Name: Basit Akış Sitometresi Vitro antikor bağımlı Enhancement-in dang virüs Zika virüs nekahat Serum kullanarak belirlemek için tahlil dayalı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Öğrenin, Zika virüsü iyileşme serumunun dang humması enfeksiyonunu nasıl artırdığını akış sitometresi ile in vitro ortamda değerlendirin. Bu yüksek verimli yöntem, aşı geliştirme çalışmaları için kritik antikor bağımlı artış mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Açıklanan proje JJM için Uniformed Hizmetleri Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü'nden fon tarafından desteklenmiştir. Görüş ya da burada yer alan iddialar yazarların özel olanları ve resmi veya yansıtıcı olarak görüşlerini Savunma Bakanlığı, Uniformed Hizmetleri Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü veya başka bir Ajansı ABD olmak yorumlanacaktır değildir Hükümet.
WGV tüm deneylerin gerçekleştirilen ve veri analiz; JJM tasarlamış ve çalışma denetlenir; WGW ve JJM kağıt yazdı.

Burada açıklanan protokol göstermek için kullanılan serum numuneleri ilişki değerlendirme ve Akreditasyon laboratuvar hayvan bakımı için ev ve bakım için uygun olarak yerel, eyalet ve federal ilkelerinde edildi rhesus makak elde International (AAALAC)-akredite tesis. Tüm hayvan deneyleri gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve örnekleri paylaşım protokolü bir doku ile elde.
1. gün 1
Not: bir BSL-2 laboratuvar doku kültürü için kullanılan steril laminar akış Biyogüvenlik kabini içinde aşağıda açıklanan tüm adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Serum numuneleri, oda sıcaklığında erimek ve 100 µL serum örnekleri için steril bir tüp aktarın. Isı 30 dk 56° c su banyosu veya sıcaklığı ayarlanabilir bir thermomixer için devre dışı. 1:1-soğuk RPMI-%10 (10 fetal sığır serum ile RPMI) kullanarak 1:1,000 için arasında serum örneği 10 kat seri dilutions olun.</li>
	<li>Seri olarak seyreltilmiş serum örneği 10 µL steril bir 96-şey V-alt plaka her şey için transfer. Sadece ve serum örneği ve RPMI-10 sadece RVPs ve serum örneği olmadan olmadan denetim Wells, RPMI-10 RVPs ile iki kümeleri içerir. Her serum örneği ve triplicates RPMI-10 denetimleri ayarlayın.</li>
	<li>Dang-1, 2, 3 ve 4 RVPs-80 ° C dondurucu ve tezcan çıkarın 37 ° C su banyosu giriyordu. Hemen buz çözdürülen RVPs aktarın. Yaklaşık 170 µL RVPs her serum örneği için elde etmek (RVPs x 3 Wells her serum seyreltme için 10 µL (1:1, 1:10, 1: 100, 1:1, 000) ve RVPs x 3 Wells beher-in RPMI-10 RVP ile 10 µL sadece kuyu kontrolü).</li>
	<li>RVPs 10 µL her de serum örneği içeren 96-şey V-alt plaka ve RPMI-10 RVPs (serum) denetim wells ile içine pipet. RVPs RPMI-10 yalnızca için (hiçbir serum örneği ve hiçbir RVP) kuyuları eklemeyin. İyice yukarı ve aşağı pipetting tarafından Mix 5-10 kat. 10 µL soğuk eklemek RPMI-10 RVPs soğuk her RPMI 10 yerine (hiçbir serum örneği ve hiçbir RVP) kuyu kontrol sadece.</li>
	<li>96-şey V-alt plaka için bir kuluçka aktarmak ve plaka varlığında % 5 CO237 ° C'de 1 saat kuluçkaya. 96-şey V-alt plaka kuluçka iken, % 70 etanol ile kabine Biyogüvenlik yüzeyini temizlemek ve UV ışığı 15dk için çalıştırın.</li>
	<li>İyi bir steril 5 mL damlalıklı kullanarak hücreleri karıştırın ve hücre 5 mL steril 15 mL konik tüp transfer K562 hücrelerinin tamamen Konfluent bir T75 şişesi kuluçka makinesi çıkarın. Not: K562 hücre RPMI-10 içinde muhafaza ve 1 x 106/mL subcultured.</li>
	<li>Hücreleri steril 15 mL konik tüp sizden 10 µL hücreleri kaldırarak saymak ve 10 µL tryphan mavi ile karıştırın. 15 mL konik tüp hücrelerde toplam sayısını belirlemek için bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>15 mL konik ~ 1200 x g hücreleri ile 10 dakika santrifüj kapasitesi, süpernatant dikkatle boşaltmak ve sıcak RPMI-10 saat 80.000 hücreler/30 µL medya (2,66 106 hücre /mL x) bir konsantrasyon hücreleri resuspend.</li>
	<li>96-şey V-alt plaka İnkübatör (Adım 1.6) kaldırmak, 96-şey V-alt plaka her şey için K562 hücre 30 µL aktarmak ve karıştırın iyice yukarı ve aşağı pipetting 5-10 kat. 96-şey V-alt plaka için bir kuluçka aktarmak ve plaka varlığında % 5 CO237 ° C'de 1 saat için kuluçkaya.</li>
	<li>1s için kuluçka sonra 96-şey V-alt plaka kuluçka ve santrifüj ~ 1200 x g, 5 dakikalığına kaldırın. Santrifüjü sonra plaka % 10 çamaşır suyu içeren bir kap içine baş aşağı çevirerek kuyuları medyadan dikkatle boşaltmak.</li>
	<li>Her şey hücrelerde 125 sıcak RPMI-10 µL içinde resuspending tarafından yıkama bir pipet ile iyice karıştırın ve ~ 1200 x g 5 dk. Decant medya için plaka plaka % 10 çamaşır suyu içeren bir kap içine baş aşağı çevirerek santrifüj kapasitesi. Bu yıkama iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Çamaşır sonra RPMI-10 her şey, damlalıklı ile yukarı ve aşağı karışımı sıcak 100 µL ekleyin ve %5 CO2huzurunda 37 ° C'de 48 h plaka kuluçkaya.</li>
</ol>2. gün 3
<ol><li>100 µL hücre ve medya/iyi kuluçka makinesi üzerinden içeren 96-şey V-alt plaka çıkarın ve bir biyogüvenlik kabini taşımak. Bir çok kanallı pipet, karışımı kullanarak içeriği her şey ve hücreleri transfer ve medyaya 96 iyi U-alt plaka veya 5 mL polipropilen borular için önceden etiketli.</li>
	<li>96-şey V-alt plaka %1 100 µL ile her kuyuya durulama Paraformaldehyde (PFA) 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS) ve 96 de U-alt plaka veya etiketli 5 mL polipropilen borular içinde anılan sıraya göre wells transfer adım 2.1 bir son vermeye konsantrasyonu % 0,5 PFA/iyi veya tüp. İyice bir çok kanallı pipet kullanarak karıştırmak, alüminyum folyo ile plaka kapak ve kuluçka hücreleri düzeltmek 30 dakika boyunca oturmak izin.</li>
	<li>Akış Sitometresi ( Tablo reçetesi Örneğin bakınız) hazırlamak için yan ve floresan ayarların yanı sıra ileri dağılım kalibre günahı K562 hücreleri çalıştırarak. GFP hücrelerden yayılan tek Floresans sadece floresan kanal gerekli FL1, olduğu. Kazanmak ~ 30, 000 – 50.000 hücreleri her örnek. Not: Herhangi bir Akış Sitometresi tek bir floresan okuma yeteneğine sahip olarak RVPs ile enfekte hücreleri sadece GFP varlığı nedeniyle yeşil Floresans yayarlar ve diğer bir floresan kanal ihtiyaç vardır veri alma için kullanılabilir.</li>
</ol>3. veri analizi
<ol><li>
Herhangi bir Akış Sitometresi Analizi yazılım kullanarak Akış Sitometresi alınan verileri analiz (tablo malzemeleri görmek).
	<ol>
<li>Küme ilk kapısı, vs FSC-tek hücre eklemek veya auto-floresan birini analiz12den çıkartmak için H (ileri dağılım-yükseklik) FSC-A (ileri dağılım üzerinde – alan) temel. O zaman, singlet Geçitli hücreler SSC-A göre kapı (yan dağılım-alan) vs FSC-A herhangi bir autofluorescent enkaz dışlamak için.</li>
		<li>SSC-A vs GFP ifade tabanlı için SSC-A vs FSC-A Geçitli hücreler analiz GFP-A. GFP + hücrelerin etrafında bir kapı ayarlayarak GFP + hücreler her seyreltme serum ve denetim örnekleri için yüzdesini belirlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 tarafından hücrelerinin toplam yüzdesi, GFP + onaylatılacak Wells bölerek GFP + hücreler her serum Numune dilüsyonu ve denetim wells için ortalama yüzdesini belirleyin.</li>
	<li>Kat-geliştirme enfeksiyon hücrelerinin GFP + serum numuneleri hücrelerinin GFP + RPMI-10 RVPs (serum örneği) denetim wells ile ortalama yüzde bölünen her seyreltme için ortalama yüzde bölerek hesaplayın.</li>
	<li>Kat-geliştirme (y ekseni) seyreltme karşı (x ekseni) grafik ve istatistiksel analiz Tukey'nın post-hoc testi birden çok karşılaştırmalar için ardından ANOVA kullanarak.</li>
</ol>

<ol><li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity%2C+cross-reactivity%2C+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li>
<li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252(2011).</li>
<li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li>
<li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+K562+cell+line%2C+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li>
<li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li>
<li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li>
<li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive%2C+memory-derived+plasmablasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Flaviviruses DENV ve ZIKV gibi önemli kanıt homoloji birbirleri ile13,14cross-react antikor üreten her iki onların yapısal ve yapısal olmayan proteinlerde paylaşmak. Bu cross-reactive antikor yanıt-e doğru geliştirmek gösterilmiştir enfeksiyonu ile ilgili vivo içinde ve vitro Contegra serotip veya diğer flaviviruses1,2. Çapraz enfeksiyon geliştirmek için potansiyel hastalık yönetimi hem ...

Antikor bağımlı geliştirme (ADE) enfeksiyon sayede virüs serotip tarafından indüklenen kısmen cross-reactive antikor yanıt artırır artan viral çoğaltma ve viremi yol virüs, başka bir serotip alımını bir süreçtir. ADE kapsamlı dang virüs (DENV) enfeksiyonları dört büyük serotipleri yaygın nerede belgelemiştir. Hastaların alt kümede, ADE Dang kanamalı ateşi (DHF) ile ilişkilidir. Biz son zamanlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon DENV ADE içinde vitro neden oldu ve büyük olasılıkla DENV viremi vivo içinde1 iyileştirmesini katkıda DENV cross-reactive antikor yanıt düzeyi önemli ölçüde yüksek indüklenen göstermiştir , 2. antikor bağımlı geliştirme deneyleri vardır ilgili virüs ile ikincil enfeksiyon geliştirmek ve flavivirus enfeksiyonlarının patogenezinde içine değerli bilgiler sağlamak ve bilgilendirmek için antikorlar kapasitesini değerlendirmek için değerli bir araç aşıların geliştirilmesi.
Açıklanan tahlil DENV RVPs enfeksiyon için normalde söyleyebileceğin K562 hücreleri ile birlikte burada kullanır. RVPs tek bir çoğaltma3turdan sonra ifade edilir bir alt genomik yeşil flüoresan protein (GFP) replicon kodlamak yapısal olarak sağlam çoğaltma beceriksiz DENV viral parçacıkların vardır. Bu nedenle, RVPs ile enfekte olma hücreleri yeşil bulabilsem ve Akış Sitometresi veya mikroskobu kullanılarak kolayca algılanabilir. Bu tahlil kullanılan RVPs ticari kaynaklardan elde edilmiştir. Onlar ancak, olabilir diğer virüslere karşı oluşturulan ve bu el yazması açıklanan tahlil kullanılır. Bu arada, K562 hücreler antikorlar Fc bölgesine bağlamak ve alt antikor4,5konsantrasyonları nötralize huzurunda bulaşabilir bir FcγIII reseptör ifade lösemi hücre satırı vardır.
ADE deneyleri kapsamlı bir şekilde kullanıldığını şiddetli Dang ve vitro ADE mekanizmaları betimlemek için risk faktörleri araştıran çalışmalarda6,7,8. Burada açıklanan ADE tahlil vitro enfeksiyon RVPs kullanarak geliştirmek ve Akış Sitometresi ile karşılaştırıldığında ya gerektiren kullanılmakta, diğer deneyleri plak şekillendirme belirlenmesi için serum kapasitesini belirlemek için hızlı ve kolay kullanılabilir ikisi de zaman alıcı ve emek hücreleri6,7,8,9,10,11, birimleri (pfu) Vero hücreleri veya bir antikor boyama enfekte yoğun.

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>İntegral Moleküler</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE yaşam koşulları</td><td>SH 30910.03</td> RPMI-10 <td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>MP biyomedikallerinde</td> %10 FBS <td>1670049</td><td>100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPE'de</td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0.025M RPMI-10</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisinde (100&kez;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x in RPMI-10</td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM in RPMI-10</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Steril V-tabanlı plakalar</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Polipropilen 5 ml FACS tüpleri</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Steril olmayan U-tabanlı plakalar</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td><td>FACS tüplerine yüksek verimli bir alternatif</td></tr><tr><td>5 mL, steril, serolojik pipet</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL steril pipet uçları</td><td>Denville</td><td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL steril pipet uçları</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL çok kanallı pipet</td><td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL çok kanallı pipet</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>%20 formadehit</td><td>Tousimis</td><td>&nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>termomikser</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>Isı inaktivasyonu için bir su banyosuna alternatif</td></tr><tr><td>CO2 İnkübatörü</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Çamaşır Suyu</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>Akış sitometrisi analiz yazılımı</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II akış sitometresi</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Çamaşır Suyu</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

basit akış sitometresi vitro antikor bağımlı enhancement-in dang virüs zika virüs nekahat serum kullanarak belirlemek için tahlil dayalı

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antikor bağımlı geliştirme enfeksiyon Dang viral patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır göstermiştir. Antikorlar veya serum enfeksiyon söyleyebileceğin hücre hatlarında geliştirmek kapasitesini ölçmek geleneksel deneyleri üzerinde kullanarak viral çıkış plak deneyleri tarafından takip medya enfeksiyon ölçmek için güveniyorlar. Son zamanlarda, bu deneyleri dang virüs (DENV) enfeksiyonu fluorescently etiketli antikorları kullanarak hücre hatlarında inceledik. Her iki bu yaklaşım bu teknikler yaygın kullanımı kısıtlamak kısıtlamalar bulunmaktadır. Burada, biz yeşil flüoresan protein ve K562 hücreleri antikor bağımlı geliştirme (ADE) DENV enfeksiyon rhesus elde edilen serum kullanarak incelemek için hızlı dang virüs muhabir viral parçacıkların (RVPs) kullanarak bir basit vitro tahlil tarif maymunların Zika virüs (ZIKV) ile enfeksiyon sonra 16 hafta. Bu teknik güvenilirdir, hücreleri en az manipülasyonu içerir, canlı çoğaltma yetkili virüs kullanımı gerektirmez ve Akış Sitometresi kullanarak bir nicel okuma almak için yüksek işlem hacmi biçimde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, bu tahlil kolayca antikor bağımlı geliştirme (ADE) sarı humma virüsü (YFV), Japon Equine Ensefalit virüsü (JEEV), Batı Nil virüsü (WNV) burada RVPs kullanılabilir vb gibi diğer flavivirus enfeksiyonların incelemek için adapte edilebilir. Tahlil ayarlama kolaylığı, veri analizi ve sonuçları yorumlama çoğu laboratuvar ayarları için son derece uysal yapar.

Sera 4 rhesus makak ZIKV ile enfeksiyon sonra toplanan 16 hafta vardı ve potansiyellerini DENV-1 geliştirmek test üzerinden, 2, 3 ve 4 enfeksiyon K562 hücrelerdeki. Hayvanlar tepe viremi ~ 1 105 kopya ZIKV RNA/mL plazma x 7 gün sonra enfeksiyon tarafından algılamayı sınırın altındaki edildi düzeyleri reddetti enfeksiyon sonra 3 gün vardı. Hiçbir viremi 16 hafta sonrası enfeksiyon, plazma algılandı. O zaman, RVP tahlil gerçekleştirilmiş ve toplanan verilerin, yukarıdaki protokol...

Biz enfeksiyon antikor bağımlı geliştirme tarafından Zika virüs nekahat serum dang virüs muhabir Viral parçacıkların kullanarak ölçmek için basit ve kolay bir iletişim kuralı tanımlamak.

Basit Akış Sitometresi Vitro antikor bağımlı Enhancement-in dang virüs Zika virüs nekahat Serum kullanarak belirlemek için tahlil dayalı

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Bu prosedürün genel amacı, Zika virüsü ile enfekte rhesus makaklarından toplanan serumların, in vitro olarak dang virüsü enfeksiyonunun antikora bağlı artışına aracılık etme kapasitesini belirlemektir. Bu yöntem, Zika virüsünün neden olduğu çapraz reaktif antikorların neden olduğu dang humması enfeksiyonunun antikora bağlı olarak artmasıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yüksek troper, basit ve gerçekleştirilmesi kolay olmasıdır.Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımda gelişmekte olan bir bulaşıcı hastalık yüksek lisans öğrencisi olan William Valiant olacak. Serum örneklerini oda sıcaklığında çözdürerek başlayın. Çözüldüğünde, her serum örneğinin 100 mikrolitresini steril bir tüpe aktarın ve 56 santigrat derecede 30 dakika ısıtın ve etkinleştirin.Daha sonra, soğuk RPMI 10'da serum örneğinin bire bir, bire bin arasında değişen 10 kat seri seyreltmelerini yapın. Daha sonra, her seyreltilmiş serum örneğinin 10 mikrolitresini steril bir 96 oyuklu V-tabanlı plakanın kuyucuklarına aktarın. Daha sonra, dang humması bir, iki, üç ve dört proporter viral partikülleri 37 santigrat derece su banyosunda çözün ve serum numunesi başına her RVP'den yaklaşık 170 mikrolitre hacim sağlayın.Çözüldükten sonra, RVP'lerin tüplerini hemen buza aktarın. Daha sonra 10 mikrolitre RVP'yi serum örneği seyreltmelerini içeren kuyucuklara serum kontrol kuyucuklarına pipetleyin. Beş ila on kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.96 oyuklu V-alt plakayı bir inkübatöre aktarın ve% 5 karbondioksit varlığında 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. 96 kuyulu V-alt plaka inkübe edilirken, biyo-güvenlik kabininin yüzeyini %70 etanol ile temizleyin ve UV ışığını 15 dakika çalıştırın. Ardından, inkübatörden tamamen birleşik bir T-75 K562 hücresi şişesini çıkarın.Steril beş milimetrelik bir pipet kullanarak hücreleri iyice karıştırın ve beş mililitreyi steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, tüpten 10 mikrolitre hücre çıkarın, 10 mikrolitre tripan mavisi ile karıştırın ve bir hemositometreye yükleyin. Hücreleri sayın ve toplam hücre sayısını hesaplayın.Hücreleri 10 dakika boyunca 12 yüz kez G'de santrifüjledikten sonra, süpernatanı boşaltın ve hücreleri 30 mikrolitre ortam başına 80 bin hücre konsantrasyonunda ılık RPMI 10'da yeniden askıya alın. 96 kuyulu V-alt plakayı inkübatörden çıkardıktan sonra, 96 kuyulu V-alt plakanın her bir duvarına 30 mikrolitre K562 hücresi aktarın. Ve beş ila on kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.Ardından plakayı bir saat boyunca inkübatöre geri koyun. İnkübasyonun ardından, plakayı beş dakika boyunca 12 yüz kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, plakayı baş aşağı çevirerek %10 ağartıcı içeren bir kaba çevirerek ortamı kuyulardan boşaltın.Daha sonra her duvardaki hücreleri 125 mikrolitre ılık RPMI 10'da yeniden süspanse ederek ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyerek yıkayın. Son yıkamayı boşalttıktan sonra, her kuyucuğa 100 mikrolitre ılık RPMI 10 ekleyin. Pipet ile yukarı ve aşağı karıştırın ve% 5 karbondioksit varlığında plakayı 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin.İki gün sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve bir biyo-güvenlik kabinine aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir oyuğun içeriğini karıştırın ve 96 kuyulu U-taban plakasına aktarın. 96 kuyulu V-taban plakasının her bir kuyusunu 100 mikrolitre %1 paraformaldehit ve PBS ile durulayın ve kalan hücreleri ve PBS'yi 96 kuyulu U-taban plakasındaki ilgili kuyucuklara aktarın.Çok kanallı bir pipet kullanarak iyice karıştırın. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve hücreleri sabitlemek için inkübatörde 30 dakika bekletin. GFP floresansı için etil-bir kanalını kullanarak yan ve ileri saçılma ayarlarını kalibre etmek için boyanmamış K562 hücrelerini çalıştırarak akış sitometresini hazırlayın.Daha sonra her örnekten 30 bin ila 50 bin hücre elde edin. Akış sitometrisi analiz yazılımını kullanarak, tek hücreleri dahil etmek ve otofloresan dubletleri analizden hariç tutmak için ilk geçidi ileri saçılma alanına karşı ileri saçılma yüksekliğine göre ayarlayın. Her koşul için GFP pozitif hücrelerin ortalama yüzdesini hesaplayın ve ardından her serum seyreltmesi için enfeksiyonun kat artışını hesaplayın.Y ekseninde katlama iyileştirmesinin x ekseninde seyreltmeye karşı grafiğini çıkarın ve ANOVA kullanarak istatistiksel analiz yapın ve ardından çoklu karşılaştırmalar için Tukey'in post-hoc testini uygulayın. Dang virüsü bir muhabir virüs parçacıkları kullanan temsili bir hayvandan elde edilen veriler burada gösterilmektedir. Serum kontrol örneği olmayan GFP pozitif hücrelerin yüzdesi %0.253, seyreltilmemiş serum örneği %2.58 GFP pozitifti.GFP pozitif hücrelerin oranı, bir ila on serum seyreltmesinde% 12.8'e ulaştı, ardından bir ila yüz seyreltmede% 0.735'e ve bir ila bin seyreltmede% 0.022'ye ulaştı. Dang enfeksiyonunun antikora bağlı artışı, dört dang virüsü serum tipi için incelendi. Veriler, enfeksiyondan 16 hafta sonra toplanan serumun, bir ila on arasında bir seyreltmede tüm dang virüsü serum tipleri tarafından K562 hücrelerinin enfeksiyonunu önemli ölçüde arttırdığını göstermektedir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 48 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, 30 dakikalık son sabitleme adımı tamamlandıktan sonra bir ila iki saat içinde verileri elde etmeyi unutmamak önemlidir. Enfekte serumla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü hazırlarken her zaman KKD ve BSL2 Seviyesi uygulamaları gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

Bu videoda, Zika Virüsü Nekahet Serumu kullanılarak Dang virüsü enfeksiyonunun antikora bağlı artışını (ADE) ölçmek için yapılan bir test gösterilmektedir. Tahlil, yeşil bir floresan proteini kodlayan Dang muhabiri viral partiküllerini (RVP'ler) kullanır. Zika Virüsüne karşı serum antikorları, bir kompleks oluşturmak için RVP'lerle çapraz reaksiyona girer. Bağlı antikorlar, akış sitometrisi kullanılarak tespit edilen Fc reseptörünü eksprese eden hücreler tarafından RVP alımını arttırır.

Viral Enfeksiyonun Antikora Bağlı Artışını İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Video, bir insan patojeni olan Zika virüsüne karşı antiviral aktiviteye sahip interferonların taranması için bir in vitro testi göstermektedir. Konakçı hücre içinde, Zika virüsü içselleştirildikten sonra çoğalır, komşu hücreleri enfekte eder ve farklı bölgeler veya viral plaklar oluşturur. Antiviral bir ajan olarak işlev gören tip I interferon, virüs çoğalmasını engeller, böylece konak hücre tek tabakasında viral plakların oluşumunu önler.

Zika Virüsü Büyümesinin Güçlü İnhibitörleri Olarak İnterferonları Taramak için İn Vitro Test

Ortaya çıkan bir patojen olan Zika Virüsü (ZIKV), fetal gelişimsel anormallikler ve mikrosefali ile bağlantılıdır. Etkili bir enfeksiyöz hücre kültürü sisteminin kurulması, ZIKV replikasyonu çalışmalarının yanı sıra aşı ve ilaç geliştirme çalışmaları için de çok önemlidir. Bu çalışmada ZIKV ile ilgili çeşitli virolojik analizler gösterilmiş ve tartışılmıştır.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Virüsler veya hücre dışı veziküller, yüzey antijenlerini tanıyan antikorlara bağlı 15 nm manyetik nanopartiküller ile immüno-yakalandı. Yakalanan virionlar veya veziküller, diğer yüzey antijenlerine karşı floresan antikorlarla etiketlendi. Elde edilen kompleksler yüksek manyetik alanda ayrıldı ve floresan üzerinde tetiklenen geleneksel akış sitometreleri ile analiz edildi.

Virionlar antijenik Spectra ve ekstrasellüler veziküllerin Analiz Virometry Akış

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Ifnar1- / - fare modeli immunoprivileged organlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon için antijen spesifik T-hücre yanıtları değerlendirmek için bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem koruma hücresel mekanizmaları ve immunopathogenesis ZIKV aşı soruşturma için çok önemli ve aynı zamanda onların etkinliğini değerlendirme için değerlidir.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

Biz insan serumu, birincil insan hücreleri ve enfeksiyon miktar nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu tarafından kullanarak Zika virüs enfeksiyonu önceden varolan bağışıklık dang virüs karşı etkisini değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde Zika şunun miktar

Mevcut protokol, Zika virüsünün (ZIKV) Vero Afrika yeşil maymun böbrek hücrelerinde yayılımını ve 24 oyuklu ve 96 oyuklu (yüksek verimli) formatlarda hücre bazlı kolorimetrik immüno-tespit yöntemleri kullanılarak ZIKV'nin miktar tayinini açıklamaktadır.

Virüs Yayılımı ve Hücre Bazlı Kolorimetrik Miktar Tayini

Burada, insan hücrelerinde Zika virüsü enfeksiyonunu ve replikasyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için çok kolay ve basit bir yöntem olarak hücre bazlı elektriksel empedansın (CEI) kullanımını gösteriyoruz. Ayrıca, CEI testi antiviral bileşiklerin değerlendirilmesi için yararlıdır.

Zika Virüsü İnhibitörlerini Gerçek Zamanlı Olarak Değerlendirmek için Hücre Tabanlı Elektriksel Empedans Platformu

Öğrenin, Zika virüsü iyileşme serumunun dang humması enfeksiyonunu nasıl artırdığını akış sitometresi ile in vitro ortamda değerlendirin. Bu yüksek verimli yöntem, aşı geliştirme çalışmaları için kritik antikor bağımlı artış mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Basit Akış Sitometresi Vitro antikor bağımlı Enhancement-in dang virüs Zika virüs nekahat Serum kullanarak belirlemek için tahlil dayalı (Video) | JoVE Journal

Basit Akış Sitometresi Vitro antikor bağımlı Enhancement-in dang virüs Zika virüs nekahat Serum kullanarak belirlemek için tahlil dayalı

Daha fazla video keşfet