Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Rekombinant adeno ile ilişkili virüslerin intraspinal iletiminin genel amacı, dorsal omurilikteki genetik olarak tanımlanmış nöronların histolojik olarak etiketlenmesini ve fonksiyonel manipülasyonunu sağlamaktır. Bu yöntem, farklı ağrı modalitelerinin algılanması için hangi nöronal devrelerin gerekli olduğu gibi ağrı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik olarak etiketlenmiş nöronların özel olarak kısıtlanmış ve zamansal olarak kontrol edilen bir şekilde manipüle edilebilmesidir.

Anestezi uygulanmış farenin vertebral kolonu boyunca palpe ederek en kaudal kaburga çiftini bulun. Ardından, sadece rostraldan başlayarak en kaudal kaburga çiftine kadar cilde 1,5 ila 2,5 santimetre uzunlamasına bir kesim yapın. Cildi forseps ile kaldırın ve makasla alttaki kastan ayırın.

Ameliyat boyunca, açıkta kalan dokuları steril% 0.9 sodyum klorür ile nemli tutun. İnce forseps ve küçük makas kullanarak, orta hattın hemen yanında, ince zarlı tabakanın yanına bir kesi yapın ve dikenli işlemlerden kesin. Birkaç anatomik dönüm noktası, hedeflenecek doğru omurların belirlenmesine yardımcı olabilir.

Burada üç alternatif açıklıyoruz. Vertebral kolon boyunca palpe edin. En kaudal kaburga çifti T13 omurlarının hemen rostral bölgesinde bulunur ve kalça hizasındaki pelvik kemik L6 omurları seviyesindedir.

Alternatif olarak, iliak tepeyi ortaya çıkarmak için cildi kuyruğa doğru geri çekin. Aynı seviyede, görünür intetransvers ligamentlerin en kaudal çifti L6 spinal sürecine katılır. İlgilenilen omurları tanımlamak için kaudaldan rostral yöne doğru geriye doğru sayın.

Aksi takdirde, vertebral kolonun kenarındaki tendonun en beyaz ve en medial olduğu noktayı bulun. T13 omurları sadece rostral olarak bulunur. Lomber omurilik segmenti L4 bu omurların içinde yer alır.

Daha sonra, hayvanı stereotaksik çerçevenin omurga kelepçelerine yükseltmek için kıvrılmış dokulardan oluşan bir yastığın üzerine yerleştirin. Kelepçeleri hedef omurlara bitişik olarak hizalayın. Bir kelepçeyi yerine sabitleyin, ardından ikinci kelepçeyi sabitlerken omur kolonu Adson forseps ile tutun.

Hedeflenen omurlara dikkatlice bastırarak uygun kenetlemeyi onaylayın. Ardından, ilgilenilen omurların üzerindeki paraspinöz kası çıkarın. İlk olarak, vertebral kolona paralel tendonların hemen medialinde bir kesi yapın.

Ardından, hedef omurlara rostral ve kaudal dik kesiler yapın. Daha sonra, ilgilenilen omurların üzerindeki paraspinöz kası yırtmak veya kesmek için rongeurs kullanın. Omurlar üzerinde veya intravertebral boşlukta duranın üzerinde kalan dokuyu çıkarmak için gerektiği kadar forseps kullanın.

Dorsal kan damarı şimdi görünür olmalı ve omuriliğin orta hattını işaretlemelidir. Tek taraflı enjeksiyonlar için, omurların hedef tarafının ortasına çok dikkatli bir şekilde bir delik açmak için 0,5 milimetre küresel kesici ile donatılmış ince bir diş hekimi matkabı kullanarak kısmi laminektomi yapın. Omuriliği ortaya çıkarmak için kalan kemik parçalarını 26 gauge eğimli bir iğne ile çıkarın.

Dorsal kan damarının yaklaşık 300 mikron lateralinde, hedef omurlara rostral ve kaudal intravertebral boşluklardaki durayı delmek için iğneyi kullanın. Ardından, delinmiş deliğin altındaki durayı delin. Bu noktada beyin omurilik sıvısı deliklerden kaçmalı ve omurilik hafifçe dışarı çıkmalıdır.

Önce cam kılcal damarı mikrolitrelik bir şırıngaya monte ederek enjeksiyon şırıngasını hazırlayın. Sıkı ve güvenli bir şekilde oturduğundan emin olmak için somunu sıkıca sıkın. Mikrolitre şırıngayı steril damıtılmış suyla doldurun, ardından pistona bastırın.

Su uçtan kolayca dışarı atılamıyorsa, mikropipet muhtemelen tıkanmıştır ve değiştirilmesi gerekir. Şırıngayı elektronik olarak kontrol edilen bir mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre monte edin. Ardından, suyu ve virüsü ayırmak için yaklaşık bir mikrolitre hava çekmek için mikroenjektörü kullanın.

Daha sonra, 2,5 mikrolitrelik bir damla seyreltilmiş virüs solüsyonunu bir parça parafin filmi üzerine pipetleyin. Mikropipetin ucunu sterotaksik çerçeveyi kullanarak dikkatlice damlacığın içine doğru hareket ettirin ve mikropipetin içine çekin. Ardından, uçta bir damla virüs çözeltisi çıkana kadar dağıtıma basın.

Şırıngayı geri çekin ve dağıtılan hacmi izlemek için mikropipeti bir ölçekle işaretlemek için bir kalem kullanın. Mikropipetin ucunu duradaki deliklerden birinin üzerinde hareket ettirmek için stereotaksik kolu kullanın ve ardından açıkta kalan omuriliğin yüzeyinde hafif bir çöküntü görünene kadar aşağı doğru hareket ettirin. Enjeksiyonu spinal dorsal boynuza hedeflemek için, dokunun mekanik stabilizasyonunu sağlamak için ucu 100 mikronluk artışlarla 500 mikron derinliğe kadar aşağı ve ardından 200 mikron yukarı hareket ettirin.

Ucun son derinliği 300 mikrondur. Pompayı dakikada 50 nanolitre enjeksiyon hızında 300 nanolitre enjekte edecek şekilde programladıktan sonra, infüzyonu başlatmak için başlat düğmesine basın. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, virüs seviyesinin düşüp düşmediğini görmek için mikropipet üzerindeki ölçeği kontrol edin.

Basıncın dengelenmesini sağlamak için mikropipeti üç dakika daha yerinde bırakın. Üç dakika sonra, mikropipeti yavaşça geri çekin ve ardından diğer iki enjeksiyon bölgesi için prosedürü tekrarlayın. Son enjeksiyondan sonra, omurga kelepçelerini ve farenin altındaki yastığı çıkarın.

Kesi tabakalarını kesintili dikişlerle kapatın, yüzeysel doku tabakalarını emilebilir dikişlerle, cildi ise emilmeyen dikişlerle dikin. Dikişli yara üzerine iyot dezenfektanı uygulayın. Anesteziyi sonlandırın ve hayvanı ev kafesine geri göndermeden önce iyileşene kadar ısı matı üzerinde bırakın.

Enjeksiyon bölgesindeki omurga dokusu deneyin sonunda incelenecektir. Bu, başarılı enjeksiyon ve transdüksiyonu doğrulamak ve ameliyatın bir sonucu olarak aşırı doku hasarını dışlamak için gereklidir. Rekombinant AAV'nin intraspinal enjeksiyonu ile elde edilebilecek ekspresyon seviyelerini göstermek için, eGFP floresan proteinini kodlayan bir virüs, vahşi tip farelerin lomber omuriliğine enjekte edildi.

Yaklaşık bir milimetre aralıklı üç enjeksiyon, L3 ila L5 lomber omurga segmentlerinde neredeyse sürekli bir enfeksiyon üretti. Omurga yüzeyinden 300 mikron derinlikte virüs enjeksiyonu, omurilik sırt boynuzundaki hücrelerin baskın enfeksiyonuna yol açar. Bununla birlikte, enfekte olmuş hücreler ventral boynuzda da bulunabilir. eGFP'yi eksprese eden cre'ye bağlı bir fleks vektör, GlyT2:Cre transgenik farelerin omuriliğine enjekte edildi.

Bu, GLYT2 pozitif nöronların dağılımını yansıtan daha kısıtlı eGFP ekspresyonu ile sonuçlandı. Bu protokolün ardından, art arda üç omurga segmentinin hedeflenmesine izin verilecektir. Bunun sağlam davranış sonuçları elde etmek için yeterli olduğunu gördük.

Bu teknik, belirli nöron ve hücre popülasyonlarının ve duyusal yolların işlevinin incelenmesine izin verecektir.