeki kaval kemiğini kesin. Diz ekleminin hemen altından kesin, diz ekleminin hemen üstünden kesin. Ardından, femur ve tibiadan kemik iliğini temizleyin.

10 mililitrelik bir şırıngayı 50 mililitrelik konik tüpten tam ortamla doldurun ve şırıngayı 23 gauge iğne ile kapatın. Kemiği forseps ile hazırlanan üçüncü petri kabının üzerinde tutarak, iğneyi kemik kanalına sokun ve ortamı iterek hücreleri dışarı atın. Kemikte daha fazla renk görünmeyene kadar bu adımı tekrarlayın.

Epifizi ezerek işleme devam edin. Hala ikinci petri kabındayken, diz kapağını forseps ile sıkıca tutun ve dizleri şırınganın ucuyla ezin. Epifiz artık kırmızı olmayana kadar devam edin.

Şırıngayı kullanarak, hücreleri ikinci ve üçüncü petri kaplarından 50 mililitrelik tüpe aktarın. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek kümeleri ayırın ve kabarcık oluşturmamaya çalışın. Hücreleri santrifüjleyin.

Daha sonra süpernatanı serolojik pipetle çıkarın, peleti fiske vurarak yerinden çıkarın ve kırmızı kan hücrelerini oda sıcaklığında bir dakika boyunca bir mililitre amonyum klorür potasyum veya ACK lizis tamponunda inkübe ederek parçalayın. Serolojik bir pipet kullanarak 40 mililitre HBSS tamponu ekleyin. Serolojik bir pipet kullanarak, hücreleri 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe süzün ve hücreleri santrifüjleyin.

Serolojik bir pipet kullanarak, süpernatanı çıkarın ve kemik iliği hücrelerini, mililitre başına 10 nanogram Rekombinant Fare GM-CSF ile mililitre başına 10 ila 6. hücrelerin bir katı yoğunlukta tam ortamda kültürleyin. Serolojik bir pipet kullanarak, hücreleri doku kültürü plakalarına aktarın ve boyamaya devam etmeye hazır olana kadar% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Nazikçe, ama iyice, gevşek bir şekilde yapışan hücreleri çıkarmak için hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyin.

Serolojik bir pipet kullanarak, hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleyin. Süpernatanı nazikçe dökün ve serolojik pipet ile 30 mililitre FACS yıkama tamponu veya SFWB ekleyerek peletlenmiş hücreleri yıkayın. Daha sonra hücreleri santrifüjleyin ve yıkamayı tekrarlayın.

Ardından, antikor üreticisinin talimatlarına göre hücreleri askıya alın ve boyayın. Bir mililitre FWB'de 10 ila 7. hücrelere beş kez yeniden süspanse edin ve floroforlarla etiketlenmiş iki mikrogram anti Ly-6C ve anti CD115 ekleyin. CMP'yi MODC'den daha fazla ayırt etmek için iki mikrogram anti CD11C antikoru ekleyin.

Numuneleri buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 10 mililitre FWB eklemek için serolojik bir pipet kullanın ve hücreleri santrifüjleyin. Süpernatanı nazikçe dökün ve peletlenmiş hücreleri serolojik bir pipetle 30 mililitre FWB ekleyerek yıkayın.

Hücreleri santrifüjleyin ve yıkamayı tekrarlayın. Hücreleri askıya almadan önce, peleti çıkarmak için tüpü iyice hafifçe vurun. Hücreleri mililitre FWB başına 10 ila 7. hücrelerde yeniden süspanse etmek için serolojik bir pipet kullanın ve bunları 35 mikrometrelik bir hücre filtresinden süzün.

Filtrelenmiş hücreleri bir polipropilen tüpe aktarmak için serolojik bir pipet kullanın ve tüpü sıralanmaya hazır olana kadar buzun üzerine yerleştirin. Lekesiz kontrolü hücre sıralayıcıdan geçirin ve küçük döküntüleri ve yüksek taneli parçacıkları dışlamak için bir kapı uygulayın. Tek floresan kontrol örneklerini hücre sıralayıcıdan geçirin ve telafiyi gerektiği gibi ayarlayın.

Çok etiketli örneğin bir örneğini çalıştırın ve dört farklı popülasyonu gözlemleyin. Dört ana popülasyonun her birini izole etmek için bir kapı uygulayın. Dolduğunda en az %20 nihai konsantrasyon elde etmek için yeterli miktarda fetal baldır serumu veya FCS ekleyerek toplama tüplerini hazırlayın.

Örneğin, beş mililitrelik tüpler kullanılıyorsa, sıralamadan önce bir mililitre FCS ekleyin ve toplam beş mililitre hacme ulaştığında tüpü çıkarın. Membran yenilenmesini ve antikor alımını önlemek için, tüm numuneleri sıralama boyunca dört santigrat derecede tutun. İstenilen sayıda hücre toplandıktan sonra, hücreleri yeni bir konik tüpe aktarmak için serolojik bir pipet kullanın ve hücreleri santrifüjleyin.

Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri 10 mililitre FWB'de yeniden süspanse edin ve hücreleri tekrar santrifüjleyin. FWB süspansiyonunu toplam iki yıkama için tekrarlayın. Son olarak, ikinci yıkamadan sonra süpernatanı çıkarın ve deneyin tasarımına göre devam edin.

Analiz için mümkün olduğunca çok kanalı kullanılabilir durumda tutmak için, çok küçük ve çok ayrıntılı olaylar hariç olmak üzere, ileri ve yan saçılmaya dayalı olarak canlı hücreler rutin olarak seçildi. Bu geçit stratejisinin ölü hücreleri güvenilir bir şekilde dışlayıp dışlamadığını belirlemek için, numuneler 7-Aminoaktinomisin D ile boyandı. Hasattan hemen sonra analiz edilen hücreler, kemik iliğinden taze izole edilmiş hücrelere tipik bir FSC, SSC kapısı uygulandığında, 7-AAD pozitif hücrelerin yaklaşık% 10'una sahipti. Ölü hücrelerin benzer bir oranı, kültürün 1. ve 3. kalışında da mevcuttu.

Beşinci günde, kapı içindeki ölü hücrelerin sayısı %5'e düşürüldü, bu nedenle, böyle bir canlılık kapısının kullanılması genellikle beşinci gün ve sonrasında sıralama için uygundur. Akış sitometrisi, Ly6C negatif, CD115 popülasyonu, CD3, CD45R pozitif hücrelerin sıfırdan üçüncü güne kadar güçlü bir şekilde devam ettiğini ortaya koydu. Dördüncü günde, sadece birkaç CD3, CD45R pozitif hücre kaldı ve beşinci ve altıncı günlerde, CD3, CD45R eksprese eden hücreler yoktu; bu nedenle, GM-CSF'de kültürden sonraki dört gün içinde, soy pozitif hücreler esasen yoktu ve kültürün beşinci ve altıncı günlerinde hiç tespit edilmedi.

Bu prosedürü denerken, hücresel bileşimin kültürün uzunluğuna bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Hasattan üç gün sonra yapılan sıralama, yüksek sayıda erken aşama ve az sayıda geç aşama verir ve beş gün sonra sıralanan kültürler için bunun tersi de geçerlidir.