Yüksek işlem hacmi SiRNA tarama için polis ve hidrojen florür kaynaklı kornea epitel hücre hasarı

Bu video, toksik madde hasarının kornea epitel hücre modelinde yüksek verimli siRNA taraması yöntemlerimizi göstermektedir. Bu çalışma önemlidir, çünkü yüksek verimli siRNA taraması, toksik maddelere hücresel yanıtın yollarını ve düzenleyicilerini aydınlatmak için uygun maliyetli ve zaman açısından verimli bir yöntemdir. Bu çalışma, korneanın toksik hakaretlere nasıl tepki verdiğini daha iyi anlamamıza yardımcı olabilir.

Tek kullanımlık bir orta boy şişede mililitre başına 0.5 mikrogram Hidrokortizon içeren önceden ısıtılmış ortamda kornea epitel hücrelerinin bir süspansiyonunu hazırlayın. Hücreleri eşit şekilde askıya almak için şişeyi döndürün ve otomatik bir sıvı işleyicinin orbital çalkalayıcı yuvasındaki bir rezervuara dökün. Hücre kaplama işlemi sırasında hücre süspansiyonunu 37 derecelik bir ısıtma plakası üzerinde tutun.

96 oyuklu bir plaka üzerinde oyuk başına 70 mikrolitre ortamda oyuk başına bin hücre yoğunluğunda plakalara hücre eklemek için otomatik bir sıvı işleyici kullanın. İncelenecek her siRNA kütüphane plakası için hücrelerle en az 14 96 oyuklu plaka tohumlayın. Tohumlama işlemi sırasında orbital çalkalayıcıyı sürekli olarak dakikada 100 devirde çalıştırın ve tüm adımlar için saniyede 50 mikrolitre pipetleme hızı kullanın.

İlk plakayı tohumlamadan önce otomatik sıvı işleyiciyi kullanarak hücre süspansiyonunu karıştırın. Hücre süspansiyonunun 140 mikrolitresini aspire edin ve iki hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna 70 mikrolitre dağıtın. Tüm plakalar hücrelerle tohumlanana kadar karıştırma ve dağıtmayı tekrarlayın.

Hücre süspansiyon rezervuarını gerektiği gibi yeniden doldurun. Plakalar ekildikten sonra, bunları sıvı işleyiciden çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra bunları bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın.

Ertesi sabah, hücre kültürü inkübatöründe bulunan otomatik bir görüntüleme sistemi kullanarak tüm plakaların hücre yoğunluğunu değerlendirin. Yüzde 15 ile yüzde 22 arasında olmayan iç kuyucukları olan plakaları çalışmadan çıkarın. Tohumlamadan 24 saat sonra, siRNA oyuğu başına dört pikomol ve transfeksiyon reaktifi oyuğu başına 0.3 mikrolitre ile hücreleri aşağıdaki gibi transfekte edin.

Satıcıdan, birinci ve on iki sütun boş bırakılmış halde plaka başına 80 siRNA hedefi içerecek şekilde yapılandırılmış siRNA kitaplık plakalarını edinin. siRNA kütüphane plakasını, üreticinin talimatlarına göre siRNA tamponu ile her siRNA oyuğu için mikrolitre başına iki pikomollük bir nihai konsantrasyona kadar sulandırın. Tüm işlemler için otomatik bir sıvı işleyici ve saniyede 25 mikrolitre pipetleme hızı kullanarak tüm işlemleri gerçekleştirin.

Yalnızca transfekte edilecek kuyuları ele almak için önceden yapılandırılmış uç kutularını kullanın. Üst Plaka Seti olarak adlandırılan altı çoğaltma plakasından oluşan bir seti transfekte etmek için kütüphane plakasının üst yarısını kullanın"Alt Plaka Seti olarak adlandırılan altı replika plakadan oluşan farklı bir seti transfekte etmek için kütüphane plakasının alt yarısını kullanın" Birlikte, on iki plaka tam bir plaka seti oluşturur, Ve her hücre plakası aynı kontrol setini içerir. Tüm üst ve alt plaka setleri kütüphane siRNA'sı ile transfekte edildikten sonra, negatif havuz siRNA'sına sahip tüm plakaların B2'den B6'ya kadar olan kuyularını aktarın.

Ayrıca, negatif havuz siRNA'sı ile kütüphane siRNA'sı almayan diğer iki plakanın B2'den B6'ya olan kuyularını da geçirin. Bunlar açığa çıkmamış kontroller olarak görev yapacaktır. Transfeksiyon karışımları eklendikten sonra tüm hücre plakalarını bir hücre kültürü inkübatöründe dört saat inkübe edin ve her saat hafifçe vurarak karıştırın.

Plakaları önceden ısıtılmış ortamla iki kez yıkamak, PBS'de bir ila beş seyreltmek ve önceden ısıtılmış ortam başına 100 mikrolitre ile yeniden beslemek için otomatik bir sıvı işleyici kullanın. Tüm adımlar için saniyede 50 mikrolitre pipetleme hızı kullanın. Transfekte edilmemiş kontroller olarak C2 ila C6 kuyularını kullanın.

Toksik madde maruziyeti için ilaç ve araç kontrolleri olarak kullanılmak üzere B7 ila B11 ve C7 ila C11 kuyularını transfekte edilmemiş halde tutun. Transfeksiyondan 24 saat sonra, plakaları yeniden beslemek için otomatik bir sıvı işleyici kullanın. Tüm adımlar için saniyede 50 mikrolitre pipetleme hızı kullanın.

Her kuyucuktan 100 mikrolitre aspire edin ve bunu bir atık rezervuarına atın. Her bir kuyucuğu önceden ısıtılmış H-Cort.medium başına 100 mikrolitre ile yeniden besleyin. Atık haznesini gerektiği gibi boşaltın.

Rezervuarı gerektiği gibi orta ile doldurun. Transfeksiyondan iki gün sonra ve maruziyetten iki saat önce, H-Cort'ta pozitif kontrol Kakulenin'in 62.5 mikromolar çözeltisini hazırlayın. orta ve 8 sıralı seyreltme rezervuarının B sırasına ekleyin.

H-Cort'ta yüzde 06.25'lik bir DMSO çözeltisi hazırlayın. ve aynı rezervuarın C satırına ekleyin. DMSO, araç kontrolü olarak kullanılır.

Her bir hücre plakasının B7 ila B11 ve C7 ila C11 kuyularından 10 mikrolitre ortamı çıkarmak için otomatik sıvı işleyiciyi kullanın ve rezervuarın G ve H sıralarına atın. Yalnızca pozitif ve araç kontrollerini alacak kuyuları ele almak için önceden yapılandırılmış uç kutuları kullandığınızdan ve tüm adımlar için saniyede 50 mikrolitre pipetleme hızı kullandığınızdan emin olun. Pozitif ve araç kumandalarının 10 mikrolitresini bu kuyulara aktarın ve üç kez karıştırın.

Bu hücre plakalarını inkübatöre geri koyun. Tüm ek hücre plakaları için bu adımları tekrarlayın. Tüm kimyasal maruziyet işlemlerini kimyasal davlumbazda, çift nitril eldiven, laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık polietilen kılıf koruyucuları ve koruyucu gözlük takarak gerçekleştirin.

Hidroflorik asitle temas eden pipet uçlarını ve rezervuarları ve herhangi bir sıvı hidroflorik asidi tehlikeli atık akışına atmadan önce yüzde 2,5 kalsiyum glukonat ile dekontamine edin. İncelenen her kütüphane plakası için, 80 mililitre önceden ısıtılmış H-Cort'a 288 mikrolitre yüzde bir hidroflorik asit ekleyerek yüzde 0.0036'lık bir hidroflorik asit ortamı çözeltisi hazırlayın. 150 mililitrelik bir şişede orta.

Şişeyi döndürün ve seyreltik hidroflorik asidi kimyasal davlumbazda 37 derecelik bir inkübatörde on dakika inkübe edin. Hidroflorik asit ortam çözeltisini bir plaka ısıtıcısı üzerindeki bir reaktif haznesine ekleyin. Pozlamayı birlikte çalışan iki teknisyenle gerçekleştirin.

Sağdaki teknisyenin on iki kanallı bir pipetleyici kullanarak hücre kültürü ortamını hücre plakasından çıkarmasını ve ardından plakayı soldaki teknisyene geçirmesini sağlayın. Soldaki teknisyenin hidroflorik asit ortam çözeltisinin oyuğu başına 100 mikrolitre eklemesini sağlayın. Toksik maddeye maruz kalacak tüm hücre plakaları için bu işlemi tekrarlayın.

Ayrıca, hidroflorik asit çözeltisi yerine taze ortam kullanarak, maruz kalmamış kontrol plakaları için bu işlemi tekrarlayın. Plakaları 20 dakika boyunca kimyasal bir davlumbaz inkübatörüne yerleştirin ve ardından hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Tüm plakalar açığa çıktıktan ve hücre kültürü inkübatörüne geri gönderildikten sonra, daha önce gösterildiği gibi pozitif kontrol ekleme adımını tekrarlayın.

Hücre kültürü süpernatantını toplayın ve maruziyetten 24 saat sonra bir MTT testi kullanarak hücre canlılığını değerlendirin. Litre başına 10 gram glikoz içeren PBS'de mililitre MTT substratı başına 0.5 miligramlık bir çözelti hazırlayın ve 37 dereceye kadar ısıtın. MTT substrat çözeltisini otomatik bir sıvı işleyici üzerindeki bir rezervuara ekleyin.

Tüm adımlar için saniyede 50 mikrolitre pipetleme hızı kullanın. Bahşiş kutularını yalnızca analiz edilecek kuyucukları ele alacak şekilde önceden yapılandırın. Hücre plakasının iç 60 kuyusundan 95 mikrolitre ortamı aspire etmek için otomatik sıvı işleyiciyi kullanın ve iki adet 384 oyuklu saklama plakasının her birine 42,5 mikrolitre biriktirin.

Hemen hücre plakalarına MTT substrat çözeltisinin oyuğu başına 100 mikrolitre ekleyin ve bunları bir hücre kültürü inkübatöründe bir saat boyunca 37 derecede inkübe edin. 384 kuyulu saklama plakalarını kapatın ve sonraki analizler için eksi 80'de saklayın. Bu işlemi tüm üst ve alt plaka setleri ve ilgili açıkta olmayan kontroller için tekrarlayın.

MTT alt tabaka rezervuarını gerektiği gibi yeniden doldurun. İstenirse uçları replikalar arasında yeniden kullanın, ancak MTT substrat solüsyonu eklerken ve plaka setleri arasında geçiş yaparken bunları yıkayın. Bir saatlik inkübasyondan sonra, MTT substrat çözeltisini her bir hücre kültürü plakasının iç 60 oyuğundan çıkarmak için otomatik sıvı işleyiciyi kullanın ve DMSO oyuğu başına 100 mikrolitre ile değiştirin.

Tüm adımlar için saniyede 50 mikrolitrelik bir pipetleme hızı kullanın ve uç kutularını yalnızca analiz edilecek kuyucukları ele alacak şekilde önceden yapılandırın. Atık haznesini boşaltın ve DMSO rezervuarını gerektiği gibi yeniden doldurun. Plakaları bir tabak çalkalayıcı üzerinde üç dakika çalkalayın.

Bir plaka spektrofotometresi kullanarak 570 ve 690 nanometrede absorbansı ölçün. 690 nanometredeki arka plan absorbansını 570 nanometredeki absorbanstan çıkarın ve maruz kalmayan plaka üzerindeki her kontrol grubu için değerlerin ortalamasını alın. Her bir hedef için absorbans değerlerini, maruz kalmayan kontrollerin ortalama absorbans değerine bölerek yüzde canlılığı hesaplayın.

Tüm hedefler için hücre canlılığı yüzdesini hesaplamak için ortalama maruz bırakılmamış negatif havuzu kullanın. Üreticinin talimatlarına göre, yıkamasız boncuk bazlı bir tahlil kullanarak hücre kültürü süpernatantlarındaki IL-8 konsantrasyonunu ölçün. Numunelere ve standartlara uyum sağlamak için bir tahlil plakası düzeni oluşturun.

384 kuyulu saklama plakalarını eksi 80 dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. Numuneyi kuyuların dibinde toplamak için plakaları kısaca santrifüjleyin. Anti-IL-8 alıcı boncukları ve biyotinillenmiş antikoru 384 oyuklu siyah bir saklama plakasına ekleyin.

Boncuk-antikor karışımını, tahlil plakası düzenine göre numuneler ve standart eğri için kullanılmak üzere belirlenen kuyucuklara ekleyin. Standardı 354 mikromolar sodyum klorür içeren ortamda sulandırın. Standart eğrinin iki kat seri seyreltmesini yapın ve farklı bir siyah 384 oyuklu saklama plakasına üç kopya ekleyin.

Testi gerçekleştirmek için otomatik bir sıvı işleyici kullanın. Tahlil plakası düzenine göre kuyuları adreslemek için önceden yapılandırılmış uç kutularını kullanın. Tüm adımlar için saniyede 50 mikrolitre pipetleme hızı kullanın.

8 mikrolitre alıcı boncuk-antikor karışımını beyaz 384 oyuklu sığ kuyu tahlil plakalarına aktarın. Boncuk-antikor karışımını, tahlil plakası düzenine göre numuneler ve standart eğri için kullanılmak üzere tasarlanmış kuyucuklara ekleyin. Ardından, standart eğriyi sığ kuyu tahlil plakaları üzerindeki uygun kuyucuklara aktarın.

Daha sonra, sığ bir rezervuarda 3.54 molar sodyum klorür çözeltisi hazırlayın. 4,5 mikrolitre sodyum klorür çözeltisini siyah 384 kuyucuklu saklama plakalarındaki numunelere aktararak numunelerin tuz konsantrasyonunu standart eğrininkine uyacak şekilde ayarlayın. Numuneleri 30 mikrolitrelik bir karışım hacmi kullanarak üç kez karıştırın ve ardından numunelerin iki mikrolitresini tahlil plakası düzenine göre beyaz sığ kuyu tahlil plakalarına aktarın.

Karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. 384 oyuklu siyah bir saklama plakasına ikincil boncuklar ekleyin. Boncukları, numuneler için kullanılmak üzere belirlenen kuyucuklara ve tahlil plakası düzenine göre standart eğriye ekleyin.

İkincil boncukların 10 mikrolitresini, tahlil plakası düzenine göre standart eğri veya numuneler alacak olan beyaz 384 kuyulu sığ kuyu tahlil plakasının kuyularına aktarın. Her tabak arasındaki uçları yıkayın. Karanlıkta oda sıcaklığında bir saat daha inkübe edin.

Tahlil plakalarını şeffaf plaka contalarıyla kapatın ve boncuk bazlı tahlil ile uyumlu bir plaka okuyucu kullanarak tarayın. Plaka ve dedektör arasında 0,2 milimetre mesafe, tarama için 180 milisaniye uyarma süresi ve 550 milisaniye ölçüm süresi kullanın. IL-8 tahlillerinden ham verileri bir elektronik tabloya aktarın.

IL-8 tahlillerinin standart eğrisi için otomatik eğri uydurma kullanın ve ardından ham verileri her numune için mililitre başına pikogramlara dönüştürün. Her hedef için altı çoğaltmanın ortalamasını hesaplayın. Ardından, SSMD değerlerini hesaplayın ve açıkta kalan negatif kontrollere göre katlama değişikliğini yapın.

Verileri, her hedef için x ekseni boyunca kat değişikliğini ve y ekseni boyunca SSMD'yi gösteren çift el feneri çiziminde görüntüleyin. Sonuç olarak, toksik maddelerden kaynaklanan oküler yaralanmanın yüksek verimli tarama çalışması için uygun yöntemler ve kültür koşulları geliştirdik. Bir hidroflorik asit hasarı modelinde bir siRNA kütüphanesinin birincil ekranını tamamlayarak bu yöntemlerin faydasını kanıtladık.

Yüksek verimli genomik veri setleri, belirli genlerin yaralanma veya hastalıkta oynadığı rolün anlaşılmasına büyük ölçüde katkıda bulunabilir ve bu da in vitro veya in vivo çalışmalara daha verimli bir şekilde odaklanmaya yardımcı olabilir.