Basit Akış Sitometresi Vitro antikor bağımlı Enhancement-in dang virüs Zika virüs nekahat Serum kullanarak belirlemek için tahlil dayalı

Bu prosedürün genel amacı, Zika virüsü ile enfekte rhesus makaklarından toplanan serumların, in vitro olarak dang virüsü enfeksiyonunun antikora bağlı artışına aracılık etme kapasitesini belirlemektir. Bu yöntem, Zika virüsünün neden olduğu çapraz reaktif antikorların neden olduğu dang humması enfeksiyonunun antikora bağlı olarak artmasıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yüksek troper, basit ve gerçekleştirilmesi kolay olmasıdır.

Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımda gelişmekte olan bir bulaşıcı hastalık yüksek lisans öğrencisi olan William Valiant olacak. Serum örneklerini oda sıcaklığında çözdürerek başlayın. Çözüldüğünde, her serum örneğinin 100 mikrolitresini steril bir tüpe aktarın ve 56 santigrat derecede 30 dakika ısıtın ve etkinleştirin.

Daha sonra, soğuk RPMI 10'da serum örneğinin bire bir, bire bin arasında değişen 10 kat seri seyreltmelerini yapın. Daha sonra, her seyreltilmiş serum örneğinin 10 mikrolitresini steril bir 96 oyuklu V-tabanlı plakanın kuyucuklarına aktarın. Daha sonra, dang humması bir, iki, üç ve dört proporter viral partikülleri 37 santigrat derece su banyosunda çözün ve serum numunesi başına her RVP'den yaklaşık 170 mikrolitre hacim sağlayın.

Çözüldükten sonra, RVP'lerin tüplerini hemen buza aktarın. Daha sonra 10 mikrolitre RVP'yi serum örneği seyreltmelerini içeren kuyucuklara serum kontrol kuyucuklarına pipetleyin. Beş ila on kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.

96 oyuklu V-alt plakayı bir inkübatöre aktarın ve% 5 karbondioksit varlığında 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. 96 kuyulu V-alt plaka inkübe edilirken, biyo-güvenlik kabininin yüzeyini %70 etanol ile temizleyin ve UV ışığını 15 dakika çalıştırın. Ardından, inkübatörden tamamen birleşik bir T-75 K562 hücresi şişesini çıkarın.

Steril beş milimetrelik bir pipet kullanarak hücreleri iyice karıştırın ve beş mililitreyi steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, tüpten 10 mikrolitre hücre çıkarın, 10 mikrolitre tripan mavisi ile karıştırın ve bir hemositometreye yükleyin. Hücreleri sayın ve toplam hücre sayısını hesaplayın.

Hücreleri 10 dakika boyunca 12 yüz kez G'de santrifüjledikten sonra, süpernatanı boşaltın ve hücreleri 30 mikrolitre ortam başına 80 bin hücre konsantrasyonunda ılık RPMI 10'da yeniden askıya alın. 96 kuyulu V-alt plakayı inkübatörden çıkardıktan sonra, 96 kuyulu V-alt plakanın her bir duvarına 30 mikrolitre K562 hücresi aktarın. Ve beş ila on kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.

Ardından plakayı bir saat boyunca inkübatöre geri koyun. İnkübasyonun ardından, plakayı beş dakika boyunca 12 yüz kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, plakayı baş aşağı çevirerek %10 ağartıcı içeren bir kaba çevirerek ortamı kuyulardan boşaltın.

Daha sonra her duvardaki hücreleri 125 mikrolitre ılık RPMI 10'da yeniden süspanse ederek ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyerek yıkayın. Son yıkamayı boşalttıktan sonra, her kuyucuğa 100 mikrolitre ılık RPMI 10 ekleyin. Pipet ile yukarı ve aşağı karıştırın ve% 5 karbondioksit varlığında plakayı 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin.

İki gün sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve bir biyo-güvenlik kabinine aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir oyuğun içeriğini karıştırın ve 96 kuyulu U-taban plakasına aktarın. 96 kuyulu V-taban plakasının her bir kuyusunu 100 mikrolitre %1 paraformaldehit ve PBS ile durulayın ve kalan hücreleri ve PBS'yi 96 kuyulu U-taban plakasındaki ilgili kuyucuklara aktarın.

Çok kanallı bir pipet kullanarak iyice karıştırın. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve hücreleri sabitlemek için inkübatörde 30 dakika bekletin. GFP floresansı için etil-bir kanalını kullanarak yan ve ileri saçılma ayarlarını kalibre etmek için boyanmamış K562 hücrelerini çalıştırarak akış sitometresini hazırlayın.

Daha sonra her örnekten 30 bin ila 50 bin hücre elde edin. Akış sitometrisi analiz yazılımını kullanarak, tek hücreleri dahil etmek ve otofloresan dubletleri analizden hariç tutmak için ilk geçidi ileri saçılma alanına karşı ileri saçılma yüksekliğine göre ayarlayın. Her koşul için GFP pozitif hücrelerin ortalama yüzdesini hesaplayın ve ardından her serum seyreltmesi için enfeksiyonun kat artışını hesaplayın.

Y ekseninde katlama iyileştirmesinin x ekseninde seyreltmeye karşı grafiğini çıkarın ve ANOVA kullanarak istatistiksel analiz yapın ve ardından çoklu karşılaştırmalar için Tukey'in post-hoc testini uygulayın. Dang virüsü bir muhabir virüs parçacıkları kullanan temsili bir hayvandan elde edilen veriler burada gösterilmektedir. Serum kontrol örneği olmayan GFP pozitif hücrelerin yüzdesi %0.253, seyreltilmemiş serum örneği %2.58 GFP pozitifti.

GFP pozitif hücrelerin oranı, bir ila on serum seyreltmesinde% 12.8'e ulaştı, ardından bir ila yüz seyreltmede% 0.735'e ve bir ila bin seyreltmede% 0.022'ye ulaştı. Dang enfeksiyonunun antikora bağlı artışı, dört dang virüsü serum tipi için incelendi. Veriler, enfeksiyondan 16 hafta sonra toplanan serumun, bir ila on arasında bir seyreltmede tüm dang virüsü serum tipleri tarafından K562 hücrelerinin enfeksiyonunu önemli ölçüde arttırdığını göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 48 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, 30 dakikalık son sabitleme adımı tamamlandıktan sonra bir ila iki saat içinde verileri elde etmeyi unutmamak önemlidir. Enfekte serumla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü hazırlarken her zaman KKD ve BSL2 Seviyesi uygulamaları gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.