Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

Bu prosedürün genel amacı, kültürlenmiş hücrelerde veya dokuda, ilgilenilen uzun kodlamayan bir RNA'nın RNA moleküler ortaklarını tanımlamaktır. Bu yöntem, uzun kodlamayan RNA'lar tarafından RNA regülasyonu hakkında yeni önemli bilgiler sağlayarak, uzun kodlamayan bir RNA'nın biyolojik işlevlerinin deşifre edilmesine yardımcı olabilir. Bu yöntemin ana avantajı, çoğu uygulama için kullanılabilir olmasıdır, çünkü ilk olarak birkaç uzun kodlamayan RNA için ve ikincisi hem kültürlenmiş hücreler hem de doku ekstraktları için optimize edilmiştir.

Yöntemimiz, önceki iki yöntemin, RNA Saflaştırmaları ile Kromatin İzolasyonu anlamına gelen ChIRP ve RNA Hedeflerinin Yakalama Hibridizasyon Analizi olan CHART'ın karışımına dayanmaktadır. Yöntemimizin özgüllüğü, oligonükleotid problarının, kodlamayan uzun bir RNA'nın ikincil bir yapısının biyoinformatik modellemesi kullanılarak tasarlanmış olması ve amacının RNA hedeflerini tanımlamak olmasıdır. Prosedürü göstermek için ekibimden iki teknisyen, Benedicte Boyer ve Severine Guillen olacak.

GH4C1 hücrelerini metin protokolüne göre kültürledikten sonra, ortamı bir hücre kültürü plakasından çıkarın ve hücreleri durulamak için bir hacim PBS kullanın. Hücreleri sabitlemek için PBS'ye 10 mililitre %1 PFA ekleyin. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca çalkalama altında çapraz bağlayın.

1 mililitre 1.25 molar glisin ekleyerek PFA etkisini söndürün ve numuneyi oda sıcaklığında beş dakika çalkalayın. Ardından, çözeltiyi aspirasyon yoluyla atın ve plakayı her biri beş dakika boyunca iki kez durulamak için 10 mililitre PBS kullanın. Daha sonra, bir mililitre PBS ekleyin, hücreleri toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve bunları bir santrifüj tüpüne aktarın.

Numuneyi beş dakika boyunca 510 g ve dört santigrat derecede döndürün. Ardından, mümkün olduğu kadar çok süpernatanı çıkarın ve peletleri süresiz olarak eksi 80 santigrat derecede saklayın. Doku çapraz bağlamasını gerçekleştirmek için, beş miligram yeni elde edilmiş fare hipofiz bezi dokusunu PBS'de 10X hacimde %1'lik bir PFA'ya daldırın ve numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayın.

0.05 mililitre 1.25 molar glisin çözeltisi ekleyerek PFA'yı söndürün ve dokuyu oda sıcaklığında beş dakika çalkalayın. Ortamı aspire edin ve dokuyu iki kez durulamak için 0,5 mililitre PBS kullanın. Mümkün olduğu kadar çok süpernatanı çıkardıktan sonra, çapraz bağlı dokuyu süresiz olarak eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Lizis tamponunu hazırlayın, ardından numuneleri önceden çözdürmeden parçalamak için. Numuneleri 100 miligram hücre peleti veya dokusu başına yaklaşık bir mililitre olarak yeniden süspanse etmek için tamponu kullanın. Parçalanmış örnekleri dört santigrat derece su banyosuna yerleştirin ve metin protokolüne göre optimize edilmiş sonikasyon serisini başlatın.

Sonikasyondan hemen sonra, numuneleri beş dakika boyunca 12.000 g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Ardından, süpernatanları yeni tüplere aktarın. Sonikasyon serisi, diğer parçalanmış RNA'ları elde etmeden DNA'dan viskoziteyi azaltacak kadar verimli olacak şekilde optimize edilmelidir.

Sonikasyonlu numuneler üzerinde hibridizasyon yapmak için, tüplere ve girdaba iki hacim hibridizasyon tamponu ekleyin. Her numuneden 20 mikrolitreyi santrifüj tüplerine aktarın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Her numuneye 100 pikomol biyotinile oligonükleotid probu ekleyin.

Daha sonra, numuneleri oda sıcaklığında bir tüp döndürücü üzerinde orta derecede çalkalama altında dört ila altı saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numunelere mililitre başına 200 birim RNaz inhibitör çözeltisi ve mililitre başına 5 mikrolitre proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş 50 mikrolitre manyetik streptavidin boncuk ekleyin. Tüpleri, gece boyunca tüp döndürücü üzerinde orta derecede çalkalama altında oda sıcaklığında inkübe edin.

Ertesi gün, tüpleri manyetik bir destek üzerine yerleştirerek RNA izolasyonunu gerçekleştirin ve süpernatanı atın. Daha sonra, boncuklara 900 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve tüpleri beş dakika boyunca oda sıcaklığında bir döndürücüye yerleştirin. Ardından, numuneleri mıknatısın üzerine yerleştirin, tamponu atın ve yıkamayı beş kez tekrarlayın.

Son yıkamayı çıkardıktan sonra, numuneye 95 mikrolitre Proteinaz K tamponu ve mililitre proteinaz-K başına beş mikrolitre 20 miligram ekleyin. Daha sonra, buz üzerinde giriş örneklerini çözün ve 75 mikrolitre Proteinaz K tamponu ve beş mikrolitre proteinaz-K ekleyin. Numuneleri 50 santigrat derecede 45 dakika, ardından 95 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

Numuneleri buz üzerinde üç dakika soğutun, ardından mıknatısın üzerine yerleştirin ve RNA'ları içeren süpernatanı toplayın ve boncukları atın. RNA'ları saflaştırmak için bir RNA saflaştırma kiti kullanın. Son olarak, RNA'ları eksi 80 santigrat derecede saklayın ve RT ve qPCR gerçekleştirin ve metin protokolüne göre DNA kütüphaneleri oluşturun.

Burada gösterilen lncRNA ikincil yapısının biyoinformatik modellemesine dayanarak, problar iki lncRNA'ya, GH4C1 kültürlenmiş hücreler için sıçan Neat1 veya Malat1'e ve hipofiz dokusu ekstraktları için fare Neat1'e karşı tasarlanmıştır. Neat1 veya Malat1'in nispi zenginleşmesi, girdi örneklerine göre spesifik olmayan ve spesifik problar için hesaplandı. Bu şekil, sıçan GH4C1 hipofiz hücre hattında ve fare hipofiz dokusu ekstraktlarında Neat1'i aşağı çekmek için spesifik probların verimliliğini göstermektedir.

Spesifik oligonükleotidler veya SO probları için protokol Malat1'e yönlendirildiğinde, atılan bir verimsiz prob ile birlikte bir verimli prob üretildi. RNA pull-down'ları ve RT qPCR'yi takiben, GH4C1 hücre ekstraktlarında Neat1 ile ilişkili RNA'lar, hipofiz dokusu ekstraktlarında da Neat1 ile ilişkilendirildi. Gerçekten de, Neat1 RNA'nın aşağı çekilmesinden sonra, Malat1'in hem GH4C1 hücre hattında hem de hipofiz fare dokusu ekstraktlarında Neat1 tarafından hedeflendiği bulundu.

Ek olarak, Neat1, GH4C1 hücrelerinde prob ile bir Malat1 RNA aşağı çekme işlemi gerçekleştirildikten sonra önemli ölçüde zenginleştirildi. İki lncRNA arasında tanımlanan yakın ilişki, Neat1 RNA ekspresyonunda varyasyonlar gösteren Malat1 nakavt fareleri tarafından önerilen Neat1 ve Malat1'in potansiyel ortak düzenleyici rolü ile tutarlıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, istenen uzun kodlamayan bir RNA'nın RNA hedeflerinin iki veya üç gün içinde yakalanmasını sağlar.

Biyoinformatik yaklaşımla, birkaç anti-sens prob tasarlamak ve daha sonra verimliliklerini deneysel olarak karşılaştırmak önemlidir, çünkü prob verimliliği hücre lizat preparatları tarafından değiştirilebilir. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen uzun kodlamayan bir RNA'nın tüm RNA etkileşimini sağlamak için yüksek verimli RNA dizilimi gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, ikincil yapısının biyoinformatik modellemesi ile belirlenen uzun kodlamayan RNA'nın mevcut bölgelerine hibritleşen verimli, spesifik problar kullanarak uzun kodlamayan bir RNA'nın RNA ortaklarını nasıl yakalayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.