Name: Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Öğrenin insan epikardiyal hücrelerinin izolasyonu ve kültürü yöntemini, kalp gelişimi ve hastalıklarında epitel-mezenkimal geçişi incelemek için. Bu teknik klinik uygulamalara katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Hollanda organizasyon bilimsel araştırma (NWO) (VENI 016.146.079) için ve bir LUMC araştırma bursu hem AMS ve LUMC Bontius Stichting (MJG) tarafından desteklenmektedir.

İnsan dokusu numuneler ile tüm deneyler Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Helsinki Deklarasyonu için uygundur. Tüm adımlar bir hücre kültür akışı kabine steril ekipmanları ile gerçekleştirilir.
1. hazırlıkları
<ol><li>EPDC orta Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM düşük-glikoz) ve orta 199 (M199) 1:1 oran içinde karıştırarak hazırlayın. % 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS, 25 dk 56 ° c için inaktive ısı) ekleyin ve ilave 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin ile. 37 ° C su banyosu EPDC ortamda önceden ısıtmak.</li>
	<li>Tripsin önceden sıcak 0.25%/EDTA (1:37 ° C su banyosunda 1).</li>
	<li>Wells jelatin ile kat. Her şey için % 0,1 jelatin/PBS ekleyin ve en az 15 dakika 37 ° C'de plakaları kuluçkaya Yönergeleri gerekli hücre kültür plaka için Tablo 1' de özetlenmiştir. Dikkatli bir şekilde tüm sıvı hücreleri kaplama önce çıkarın.</li>
	<li>DMSO (dikkat) seyreltilmiş hisse senedi çözeltisi 10 mM SB431542 (SB), hazır olun. Eppendorf tüpleri gibi konik alt polipropilen santrifüj tüpleri 50 µL aliquots yapmak ve onları-20 ° C'de depolayın SB aliquots yalnızca bir kez çözdürülen unutmayın.</li>
</ol>2. alma ve depolama yetişkin ve Fetal kalp örneklerin
<ol><li>15 mL ile 50 mL tüp içinde saklamak kaldırma ameliyatı sırasında üzerine doğrudan insan yetişkin auricles %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin 4 ° C'de içeren yüksek glikoz DMEM Örnekler genellikle 3-5 cm boyutunda ve ilâ saklanabilir diseksiyon sonra 48 saat.</li>
	<li>Fetal kalp yalıtım sonra seçmeli kürtaj malzeme 24 s kadar 4 ° C'de EPDC ortamda elde edilen saklayın. Bu iletişim kuralı için 12-22 hafta arasında gebelik yaşı ile örnekleri kullanır. Not tüm kalp epicardium yalıtım için kullanılabilir.</li>
</ol>3. yalıtım Epicardial tabakasının
<ol><li>Laminar akışı kabine PBS ile 100 mm hücre kültürü yemek hazırlamak ve PBS, ayrı bir damlacık (~ 200 µL) kapağı yerleştirin. 15 mL tüp 5 mL Önceden ısıtılmış EPDC orta ile doldurun.</li>
	<li>Doku PBS ile dolu hücre kültürü çanak yerleştirin. Doku işlem sırasında sık sık nemlendirilmiş emin olun.</li>
	<li>Bir stereomicroscope kullanarak, daha fazla doku örneği mümkün olduğunca epicardial katmandan kaldırmak forseps kullanarak kapalı soyulması tarafından. Not: epicardium bir çok ince, şeffaf tabaka sıkıca kalp (şekil 1A) dışa doğru uydurdugunuz hikayeye bagli olarak kabul edilebilir. Bu yalıtım engel olacaktır beri epicardial yağ dokusu ve kan damarları ile kirlenmesini önlemek deneyin.</li>
	<li>PBS damlacığı epicardial doku parçaları kapağını toplamak.</li>
	<li>Bir neşter (şekil 1B) ya da küçük forseps keskin uçları kullanarak epicardial doku (0,5 mm3) küçük parçalara kesilmiş. Parçaları bir P1 geçmek gerekir Not 000 damlalıklı ipucu (Adım 3.6).</li>
	<li>Tripsin 1 mL epicardial doku ekleyin ve parçalar ve tripsin bir P1, 000 damlalıklı ipucu ile toplamak. Doku 1.5 mL konik santrifüj tüpüne (şekil 1 c) aktarın.</li>
	<li>10 dk, bir 37 ° C su banyosunda tüp ~ 60 rpm'de sallayarak süre kuluçkaya.</li>
	<li>Tüp su banyosundan çıkarın ve % 70 etanol ile tüp dýþýna temizleyin.</li>
	<li>Doku tüp (şekil 1 d) altına lavabo ve dikkatle tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için 5 mL EPDC orta içeren 15 mL tüp epicardial hücreleri içeren süpernatant aktarmak izin.</li>
	<li>Konik santrifüj tüpü 1 mL tripsin ile kalan dokuda doldurmak ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetting karıştırın.</li>
	<li>3.7-3.10 iki kez tekrarlayın. Son adımda, tripsin kuluçka, 30 dk toplam sonra süpernatant ve kalan epicardial doku EPDC orta içeren tüp içine aktarın.</li>
	<li>Tüm hücreleri EPDC ortamda toplandığında, yavaşça süspansiyon 10 mL şırınga ile 19 G'lik iğneyi mekanik olarak hücreleri (şekil 1E) ayırmak için yeni bir 15 mL tüp geçmek. Not: yukarı ve aşağı tıkalı iğne önlemek için iğne çözüm geçirmeden önce pipetting tarafından süspansiyon homojenize emin olun.</li>
	<li>Daha fazla hücreleri ayırmak için 3,12 21'lik iğne ile adımları yineleyin.</li>
	<li>Üzerine 50 mL tüp 100 µm hücre süzgeç koyun ve tüm kalan kümeleri (şekil 1F) kaldırmak için bir 10 mL pipet kullanarak süzgeç üzerine epicardial hücreleri içeren orta aktarın.</li>
	<li>5 mL EPDC orta süzgeç üzerine pipetting tarafından kalan hücreleri toplamak için süzgeç yıkayın.</li>
	<li>Damlalıklı hücre süspansiyon 50 mL tüp 15 mL tüp içine. Hücreleri tüp altına lavabo beri çözüm pipetting önce yavaşça salla. Not: Bu adım gerekli değildir, ancak daha küçük bir tüp Pelet görselleştirme Santrifüjü sonra yardımcı olur.</li>
	<li>200 x g (şekil 1G) oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet (şekil 1 H) EPDC orta (Tablo 1) gerekli hacmi resuspend. Not: fetal EPDCs için doğrudan EPDC orta ALK5 kinaz inhibitörü (EPDC + SB) 10 µM içeren kullanın. Yetişkin hücreler SB ilk geçiş sırasında kaplama.</li>
	<li>Jelatin kaplı kültür plakaları (şekil 1I) hücre süspansiyon plaka. Kuyu boyutunu epicardial doku örneği (Tablo 1) boyutuna bağlıdır. Düşük confluency EMT oluşumunu teşvik unutmayın.</li>
	<li>En az 48 saat 37 ° c, % 5 CO2 hücre kültür plakasına eklemek izin vermek için kuluçka hücreleri yerleştirin.</li>
</ol>4. Kültür EPDCs
<ol><li>EPDC + SB orta en az 3 günde doldurmak.</li>
	<li>Hücreleri en az her 3 gün mikroskop kullanarak kontrol edin. Ne zaman ne zaman kültür plaka tamamen hücrelerle örtülüdür hücreleri confluency, Yani, ulaşmak, bir 1:2 yüzey oranı hücrelerde geçiş. Confluency ulaşan ~ 5-10 gün sürebilir unutmayın.<ol>
<li>Örneğin, bir cam damlalıklı bir damlalıklı veya bir aspirasyon sistemi kullanarak orta Aspire edin.</li>
		<li>Hücreleri dikkatle PBS hücrelere ekleyerek yıkayın. Yavaşça plaka girdap ve PBS Aspire edin.</li>
		<li>Tripsin plaka ekleyin. Tripsin içeren hücrelerin tümünü kapsar ve 1 dk. 37 ° C'de plaka kuluçkaya için plaka Yavaşça döndürün Not: Kullanmak mümkün olduğunca küçük tripsin olarak (gösterge: 6 kuyu başına 200 µL de plaka)</li>
		<li>Mekanik olarak alt plaka hücrelerden ayırmak için plaka dokunun. Mikroskop görsel olarak hücreleri ayırdıktan denetlemek için kullanın. Eğer değilse, hücre kültür plaka ilave bir dakikalığına kuluçkaya.</li>
		<li>EPDC + SB orta gerekli hacmi hücrelere ekleme, yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend ve hücre süspansiyon yeni bir jelatin kaplı kültür tabağa aktarın. Not: genel olarak, hücre içinde bir Arnavut kaldırımlı Morfoloji geçiş 8 kadar tutulabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. indüksiyon EMT EPDCs içinde
<ol><li>EMT ikna etmek için hücreleri tripsin ve yeni jelatin hücrelere kuyu 1:2 yüzey oranında EPDC + SB ortamda 4'te açıklandığı gibi kaplı ve en az 24 h 37 ° c, % 5 CO2için kuluçkaya transfer ayırmak.</li>
	<li>Onay confluency % 50-70 ve EPDCs bir Arnavut kaldırımlı Morfoloji varsa ise. Not: Confluency EMT geçmesi EPDCs yeteneğini etkiler.</li>
	<li>Hücreleri ortamından Aspire edin ve PBS dikkatle hücrelerle yıkayın (bkz. Adım 4.2.1 - 4.2.2).</li>
	<li>1 ng/mL TGFβ3 EPDC ortamda içeren hücreleri uyarmak ve 37 ° c, % 5 CO2 5 gün için bir kuluçka yer onları. Stimülasyon sırasında doldurulan TGFβ3 içeren EPDC orta sahip olmadığını unutmayın.</li>
	<li>Hücreleri her gün izlemek. 5 gün sonra EMT uygulandı hücreleri bir seklinde Morfoloji tarafından (şekil 2A) kabul edilmektedir.</li>
	<li>Kültür EPDCs SB veya TGFβ eklenmesi EPDC orta olmadan 4 açıklanan yöntemine göre seklinde. Genel olarak, EPDCs seklinde Not geçiş 20 kadar kültürlü.</li>
	<li>İmmünfloresan boyama ile EMT oluşumunu doğrulamak antikorlar Mezenkimal işaretleri αSMA veya Vimentin karşı veya phalloidin tarafından F-aktin stres lifleri (şekil 2B) oluşumu tespit etmek ya da qRT-PCR EMT ilgili genler ( kullanarak Örneğin, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, salyangoz, Slug) (şekil 2C ve Tablo 2).</li>
</ol>

<ol><li>Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+a+source+of+multipotent+adult+cardiac+progenitor+cells%3A+Their+origin%2C+role+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+research%22%5BJournal%5D)">The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate.</a> Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).</li>
<li>Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+human+embryonic+and+foetal+epicardium+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development.</a> Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).</li>
<li>Zhou, B., Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+progenitors+contribute+to+the+cardiomyocyte+lineage+in+the+developing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart.</a> Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).</li>
<li>Smits, A., Riley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium-Derived+Heart+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epicardium-Derived Heart Repair.</a> Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).</li>
<li>Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+Induction+of+Fetal+Cardiomyocyte+Proliferation+via+a+Retinoic+Acid-Inducible+Trophic+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor.</a> Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).</li>
<li>Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor%2C+FGFR-1%2C+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).</li>
<li>Lavine, K. J., Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).</li>
<li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+and+retinoic+acid%2C+secreted+from+the+epicardium%2C+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).</li>
<li>Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+analyses+of+the+function+of+the+proepicardium+using+a+new+microsurgical+procedure+to+induce+loss-of-proepicardial-function+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).</li>
<li>Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium-derived+cells+enhance+proliferation%2C+cellular+maturation+and+alignment+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).</li>
<li>Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+Artery+and+Orifice+Development+Is+Associated+With+Proper+Timing+of+Epicardial+Outgrowth+and+Correlated+Fas+Ligand+Associated+Apoptosis+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns.</a> Circulation Research. 96 (5), (2005).</li>
<li>Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+modulator+of+the+cardiac+autonomic+response+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).</li>
<li>van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PloS one. 7 (9), e44692(2012).</li>
<li>Zhou, B., Honor, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li>
<li>Smart, N., Bollini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+cardiomyocytes+from+within+the+activated+adult+heart+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury.</a> Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).</li>
<li>Zangi, L., Lui, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+and+adult+epicardial-derived+cells%3A+a+novel+model+to+study+their+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation.</a> Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Derivation+of+Primary+Human+Epicardium-Derived+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).</li>
<li>Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+Cells+of+Human+Adults+Can+Undergo+an+Epithelial-to-+Mesenchymal+Transition+and+Obtain+Characteristics+of+Smooth+Muscle+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro.</a> Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).</li>
<li>Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+epithelial-to-mesenchymal+transformation+in+human+adult+epicardial+cells+is+regulated+by+TGF%CE%B2-signaling+and+WT1%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+research+in+cardiology%22%5BJournal%5D)">In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1.</a> Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).</li>
<li>Chechi, K., Richard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermogenic+potential+and+physiological+relevance+of+human+epicardial+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity+Supplements%22%5BJournal%5D)">Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue.</a> International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada bir yalıtmak için detaylı Protokolü ve birincil epicardial hücreleri insan yetişkin ve fetal kalp türetilmiş kültür açıklar. Kapsamlı bu hücrelerin karakterizasyonu önceden yayınlanan17oldu. Biz her iki hücre tipleri ALK5 kinaz inhibitörü SB431542 ile kültürlü zaman epitel Arnavut kaldırımlı benzeri hücreler olarak muhafaza edilmesi göstermiştir. EMT geliştirme ve sonrası yaralanma yanıt sırasında epicardial harekete geçirmek içinde vivo ayrılmaz bir parçası olduğunu. EMT bu yöntem...

Epicardium, zarflar, olduğunu kalp geliştirme ve (gözden Smits ve ark. tamir için hayati önemi olan bir tek hücreli epitel tabaka 1). proepicardial organ, gelişmekte olan kalp tabanında bulunan küçük bir yapı developmentally, epicardium kaynaklanmaktadır. Gelişimsel güne E9.5 fare ve 4 hafta sonrası anlayışı insan, hücreleri bu karnabahar yapısından geçirmek ve kapak gelişmekte olan Miyokardiyum2başlayın. Bir kez bir tek epitel hücre katmanı oluşturulur, bir kısmını epicardial hücreleri epitel Mezenkimal geçiş (EMT) uğrar. EMT sırasında hücreleri epitel onların niteliklerinden hücre-hücre yapışıklıklar, kaybetmek ve onları gelişen Miyokardiyum geçirmek için kapasitesi sayesinde daha çok bir Mezenkimal fenotip elde edilir. Her ne kadar ikinci farklılaşma iki hücre fibroblastlar, düz kas hücreleri ve potansiyel olarak cardiomyocytes ve endotel hücreleri3, gibi çeşitli kardiyak hücre türleri kurulan epicardial türetilmiş hücre (EPDCs) ayırt nüfus kalır (gözden Smits ve ark. içinde tartışma konu 4). Ayrıca, onun büyüme ve vaskülarizasyon5,6,7,8düzenlemek için öğretici parakrin sinyalleri Miyokardiyum için epicardium sağlar. Engelli epicardial oluşumu kalp kası9,10, damarlara11ve iletim sistemi12temel vurgu, gelişimsel hatalarına yol açar birden fazla çalışmalar göstermiştir epicardium kalp oluşumu için katkı.
Yetişkin kalbinde epicardium uyuyan bir katman olarak mevcut olsa da, iskemi13yeniden olur. Epicardial yeniden etkinleştirme sonrası yaralanma beyannamedir birkaç işlemler yayılması ve EMT14, olsa da dahil olmak üzere kalp geliştirme için daha az verimli bir şekilde açıklanan. İlginçtir, her ne kadar kesin mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir, onarmak için epicardial katkı tedavi ile örneğin, Thymosin β415 tarafından geliştirilmiş veya VEGF-bir mRNA16iyileştirmiştir kalp kaynaklanan, değişikliğin Miyokard İnfarktüsü sonra işlev. Epicardium bu nedenle endojen onarım yaralı kalp geliştirmek için ilginç bir hücre kaynak olarak kabul edilir.
Kalp Geliştirme mekanizmalarının kez yaralanma sırasında daha az verimli bir şekilde her ne kadar recapitulated. Epicardial aktivatörleri arayışı içinde belirlemek ve fetal ve yetişkin epicardium tam kapasite karşılaştırmak önemlidir. Ayrıca, terapötik bir bakış açısından bu hayvan deneyleri ek olarak, biz bilgi ile ilgili insan epicardium yanıt uzatmak önemlidir. Burada, izole ve insan yetişkin ve fetal epicardial türetilmiş hücrelerinde (EPDCs) bir epitel hücre gibi Morfoloji kültür ve EMT ikna etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu model ile keşfetmek ve yetişkin ve fetal epicardial hücre davranış karşılaştırın hedefliyoruz.
Bu iletişim kuralı en büyük avantajı değil iyice incelenmiştir insan epicardial malzeme kullanmaktır. Önemlisi, açıklanan yalıtım ve hücre kültürü iletişim kuralı bu iki hücre kaynakları arasında doğrudan bir karşılaştırma etkinleştirme her iki fetal ve yetişkin Arnavut kaldırımı EPDCs türetmek için tek bir üniforma yöntemi sağlar. Ayrıca, epicardium, konuma göre izole olduğu için aslında epicardially türetilmiş17hücrelerdir sağlanmaktadır.
İnsan EPDC izolasyon yöntemleri daha önce kurulmuş olan sağlarken, bunlar çoğunlukla nerede kalp veya epicardial doku parçaları bir hücre kültür çanak18,19kaplama yapılan protokol bağlıdır. Bu yaklaşım böylece bunu kısmen geçirmek için onların epitel fenotip kaybetmek ve spontan EMT geçmesi daha eğilimli olan özellikle hücreleri için seçer. Geçerli protokol epicardium epitel onların durumunu korumak izole EPDCs sağlayan bir tek hücre çözümü önce işlenir. Bu yöntem bu nedenle epicardial EMT eğitim için bir katı vitro modeli sağlar.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Orta 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin% 0.25</td> <td>Canlandırıcı</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin G sodyum tuzu</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin sülfat</td><td>Roth</td><td>HP66</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin 1:250 sığır pankreasından</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Kültür plakaları 6 kuyulu</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Kültür plakaları 12 kuyulu</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Kültür plakaları 24 kuyulu</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&mikro; L Filtreli Pipet Uçları</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td>Veya ev yapımı ve sterilize</td></tr><tr><td>edilmiş Eppendorf tüpleri 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>0030120086</tr><tr><td>15 ml'lik santrifüj tüpleri</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml'lik santrifüj tüpleri</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>305959</td><td></td></tr><tr><td>İğneler 19 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>İğneler 21 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>EASYstrainer Hücreli Elekler, 100 & m</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF ve beta; 3&nbsp;</td><td>Ar-Ge D sistemleri</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal Anti-Aktin, &alfa;-Düz Kas</td><td>Sigma</td><td>A2547&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü> </td></tr><tr><td>Pipet P1.000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipet kontrolörü</td><td>Integra</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Ters Işık Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

yalıtım ve kültür insan yetişkin ve fetal kalp örnekler elde edilen birincil epicardial hücre

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Epicardium, Miyokardiyum kapsayan bir epitel hücre katmanı iskemik yaralanma sonra kalp geliştirme sırasında hem de onarım yanıt kalp önemli bir rol vardır. Aktif hale getirildiğinde, epicardial hücreleri epitelyal Mezenkimal geçiş (EMT) hücreleri Yenileyici Miyokardiyum için sağlamak için bilinen bir sürecinden geçmeleri. Ayrıca, epicardium temel parakrin faktörler salgılanmasını katkıda bulunur. Tam takdir epicardium rejeneratif potansiyelini ortaya çıkarmak için bir insan hücre modeli gereklidir. Burada bir roman hücre kültür model birincil epicardial türetilmiş hücre (EPDCs) insan yetişkin ve fetal kalp dokudan türetmek için anahat. EPDCs izole etmek için epicardium kalp numune dışarıdan disseke ve bir tek hücre süspansiyon işlenmiş. Ardından, EPDCs kaplama ve ALK 5-kinaz inhibitörü onların epitel fenotip korumak için SB431542 içeren EPDC ortamda kültürlenir. EMT stimülasyon ile TGFβ tarafından indüklenen. Bu yöntem sağlar, ilk kez, kontrollü bir ortamda insan epicardial EMT sürecinin incelenmesi ve kalp rejenerasyon yardımcı olabilir EPDCs secretome daha fazla anlayış kazanıyor kolaylaştırır. Ayrıca, bu üniforma yaklaşım insan yetişkin ve fetal epicardial davranışını doğrudan karşılaştırma için sağlar.

Burada, EPDCs insan yetişkin ve fetal kalp dokusu (şekil 1) izole etmek için basit bir protokol anahat. Bu iletişim kuralı, kalp (şekil 1A) dışarıdan epicardium kolay erişilebilecek bir konuma yararlanır. Diseksiyon temel subepicardial hücre dışı matriks ve miyokard dokusu bozulmamış (şekil 1J) kalırken WT1 + epicardium kaldırılır gösterir sonra kalp auricle boyama. Geniş karakterizasyonu, EPDCs hızl...

Epicardium hücreleri ve büyüme faktörleri miyokardiyal duvara sağlayarak geliştirme ve onarım kalp önemli bir rol oynar. Burada, çalışma ve gelişimsel ve yetişkin özellikleri karşılaştırma sağlar kültür insan birincil epicardial hücreleri yöntemine açıklayın.

Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Bu prosedürün genel amacı, epikardiyal hücre davranışını incelemek için insan epikardiyal türevli hücreleri izole etmek ve kültürlemektir. Bu yöntem, kardiyak gelişim ve hastalık sırasında epikardın nasıl aktive edildiği gibi kardiyak araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sonuçların klinik bir ortama çevrilmesine yardımcı olabilecek insan kalp dokusu örneklerine uygulanabilmesidir.Protokolümüz, epikardiyal kaynaklı hücrelerin epitelyalden mezenkimal geçişinin araştırılmasını tanımlamaktadır. Bununla birlikte, faktörlerin çoğalmasını veya salgılanmasını incelemek için de kullanılabilir. Başlamak için, laminer akış kabininin içinde 100 milimetrelik bir hücre kültürü kabını PBS ile doldurun.Kapağa yaklaşık 200 mikrolitre PBS yerleştirin, ardından 15 mililitrelik bir tüpe 5 mililitre önceden ısıtılmış EPDC ortamı ekleyin. Yetişkin bir insan kalbinden izole edilen kalp dokusunu tabağa yerleştirin. Stereo mikroskop altında, epikardiyal tabakayı dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın.Daha sonra, kapaktaki epikardiyal doku parçalarını toplayın ve bunları 0,5 küp milimetrelik parçalar halinde kesmek için bir neşter kullanın. Do

the-isolation-culture-primary-epicardial-cells-derived-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokolde, w e atriyal aritmi farelerde tetikler katkıda farelerin ve insanların kalplerinde (aynı zamanda kardiyak melanosit olarak da bilinir) melanosit benzeri hücrelerin yeni bir nüfus tespit.

Fare Kalpten İlköğretim Melanocyte gibi Hücreleri Ayırma

Primer hücre kültürü özellikle belirli gelişim aşamalarında transgenik fare embriyolardan, hücrelerin belirli nüfus analiz etmek için yararlı bir tekniktir. Burada, embriyonik ventriküller disseke ve ayrışmış ve antikor konjuge boncuk tanımak ve daha fazla analiz için endotel hücreleri ayırmak vardır.

Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Kalp hastalıklarının hücre temelinde Mevcut bilgi çok hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmalara dayanmaktadır. Burada açıklamak ve insan ventrikülün küçük cerrahi örneklerinden tek bir canlı kardiyomiyositlerin elde etmek için yeni bir yöntem doğrulamak. İnsan ventriküler miyositler elektrofizyolojik çalışmalar ve uyuşturucu testi için kullanılabilir.

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Burada, birincil fare epikardiyal hücrelerini bir büyüme kültürü testi ile izole etme ve bir ex vivo kalp kültürü sistemi kullanarak epikardiyal türevli hücrelerin (EPDC) fonksiyonel göçünü değerlendirme yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokoller, epikardiyal epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve motilitenin genetik ve kimyasal modülatörlerini tanımlamak için uygundur.

Epikardiyal dışsal gelişimi Kültürü Deneyi ve<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Epikardiyal türetilmiş Hücre Göç Değerlendirilmesi

Epikardium, kardiyovasküler gelişim ve rejenerasyon için gerekli olan multipotent kardiyovasküler progenitör hücrelerin ve parakrin faktörlerin önemli bir kaynağıdır. Burada fare embriyonik epikardiyal hücrelerini kültürlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Embriyonik From The Heart Epikardiyal Hücrelerinin Vitro Kültür

İnsan kalp dokusu miyokardiyal rejenerasyonu için uygun multipotent perivasküler öncü hücre popülasyonlarının barındırır. Perisitler ve CD34 + CD146 - - adventisya hücreleri, insan miyokard burada tarif edilen teknik, yerli kan damarları, örneğin CD146 + CD34 ile ilgili iki multipotent stromal hücre popülasyonlarının eş zamanlı izolasyonu ve saflaştırılması mümkün kılar.

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

Bir fare kalpten farklı kardiyak hücre tiplerinin izolasyonu için çeşitli protokoller geliştirilmiş ve açıklanmıştır. Burada, yüksek kaliteli ana kardiyak hücre tiplerinin (kardiyomiyosit, endotel hücreleri ve fibroblastların) tek bir preparasyondan izole edilmesini sağlayan deneysel maliyetleri düşüren optimize edilmiş bir protokol tarif edilmiştir.

Bir Yetişkin Sıçan Kalpten Yüksek Kalitede Kardiyomiyosit, Endotel Hücresi ve Fibroblastların Eşzamanlı İzolasyonu

Bu çalışmanın amacı, kardiyomiyositleri yetişkin kalpten tekrarlıca izole etmek ve DNA içeriğini ve nükleasyonu ölçmek için bir yöntem geliştirmektir.

İmmünsitokimya ve Ploidi Analizi için Sabit Kalplerden Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Biz bir sindirim tampon ardışık doku sindirim yoluyla sıçan kalplerinden endokardiyal ve koroner endotel hücrelerinin izolasyon için bir protokol sunmak, tekrarlayan santrifüj döngüleri hücre toplama, ve anti-sıçan CD31 mikroboncuklar kullanarak hücre arıtma.

Endokardiyal ve Koroner Endotel Hücrelerinin Sıçan Kalbinin Ventriküler Serbest Duvarından İzolasyon

Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg'a kadar) az miktarda dokudan (&lt;50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.

Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Öğrenin insan epikardiyal hücrelerinin izolasyonu ve kültürü yöntemini, kalp gelişimi ve hastalıklarında epitel-mezenkimal geçişi incelemek için. Bu teknik klinik uygulamalara katkı sağlar.

Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

Daha fazla video keşfet