Name: Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Öğrenin fare kemik iliğinden GM-CSF ile uyarılmış miyeloid hücreleri yüksek hızlı hücre sıralama ile izole etme yöntemini. Bu teknik, gelişimsel immünoloji araştırmaları için beş farklı hücre popülasyonunun belirlenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Alison kilise kuş, Auburn Üniversitesi Okul, hayvan hastalıklarıyla ilgili ilaç akış sitometresi NIH cep ve Auburn Üniversitesi Moleküler Biyoloji programı için EHS R15 R15 AI107773 ve fon için tesis, teknik yardım için minnettarız Yaz PBR için araştırma fonu için.

Tüm hayvan iş bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri için Kılavuzu'nda açıklanan önerileri doğrultusunda Auburn Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. kemik iliği toplama için hazırlık
<ol><li>Bir çözüm Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta % 10 fetal buzağı serum, 2 mM glutamin ve 0,22 µm vakum filtre kabı birim üst 50 µM 2-mercaptoethanol ile takıma ekleyerek 250 mL tam ortam hazırlamak ve vakum uygulanır. Not: Tam orta 4 ° C'de 2 aya kadar saklanır.</li>
	<li>% 70 etanol çözüm % 100 etanol 350 mL 150 mL steril H2O'bir 500 mL şişe ile karıştırarak hazırlayın.</li>
	<li>Set santrifüj ile 4 ° c</li>
	<li>Forseps, neşter ve makas % 70 etanol içinde sterilize.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, komple bir medya 5 mL üç 60 mm Petri yemekler için ekleyin.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, komple bir medya 30 mL 50 mL konik tüp ekleyin.</li>
</ol>2. fare kemik iliği hücre koleksiyonu
<ol><li>C57BL/6 fare tarafından CO2 narkoz ötenazi 2013 Amerikalı hayvan hastalıklarıyla ilgili tıbbi Derneği (travma) yönergeler tarafından kurulan kurallarına göre ötenazi.</li>
	<li>
Kaldırmak ve arka ayakları şerit.
	<ol>
<li>Arka ayakları ve gövde % 75 etanol ile emdirmek ve kıvrımlı doku makasla kalça eklemi çevresindeki deri yoluyla sığ kesim yapmak. Forseps kullanarak, sıkıca kalça derisinden kas açığa ayak bileği doğru aşağı çekin. Makas Cilt kapağı kaldırmak için kullanın.</li>
		<li>Bütün arka bacak kemik hemen üstünde uyluk kemiği/kalça eklemi içinden çıkarın. Not: bölgeyi sterilize yanı sıra, etanol temiz kesim sağlanmasında yardım edecek ve saç örnekleri kirletici önlemek.</li>
		<li>Eğer bacaklar kemik iliği hasat için yeni bir konuma aktarılır, komple bir medya bacaklarda daldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril Biyogüvenlik kabini çalışma, bacaklar önceden hazırlanmış Petri yemekler birine aktarın.</li>
	<li>Sadece kesmek için makas kullanın aşağıda ayak bileği ve dikkatli bir şekilde mümkün olduğunca kas ve elastik bağ dokusu daha fazla kaldırmak. Temizlenmiş kemik için ikinci hazırlanmış Petri kabına aktarın. Not: tüm kas kaldırmak için gerekli olmasa da, çok fazla kalan doku kemik iliğini temizlemek zorlaştırabilir.</li>
	<li>
Uyluk, diz ve tibia ayırın.
	<ol>
<li>Forseps kullanarak, bacak diz tutun ve kemik iliği bulun. Not: kemik iliği üst femur ve tibia sonuna doğru kemik boşluğu içinde hafif bir kırmızı çizgi olarak görünür olmalıdır.<ol>
<li>Makas kullanarak, aşağıdaki gibi üç kesim yapmak.<ol>
<li>Hemen ilik sona erdirmek için görüntülendiği üzerinde tibia kesmek.</li>
				<li>Sadece diz eklemi kesti.</li>
				<li>Sadece diz eklemi kesmek.</li>
				<li>Kalça eklemi hala femur bağlı ise, sadece kalça eklemi kesti.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Üç parçaları Petri kabına dönmek ve diğer bacak bu işlemi yineleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Femur ve tibia floş kemik iliği.
	<ol>
<li>Bir 10 mL şırınga ile 50 mL konik tüp ve kap tam medyadan 23 G iğne ile doldurun.</li>
		<li>Üçüncü hazırlanmış Petri kabına yukarıda forseps ile kemik tutan, iğne kemik kanalı içine yerleştirin ve medya aracılığıyla, (ki sağlam bir "tak" veya çeşitli kümeleri olarak ortaya çıkabilir) hücreleri dışarı fışkırma itin. Daha fazla renk-ebilmek var olmak seen kemiğe kadar yineleyin. Şırınga ile kitle iletişim araçları gerektiği gibi doldurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Epifizleri ezmek.
	<ol>
<li>Hala ikinci Petri dish iken, diz kapağı sıkıca forseps ile tutun ve diz şırınga ucu ile püre. Epifizleri artık kırmızı kadar devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şırınga kullanarak, hücreleri 50 mL tüp ikinci ve üçüncü Petri kabına aktarın. Ayrılık kümeleri tarafından hafifçe yukarı ve aşağı pipetting kadar. Kabarcıklar oluşturmamanız çalışın. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.</li>
	<li>
Kırmızı kan hücreleri parçalayıcı
	<ol>
<li>Serolojik pipet ile süpernatant kaldırmak, Pelet flicking tarafından çıkarmak ve ACK (amonyum klorür potasyum) lizis arabellek için oda sıcaklığında 1 dk 1 ml kuluçka tarafından kırmızı kan hücreleri parçalayıcı.</li>
		<li>Serolojik pipet kullanarak HBSS (Hanks dengeli tuz solüsyonu) arabelleği 40 mL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, hücreleri bir 70 µm hücre süzgeç rağmen bir yeni 50 mL konik tüp içine filtre. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, tam medya 40 mL süpernatant ve yıkama hücrelerle kaldırın. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika. Not: Bu aşamada lineage olumlu lenfositler FACS veya manyetik sütun arıtma tarafından kaldırılabilir. Ancak, lenfositler kültür uzun vadede korunmaz. Lineage pozitif hücrelerinin çok sayıda Ly6C-CD115-nüfus kemik iliği ex vivoiçinde mevcut olmakla birlikte, neredeyse tüm eksik gün 5 (Şekil 2).</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve tam medya 10 ng/mL 1 x 106 hücre/mL yoğunluğu, rekombinant fare GM-CSF ile kemik iliği hücrelerinde kültür. Not: Genellikle, 4 x 107 toplam hücreleri kırmızı kan hücre lizis sonra hasat edilebilir. Ancak, 2 x 107 kadar az yeni başlayanlar için ve ilâ 5 x 107 hücreleri deneyimli biçerdöver için bekler.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak hücreleri doku kültürü tabakaları bana aktarmak ve % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya. 24-şey plaka kullanarak tohum Eğer her hücre süspansiyon 2 mL ile iyi.</li>
	<li>Her 48 h, serolojik pipet medya yarısı kaldırmak ve taze tam medya ve GM-CSF ile değiştirmek için kullanın. Not: Kültürler için 9 gün tutulabilir. Ancak, kompozisyon zaman içinde değişir. Daha fazla bilgi için bkz: Bölüm 3.</li>
</ol>3. gün tür seçimi
<ol><li>Hücre nüfus besteleri zaman içinde değiştikçe, istenen hücre en yüksek sayısını verir bir günü seçin.</li>
	<li>Tablo 1 GM-CSF kültürü 1 x 107 hücre başına 3, 5 ve 7 gün sonra beklenen hücre verim post sıralama beher-in belgili tanımlık nüfus için bkz:.</li>
</ol>4. strateji boyama
<ol><li>Küçük aliquots hücre kontrol örnekleri hazırlamak için kullanın. Bir günahı denetimi, yalnızca bir floresan antikor ile her, lekeli tazminat kontrol örnekleri içerir ve floresan eksi bir bir, non-spesifik floresans o kanal için denetime dışında tüm hangi antikor eklenir kontrol eder. Yalnız, ikincil yalnız, birincil dolaylı etiketleme, kullanarak eklerseniz ve hem birincil ve ikincil. Not: Phycoerythrin (PE) ve allophycocyanin (APC) öğesini antikorlar en az kanama ile ayrı ayrımı üzerinden birlikte kullanıldığında sağlamak. Ancak, fluorochrome seçenekleri sınırlı değilse, Ly6C çok yüksek düzeylerde ifade edilir iken CD115 nispeten düşük bir seviyede gösterilir. Bu nedenle, daha parlak fluorochromes anti-CD115 için arzu edilir ve anti-Ly6C fluorochromes üzerinde kanama önlemek için seçilir.</li>
	<li>100 mL FACS yıkama arabellek (FWB) ile fetal buzağı serum 50 mL konik tüp içinde 3 mL 97 mL soğuk Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) karıştırılarak hazırlamak ve bir buz banyosu yerleştirin.</li>
	<li>Yumuşak, ama iyice, yukarı ve aşağı herhangi bir gevşek yapışık hücreleri çıkarmak için hücreleri pipet için bir pipet kullanın.</li>
	<li>
Serolojik pipet kullanarak, hücreleri 50 mL konik tüp aktarın. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.
	<ol>
<li>Hücre hacmi 50 mL aşarsa, tüpler gereken sayıda hücre aktarmak ve boyama adımda birleştirmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yavaşça süpernatant dökün ve FWB 30 mL serolojik pipet ile ekleyerek pelleted hücreleri yıkayın. 250 x g 10 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve yıkama tekrarlayın. Not: Eğer yüksek hücre ölümü beklenen, hücreleri ile FWB ile yıkanabilir % 0.5 fetal buzağı serum (FCS) gibi düşük. Bu topaklanma Hücre engeller.</li>
	<li>
Askıya alma ve antikor üretici yönergelerine başına hücre leke.
	<ol>
<li>5 x 107 hücreleri FWB 1 ml askıya alma ve anti-Ly6C ve anti-CD115 (araştırmacı seçtikleri) fluorophores ile etiketli her 2 µg ekleyin. Cumhuriyetçi millet Partisi (her ikisi de Ly6C - ve CD115 - vardır) moDC daha fazla ayırt etmek için anti-CD11c antikorların 2 µg ekleyin (CMP CD11c olan-; moDC vardır CD11c+). Buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya. Not: Şekil 3 Ly6C-PE ve CD115-APC kullanarak oluşturulmuştur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, FWB ve santrifüj 10 mL 250 x g 4 ° C'de 10 dakika için ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça süpernatant dökün ve FWB 30 mL serolojik pipet ile ekleyerek pelleted hücreleri yıkayın. 250 x g 10 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve yıkama tekrarlayın.</li>
	<li>Hücreleri askıya almadan önce iyice Pelet çıkarmak için tüp hafifçe vur. 1 x 107 hücre/mL FWB hücreleri askıya alma ve 35-µm hücre filtreden filtrelemek için serolojik pipet kullanın. Filtre uygulanmış hücreler Polipropilen tüp içine aktarıp sıralamak için hazır kadar buza koyun serolojik pipet kullanın. Not: Polipropilen kullanılamıyorsa, kaplı protein (yağsız Kuru süt veya FCS) polistren tüpleri bağlama azaltmak için kullanılabilir.</li>
</ol>5. kontrol örneklere dayalı Gates ayarla
Not: yüksek hızlı akım akışı baskısı nedeniyle hücre kesintileri önlemek için hücre sıralamak için 100-130 µm meme kullanın.
<ol><li>
Günahı denetimi çalıştırmasına (bkz. Adım 4.1) hücre sıralayıcısı aracılığıyla ve küçük enkaz (düşük ileri dağılım; dışlamak için bir kapı uygulamak FSC) ve son derece taneli (yüksek dağılım; SSC) parçacıklar.
	<ol>
<li>Yalnızca sonraki aşamalar (monosit, moMac/MoDP ve MoDC) çözümlemek için yalnızca daha büyük hücreleri (yüksek FSC) içerecek şekilde geçişi uygulayın.</li>
		<li>Canlılığı lekeleri kullanılıyorsa, bunlar lekeli, uygun olmayan olaylar ( Şekil 1' de bir örnek gösterilmiştir) dışarıda bırakmak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tek floresan kontrol örnekleri hücre sıralayıcısı çalıştırın ve değerini gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>Çok etiketli örnek örneği çalıştırın. Dört ayrı nüfus gözlemlemek: Ly6C + CD115-(GMPs), Ly6C + CD115 + (monosit), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP) ve Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). Her dört büyük nüfusun yalıtmak için bir kapı uygulanır. Not: Ly6C-CD115-fenotip CMPs ve moDC paylaşın. Ancak, CD11c ifade dayalı farklılaşmış: CMP eksikliği CD11c, MoDCs CD11c hızlı ise.</li>
</ol>6. izole nüfus topluluğu
<ol><li>En az %20 ulaşmak için yeterli FCS ekleyerek koleksiyonu tüpleri hazırlayın final toplama ne zaman tam. Örneğin, 5 mL tüpler kullanıyorsanız, sıralamadan önce FCS 1 mL ekleyin ve 5 mL toplam hacim ulaştığında tüpü çıkarması.</li>
	<li>
Membran ciro ve antikor alımını önlemek için sıralama boyunca 4 ° C'de (karışık ve sıralanmış) tüm örneklerini tutun.
	<ol>
<li>Bu mümkün değilse, mümkün olduğu kadar buz üstünde sıralanması ve aliquots sıralayıcısı için gerektiği gibi aktarmak için hücreleri içeren tüp tutun.</li>
		<li>Ayrıca, her 20-30 dk buz için sıralanmış örnekleri aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreler için istediğiniz sayıyı topladıktan sonra serolojik pipet hücreleri için yeni bir konik tüp aktarmak için kullanın. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.<ol>
<li>Saflık sonrası sıralama analizi üzerinde toplanan her nüfusunun küçük aliquots ile onaylayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak için FWB ve santrifüj 250 x g 4 ° c de iki yıkar, toplam 10 dk. tekrar 10 ml askıya alma. Not: Tüm süpernatant Pelet kekii olmadan kaldırmak zor olabilir. Pipet Ucu bir vakum hattına ekleme kaldırma ile yardımcı olabilir. Bu yoksa, bu süpernatant Pelet ayrılma durumunda taze bir tüp toplanan önerilmektedir.</li>
	<li>Süpernatant sonra ikinci yıkama kaldırın.</li>
	<li>Hücreleri yeniden kültürlü kullanıcının deneysel tasarım belirler, 2.12-2,14 adımları. Hücreleri hemen analiz için kullanılacaksa, aksi takdirde, hücre istenen protokol göre hazırlayın. Not: Tipik fonksiyonel analiz örneği Şekil 4' e eklenmiştir.</li>
</ol>

<ol><li>Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+development+and+function+of+dendritic+cell+subsets+by+GM-CSF%3A+more+than+a+hematopoietic+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor.</a> Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).</li>
<li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+cytokine%2C+GM-CSF%2C+alters+the+developmental+outcome+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells.</a> Eur J Immunol. , (2012).</li>
<li>van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+development+by+GM-CSF%3A+molecular+control+and+implications+for+immune+homeostasis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy.</a> Blood. 119, 3383-3393 (2012).</li>
<li>Steinman, R. M., Inaba, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10449155">Myeloid dendritic cells.</a> J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+development+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell development and maturation.</a> Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).</li>
<li>Pierre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+MHC+class+II+transport+in+mouse+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells.</a> Nature. 388, 787-792 (1997).</li>
<li>Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%3A+antigen+presentation%2C+accessory+function+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance.</a> Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).</li>
<li>Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Grown+Bone+Marrow+Derived+Cells+Are+Composed+of+Phenotypically+Different+Dendritic+Cells+and+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages.</a> Mol Cells. 39, 734-741 (2016).</li>
<li>Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+developmental+stages%2C+kinetics%2C+and+phenotypes+exhibited+by+myeloid+cells+driven+by+GM-CSF+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro.</a> PLoS One. 12, e0181985(2017).</li>
<li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c%28%2B%29MHCII%28%2B%29+Macrophages+and+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42, 1197-1211 (2015).</li>
<li>Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+maturation+and+cross-presentation%3A+timing+matters%21%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!</a> Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).</li>
<li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).</li>
<li>Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Dendritic+Cell+Maturation+in+the+Induction+of+Insulin-Dependent+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus.</a> Frontiers in immunology. 8, 327(2017).</li>
<li>Shortman, K., Naik, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+and+inflammatory+dendritic-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Steady-state and inflammatory dendritic-cell development.</a> Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).</li>
<li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li>
<li>Naik, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+pro-DCs+and+pre-DCs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro.</a> Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).</li>
<li>Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stages+of+myeloid+dendritic+cells+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow.</a> Int Immunol. 15, 515-524 (2003).</li>
<li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311, 83-87 (2006).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+CD8%7Balpha%7D-Positive+Dendritic+Cells+from+a+Common+Myeloid+Progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor.</a> Science. 290, 2152-2154 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek herhangi bir çakışma var.

Bu iletişim kuralı yalıtım GM-CSF-driven yaratıcı ve öncü hücre tiplerinin çeşitli biyokimyasal deneyleri, hücresel işlev içinde vitroveya korumak içinde vivodeneyleri de dahil olmak üzere analizleri için yeterli sayıda kolaylaştırır. Bu yöntem güvenilir izolasyon ve erken geliştirme hem de bu farklı hücre tipleri para nereye hücrelerinin kimlik daha yaygın olarak etkinleştirme monosit kaynaklı dendritik hücre gelişimi alanında önemli bir ilerleme temsil eder. önceki çalışmalarda izole.
<p class="jo...

Sitokin ile fare kemik iliği hücre kültürü çalışmalarının granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) yaygın bir yöntem olarak monosit kaynaklı dendritik hücreler (moDC; da inflamatuar DC) çok sayıda 1'oluşturmak için kullanılır, 2,3,4,5. Bu hücreler içinde a değişiklik-in dendritik hücre (DC) işlevi 6,7,8çalışmaların son derece yararlı olmuştur. Genellikle, bu fare kemik iliği hücreleri 6-8 gün boyunca kültürlü ve daha sonra dendritik hücre işlevi 5çalışma için kullanılır. Bu kültürler uzun çoğunlukla farklılaşmış moDC çoğunluğu oluşan homojen olarak kabul edilmiştir. Son zamanlarda, bu 6-8 gün kültür dönemin sonunda, orada gerçekten çok moDC, hem de büyük bir alt kümesini farklılaştırılmış monosit kaynaklı makrofajlar (moMacs) 9,10,11açık hale gelmiştir. Kendi çalışmaları diğer alt kümeleri moDC öncüleri (moDP) ve monosit, gibi daha az gelişmiş hücre kültürlerinde düşük frekansta sonra bile 107 gün kalmasını gösteren bu bulgular daha da genişletmiştir. Böylece, çalışmalar bu sistem tarafından oluşturulan hücreler kullanarak dendritik hücreler (DC) işlevinin yanıt-e doğru daha geniş bir kohort hücre tiplerinin daha önceden takdir yansıtmak.
GM-CSF-oluşturulan moDC farklılaşma 12,13,14son aşamasında bu hücreler işleve ilişkin çalışma çok şey öğrendik. Bununla birlikte, önemli ölçüde bu gelişimsel yolu hakkında daha az 2,15,16 hücreleri ve nasıl ve ne zaman onlar özel sergi gibi işlevleri anlamak: patojen ilişkili moleküler yanıt Desenler (PAMPs), fagositoz, antijen işleme ve sunum 13ve anti-bakteriyel etkinlik. Yalıtım geleneksel Flt3L tahrik DC ataları ve hareketlenme öncesi ilk belirtiler çok sayıda için bir protokol bildirilen 17oldu. Yalıtım bu farklı nüfus elde kullanarak carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-(sayesinde bunun bölünen hücreler izlemek için) kemik iliği hücreleri lekeli ve Flt3L kültür 3 gündür. Hücreleri sonra hiza pozitif hücrelerinin tükenmiş ve içine yaratıcı ve öncü nüfus CD11c ifade 17tarihinde göre sıralanır. CD31 ve Ly6C 18tarihinde dayalı hücreleri sıralamak için DC erken ataları GM-CSF-driven kültür tanımlamak için Leenen'ın Grup tarafından başka bir yaklaşımı oldu. Ataları ve GM-CSF-driven moDC nın elde etmek için benzer bir yöntem oluşturmak için ilk hedefi oldu. GM-CSF tarafından oluşturulan belirli hücre tipleri nedeniyle, yaklaşım ve strateji geliştirme erken ve daha sonraki aşamalarında ifade edildi molekülleri ifade dayalı sıralama uyarlanmış. Biz sonuçta belirlenen Ly6C, CD115 (CSF-1 reseptör), ve CD11c bu hücre ayırt 10türleri için en iyi işaretler vardı.
Burada, birkaç farklı gelişimin yolu boyunca GM-CSF tarafından tahrik farklılaşma, hücre izolasyon için bir yöntem mevcut: ortak Myeloid dede (CMP), granülosit-makrofaj dede (GMP), monosit, monosit kaynaklı makrofaj (MoMac) ve monosit kaynaklı DC (MoDC). MoMac nüfus daha fazla dayalı MHC sınıf II ifade, düzeyde moDC habercisi nüfus (moDP) 10açığa ayrılmış olabilir. Biz Ly6C, CD115 ve CD11c ifade üzerinde göre bu 5 nüfus yalıtmak için (FACS) strateji sıralama yüksek hızlı bir floresan aktif hücre kullanmaktadır. O zaman bu hücrelerin fonksiyonel deneyleri PAMP stimülasyon yanıtlarını ifşa olarak muayene göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)</td><td>HyClone</td><td>SV30014.04</td><td>tam ortamı desteklemek için ve FWB</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>tam ortamı desteklemek için</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (2-ME)</td><td>MP Biyomedikal</td><td>190242</td><td>tam ortamı desteklemek için</td></tr><tr><td>75 mM Vakum</td><td>Filtresi Termo Bilimsel</td><td>Komple ortamı sterilize etmek için</td> <td>156-4045</td></tr><tr><td>ACK Lizis Tamponu</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>kırmızı kan hücresini parçalamak için</td></tr><tr><td>HBSS tamponu</td> Kırmızı <td>kan hücresi lizizinden sonra lökositleri kurtarmak için</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS), Dulbecco'nun</td><td>Lonza</td><td>17-512F'si</td><td>endotoksin içermemelidir; 4 ° C'de soğutulmuş; C</td></tr><tr><td>35 ve mikro; m Hücre filtresi</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>sitometreden geçmeden önce kümeleri parçalamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Biyokaynak</td><td>PMC2011</td><td>10 ng/mL kullanılabilir konsantrasyon</td></tr><tr><td>Hasattan sonra kemik iliği hücreleri için</td><td>doku kültürü ile tedavi edilmiş plaka</td><td>VWR</td><td>10062-896</td></tr><tr><td>Anti-Ly6C, Klon HK1.4</td><td>Biolegend</td><td>128018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115, Klon AFS98</td><td>Tonbo Bioscience</td><td>20-1152-U100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c, Klon HL3</td><td>BD Biosciences</td><td>557400</td><td>CMP ve MoDC'leri ayırt etmek için</td></tr><tr><td>MoFlo XPD Akış Sitometresi</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td>660517</td><td></td></tr><tr><td>%100 Etanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri Kabı</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik tüp</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664</td><td>Kadın; 10-20 haftalık Biyogüvenlik</td></tr><tr><td>Başlığı</td><td>Thermo Scientific</td><td>8354-30-0011</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>23 G iğne</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5810&nbsp; R</td><td>eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Yazılımı v10</td><td>BD Biosciences</td><td>Sürüm 10</td><td>flowjo.com</td></tr></tbody></table>

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Fare kemik iliği granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) kullanılarak üretilen monosit kaynaklı dendritik hücreler (moDC) kültürleri son zamanlarda daha önceden takdir daha heterojen olduğu kabul. Bu kültürler rutin de monosit türetilmiş moDC makrofaj (moMac) ve monosit gibi hatta bazı az gelişmiş hücreler içerir. Bu iletişim kuralı gibi onlar geliştirmek, böylece özel işlevleriyle daha fazla soruşturma tutarlı bir yöntem kimlik ve birçok hücre tipleri bu kültürlerde mevcut ayrılması için sağlamak için hedeftir. Burada sunulan sıralama strateji hücreleri ilk dört nüfus Ly6C ve CD115, ifadeye dayalı GM-CSF-driven kültür geliştirdikçe ikisi de geçici hücreleri tarafından ifade edilir içine ayırır. Bu dört nüfus ortak miyeloid ataları veya Cumhuriyetçi millet Partisi (Ly6C-, CD115-), granülosit/makrofaj ataları veya GMP (Ly6C +, CD115-), monosit (Ly6C +, CD115 +) ve monosit kaynaklı makrofajlar veya moMac (Ly6C-, CD115 +) içerir. CD11c da içinde Ly6C-, CD115-nüfus iki popülasyonun ayırt etmek için sıralama strateji ekledi: CMP (CD11c-) ve moDC (CD11c +). Son olarak, iki örneğin alınma olasılığını daha da içinde Ly6C-, MHC sınıf II ifade düzeyine göre CD115 + nüfus ayırt. Monosit kaynaklı bir DC habercisi (moDP) daha yüksek MHC sınıf II ifade ederken MoMacs alt düzeyleri MHC sınıf II, hızlı. Bu yöntemi birkaç gelişimsel olarak ayrı nüfus sayıları güvenilir yalıtım fonksiyonel ve gelişimsel analizleri çeşitli için yeterli olanak sağlar. Biz bir tür işlevsel okuma, stimülasyon Pathogen-Associated moleküler desenleri (PAMPs) ile fark yanıtlarını bu hücre tiplerinin vurgulayın.

Bir çaba olarak birçok kanal analiz için kullanılabilir olası, canlı hücreler olarak tutmak için düzenli olarak ön ve yan dağılım, çok küçük ve çok parçalı Etkinlikleri (tipik bir kapı tüm 1A rakamnokta çizer uygulanır) hariç göre seçildi. Bu perdeleme strateji güvenilir bir şekilde ölü hücreleri hariç olup olmadığını belirlemek için 7-Amino actinomycin D (7-AAD) (Şekil 1B) ile lekeli. 7AAD membran geçirgenliği nedeniyle ölü ve ö...

Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Bu yöntem, araştırmacıların gelişimsel immünoloji alanındaki temel soruları yanıtlamak için yeterli sayıda hücre tipi elde etmelerini sağlayabilir. Bu tekniğin ana avantajı, geleneksel olarak ex vivo olarak düşük sayılarda bulunan çok sayıda hücreyi izole etmek için birkaç seçilmiş işaretleyiciye dayanmasıdır. Bu tekniğin anlamı, terapötik kemik iliği transplantasyonuna kadar uzanır, çünkü çok sayıda progenitörün izolasyonuna izin verir.Protokole başlamak için, önceden hazırlanmış bir farenin arka bacaklarını ve gövdesini %75 etanol ile doyurun ve kavisli doku makası ile kalça eklemi etrafındaki deriden sığ kesimler yapın. Ardından arka ayakları çıkarın ve soyun. Forseps kullanarak, cildi kalçadan ayak bileğine doğru sıkıca çekin, kası ortaya çıkarın ve cilt flebini çıkarmak için makas kullanın.Femur ve kalça ekleminin hemen üstünden kesin ve kemiği keserek tüm arka bacağını çıkarın. Steril bir biyogüvenlik kabininde çalışarak, bacakları önceden hazırlanmış petri kaplarından birine aktarın. Ayak bileğinin hemen altını kesmek için makas kullanın ve mümkün olduğunca çok kas ve elastik bağ dokusunu dikkatlice çıkarın.Temizlenmiş kemiği hazırlanan ikinci petri kabına aktarın. Ardından,

generation-large-numbers-myeloid-progenitors-dendritic-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video fare kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için prosedür göstermektedir. İzolasyon fare tibia ve femur, ve kemik iliği işleme göstermiştir. Hücre fenotipi ve CpG IL-12 üretimi takiben olgunlaşma gösteren farklılaşma öncesi ve sonrası hücre morfolojisi gösteren resimler ve rakamlar gösterilmektedir.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Bu videoda, yetişkin bir farenin kemik iliğinden dendritik hücrelerin (T hücrelerini aktive eden anahtar antijen sunan hücreler) üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

Burada, translasyonel uygulamalar için heterojen kemik iliğinden büyük miktarlarda murin monositleri üreten bir protokol sunuyoruz. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem, kurban edilen hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olur ve yüksek gradyanlı manyetik hücre ayırma (MACS) gibi pahalı yöntemlerden kaçınarak maliyetleri düşürür.

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

Bu çalışmada, Flt3 ligandı varlığında ortak lenfoid progenitörleri AC-6 besleyici hücrelerle birlikte kültürleyerek verimli bir şekilde pDC üretebilen bir in vitro kültür sistemi sunuyoruz.

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Biz pDC fonksiyonel çalışmalar için, lupus-eğilimli farelerin kemik iliğinden, yüksek saflıkta plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) izole etmek için sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre kullanarak bir protokol sunulmuştur.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Burada fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R hücre kültürünü kültür, viral enfeksiyonlar gerçekleştirme ve yayılmasını önleme ve farklılaşma deneyleri için detaylı protokol sunulmuştur. Bu hücre kültürünü myeloid hücre gelişimini ve myeloid hücre büyümesi ve Nötrofilik farklılaşma ilgi genlerin rol çalışmak için uygundur.

Nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R farklılaşma hücre

Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC'ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Bu yöntem, MEP ve MKp'nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Burada, erken patlama oluşturan birim eritroid (BFU-e) ve koloni oluşturan birim eritroid (CFU-e) progenitörlerinin doğrudan taze fare kemik iliği ve dalağından prospektif izolasyonu için yeni bir akış sitometrik yöntemi tanımladık. Tek hücreli transkriptomik verilere dayanarak geliştirilen bu protokol, dokunun tüm eritroid progenitörlerini yüksek saflıkta izole eden ilk protokoldür.

Patlama Oluşturan Birim ve Koloni Oluşturan Birim Eritroid Progenitörlerinin Fare Dokusundan Akım Sitometrisi ile Tanımlanması ve İzolasyonu

Öğrenin fare kemik iliğinden GM-CSF ile uyarılmış miyeloid hücreleri yüksek hızlı hücre sıralama ile izole etme yöntemini. Bu teknik, gelişimsel immünoloji araştırmaları için beş farklı hücre popülasyonunun belirlenmesini sağlar.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil (Video) | JoVE Journal

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Daha fazla video keşfet