Name: Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Öğrenin, fare omuriliğine rAAV enjeksiyonu ile genetik olarak tanımlanmış dorsal boynuz nöronlarını hedeflemeyi. Bu yöntem, ağrı algısındaki nöronal devreleri fonksiyonel olarak incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hanns Ulrich Zeilhofer cömertçe Bu eser destek için teşekkür ederiz. Hendrik Wildner Olga Mayenfisch Vakfı tarafından desteklenmiştir. Carmen Birchmeier Lmx1b antikor için teşekkür ederiz.

<ol><li>Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+downunder%3A+an+update+from+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition downunder: an update from the spinal cord.</a> Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Sandkuhler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+and+mechanisms+of+hyperalgesia+and+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia.</a> Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).</li>
<li>Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+inhibition+in+spinal+sensory+processing+and+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control.</a> Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).</li>
<li>Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+relies+on+a+V2a+propriospinal+internal+copy+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit.</a> Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Early+RET%2B+Deep+Dorsal+Spinal+Cord+Interneurons+in+Gating+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain.</a> Neuron. 91 (6), 1413(2016).</li>
<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Francois, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brainstem-Spinal+Cord+Inhibitory+Circuit+for+Mechanical+Pain+Modulation+by+GABA+and+Enkephalins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins.</a> Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).</li>
<li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Horn+Circuits+for+Persistent+Mechanical+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain.</a> Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).</li>
<li>Petitjean, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Horn+Parvalbumin+Neurons+Are+Gate-Keepers+of+Touch-Evoked+Pain+after+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury.</a> Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+local+and+descending+inputs+for+primary+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons.</a> J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).</li>
<li>Haenraets, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+nociceptive+circuit+analysis+with+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+the+impact+of+serotypes+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters.</a> J Neurochem. , (2017).</li>
<li>Abraira, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+and+Synaptic+Architecture+of+the+Mechanosensory+Dorsal+Horn%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn.</a> Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).</li>
<li>Wildner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+Ptf1a-+and+Ascl1-deficient+mice+reveals+new+markers+for+distinct+dorsal+horn+interneuron+populations+contributing+to+nociceptive+reflex+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity.</a> J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).</li>
<li>Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+injection+of+a+viral+vector+for+conditional+gene+manipulation+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord.</a> J Vis Exp. (73), e50313(2013).</li>
<li>Kohro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+minimally-invasive+method+for+microinjection+into+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn.</a> Sci Rep. 5, 14306(2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gate+control+of+mechanical+itch+by+a+subpopulation+of+spinal+cord+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons.</a> Science. 350 (6260), 550-554 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Gutierrez-Mecinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preprotachykinin+A+is+expressed+by+a+distinct+population+of+excitatory+neurons+in+the+mouse+superficial+spinal+dorsal+horn+including+cells+that+respond+to+noxious+and+pruritic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli.</a> Pain. 158 (3), 440-456 (2017).</li>
<li>Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+boundaries+in+roof+plate+and+choroid+plexus+identified+by+intersectional+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation.</a> Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).</li>
<li>Kim, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+genetically+defined+neurons+to+behavior+through+a+broadly+applicable+silencing+allele%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele.</a> Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).</li>
<li>Kim, J. C., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate-mapping+approaches%3A+new+means+to+explore+the+embryonic+origins+of+the+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus.</a> Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

AAVs kesici enjeksiyon yüksek zamansal ve mekansal çözüm ile spinal hücreleri analizini sağlayan güçlü bir teknik araştırma laboratuvarında hale gelebilir. Bu iletişim kuralı hindlimb için onların periferik aksonlar uzanan duyusal sinir hücreleri tarafından innervated üç ana omurga segmentleri iletim sağlar. Üç transducing sağlam ve tekrarlanabilir davranış veri üretir. Ayrıca mümkün daha geniş bir duyu alanı tek bir kesici enjeksiyon sonra test sağlar. Örneğin, aynı enjeksiyon rejimi pençe test etmek için izin verir (vo...

Dorsal spinal kord çevre vücut ve beyin arasında bilgi değişimi için gerekli olduğunu. Isı, soğuk, gibi duyusal uyaranlara dokunmak veya zararlı uyaranlara hangi nöronlar bu bilgileri omurilik dorsal boynuz, özel çevre nöronlar tarafından tespit edilir. Burada, eksitatör ve inhibitör interneurons karmaşık bir ağ gelen ve sonunda röle duyusal bilgi yolu ile spinal projeksiyon nöronlar supraspinal için1,2siteleri. Omurilik tarafından yapılan hesaplamaları Inter- ve projeksiyon nöronlar kapı duyusal bilgi, böylece hangi bilgilerin bastırılır veya hangi yoğunlukta geçirilen belirleme. Değişiklikleri inhibisyonu ve uyarma, arasında değişen bir denge gibi duyusal uyaranlara entegrasyonundaki aşırı duyarlılık ya da allodynia (normalde non-feci stimülasyon sonra acı hissi) gibi duyusal işlev bozuklukları neden olabilir. Bu değişiklikleri çeşitli kronik ağrı altta yatan neden3,4devletler olduğu düşünülür. Böylece, duyusal işleme yüksek öneme sahip spinal devreleri vardır ve bu nedenle bir canlı çevre ve benlik algısı. Son varış ve moleküler, genetik bir kombinasyonu ve genetik olarak tanımlanan omurga nöron altgrupları kesin manipülasyon sağlar cerrahi teknikleri ile bilim adamları şimdi temel spinal devreleri anlamaya başlıyor farklı duyusal yöntemleri işlenmesi için sorumludur.
RAAV kesici enjeksiyon vahşi-türü veya transgenik fareler içine büyük katkıda bulundu işleme, analiz ve omurilik sinir hücreleri5,6,7, belirli alt kümeleri işlev anlayışı 8 , 9 , 10 , 11. bu teknik teslimat işaretçisi proteinlerin sağlar (GFP gibi / GFP füzyon protein), muhabir proteinler (örneğin, GCaMP) veya (örneğin, bakteriyel toksinler, channelrhodopsin veya pharmacogenetic reseptörleri) efektör proteinler arasında bir dağınık şekilde spinal sinir hücreleri sınırlı şekilde. Cre-bağımlı rAAVs yerel enjeksiyon transgenik fareler Cre recombinase spinal sinir hücreleri belirli alt kümesinde ifade içine ilgili nöronal nüfus belirli analiz sağlar. Biz etiket, ablate, inhibe veya bu gösteren nöronlar onlar ağrı kontrol spinal kapı önemli bir parçası ve iletim7kaşıntı spinal glycinergic etkinleştirmek için bu tekniği istihdam. Bu deneylerde Cre-bağımlı rAAV kesici enjeksiyon GlyT2::Cre fareler içine glycinergic nöronlar lomber spinal kord seçici manipülasyon etkin. Böylece, eş zamanlı glycinergic nöronlar hayvan yaşam için kritik içeren supraspinal devreleri manipülasyon önlenebilir.
RAAVs kesici bir enjeksiyon enjeksiyon sitesine enfeksiyon sınırlar, viral iletim sadece yerel nöronlar zamanda aksonal projeksiyonlar enjeksiyon siteye bağlanmak nöronlar gelişebilir. İkinci kez belirli bir çekirdek beyinde nöronal giriş sağlayan izleme CNS alanları için kullanılır. Zaman nöronlar tanımlanmış nüfusu belirli bir sitede eğitimi aksonal projeksiyonlar enfeksiyon ancak, aynı zamanda bir karıştırıcı faktör olabilir. Bu sorunları çözmek için biz son zamanlarda AAV serotipleri ve serotipleri ve en aza indirmek ya da retrograd iletim en üst düzeye çıkarmak için kullanılan rehberleri tanımlamak için ifade kaset kapsamlı bir analiz yaptık. Omurilik devrelerde bu özel araştırma bağlamında analiz ettik retrogradely dorsal kök gangliyon (DRG), ventromedial rostral medulla (RVM) ve somatosensor korteks nöronlar transduce yeteneği farklı serotipleri ve rehberleri 12. bu protokol için özetlenen teknik bu nedenle enjeksiyon yerinde omurilik sinir hücreleri çözümlemek veya spinal kord enjekte sitenin giriş sağlamak projeksiyon nöronlar analiz etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan protokolünde rAAV üç iğne sol tarafındaki lomber spinal kord içine üç lomber segmentlere (L3-L5) nöron iletimi sağlamak için gerçekleştirilir. L3-L5 kesimleri duyusal girdi çoğunluğu enjeksiyon siteye hindlimb Ipsilateral alırsınız. Böylece genetik olarak etiketli nöron alt türündeki devre işlevi için fonksiyonel kanıt sağlayan fonksiyonel genetik olarak etiketli L3-L5 nöronlarda manipülasyon sağlam davranış değişiklikleri, uyandırmak için yeterli olduğunu ispat.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikropipet çektirme: DMZ-Universal-Elektrot-Çektirme</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>anestezi ünitesi: Oxymat3 oksijen konsantratörü</td><td>Weinmann</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>anestezi ünitesi: VIP 3000 Veteriner Buharlaştırıcı</td><td>Midmark</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Isı matı: Mio Star Thermocare 100</td><td>Migros</td><td></td><td></td>717614700000</tr><tr><td>Elektrikli tıraş makinesi</td><td>Philips</td><td>BT9290</td><td></td></tr><tr><td>cerrahi mikroskop (OPMI pico)</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Küçük hayvan stereotaksik aparatı</td><td>Kopf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Neurostar StereoDrive (isteğe bağlı)</td><td>Neurostar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Model 51690 Cunningham fare omurga adaptörü</td><td>Harvard Aparatı</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr><td>Nanomit Harvard Aparatı ile PHD Ultra şırınga pompası</td><td></td><td>70-3601</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 701 RN 10 & mu; l cam mikrolitre şırınga</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Çıkarılabilir iğne (RN) sıkıştırma bağlantısı 1 mm</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>ince diş hekimliği delme aparatı: Osada başarısı 40</td><td>Osada</td><td>OS-40</td><td></td></tr><tr><td>küresel kesici, 0,5 mm</td><td>Busch</td><td>12001005B</td><td></td></tr><tr><td>elektronik von Frey anesteziyometresi</td><td>IITC</td><td>23905</td><td></td></tr><tr><td>esnek von Frey kılları</td><td>IITC</td><td>#7</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Pascal konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.8 NA & kez; 20 Plan-apokromat objektif</td><td>Zeiss</td><td>NA 1.3</td><td></td></tr><tr><td>NA & kez; 40 EC Plan-Neofluar yağa daldırma objektifi</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cerrahi Aletler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neşter Sapı #4, 13cm</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra İnce Bonn Makas</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Adson forseps, 1 x 2 diş, 12 cm</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeurs, kavisli, 0,7 mm fincan</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #2 laminektomi forseps</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar iğne tutucular, tırtıklı, 8,5 mm kelepçe uzunluğu</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps #5</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments<</td></tr><tr><td>strong>Sarf Malzemeleri ve Kimyasallar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnce duvarlı cam kılcal, 1mm dış çap</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100-3</td><td></td></tr><tr><td>Şırıngalar (1, 5 ve 20 ml)</td><td>B. Braun</td><td>(9166917V, 4606051V, 4606205V)</td><td></td></tr><tr><td>26G eğimli iğne</td><td>B. Braun</td><td>4665457</td><td></td></tr><tr><td>Steril neşter bıçakları</td><td>B. Braun</td><td>BB523</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi sütürler Safil Quick+ 4/0, emilebilir</td><td>B. Braun</td><td>C1046220</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi sütürler Premilene 5/0, emilmeyen</td><td>B. Braun</td><td>C0932191</td><td></td></tr><tr><td>Steril PBS veya salin (%0,9)</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, %70 (dezenfektan)</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>İyot çözeltisi (örneğin Braunol)</td><td>B. Braun</td><td>18380</td><td></td></tr><tr><td>Anestezikler (örneğin Attane izofluran)</td><td>Provet</td><td>2222</td><td></td></tr><tr><td>Aldasorber</td><td>Provet</td><td>333526</td><td></td></tr><tr><td>analjezikler (örn. buprenorfin: temjezik)</td><td>Bireysel</td><td>GTIN: 7680419310018</td><td></td></tr><tr><td>Oftalmik merhem (örneğin vita-pos)</td><td>Pharma medica</td><td>GTIN: 4031626710635</td><td></td></tr><tr><td>Pamuklu çubuklar (örn.</td> <td>itibaren)IVF Hartmann</td><td>1628100</td><td></td></tr><tr><td>Yüz dokuları (örn. itibaren)</td><td>Uehlinger AG</td><td>2015.10018</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus mikroskop slaytları</td><td>ThermoScientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fareler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J fareler (vahşi tip)</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>RRID:IMSR_JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Rorbtm1.1(cre)Hze/J fareler (ROR&beta; Cre)</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>RRID:IMSR_JAX:023526</td><td></td></tr><tr><td>Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J fareleri (R26Tom)</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>RRID: IMSR_JAX:007914</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Viral vektörler</ güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV1. CB7 olarak adlandırılır. CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1. CAG.eGFP)</td><td>Penn Vektör Çekirdeği</td><td>AV-1-PV1963</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1. CAG.flex.eGFP)</td><td>Penn Vektör Çekirdeği</td><td>AV-1-ALL854</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1. CAG.flex.tdTomato)</td><td>Penn Vektör Çekirdeği</td><td>AV-1-ALL864</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1. EF1a.flex.DTA)</td><td>Penn Vektör Çekirdek</td><td>Özel üretim</td><td></td></tr><tr><td>AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))</td><td>Penn Vektör Çekirdek</td><td>Özel üretim</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>44361</td><td></td></tr><tr><td>pAAV.EF1&alpha;. flex.hChR2(H134R)-eYFP</td><td>Addgene</td><td>20298</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDS42</td><td>ScarabGenomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stbl3</td><td>ThermoScientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plazmid Maxi Kiti</td><td>Quiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond PC 500</td><td>Machery & Nagel</td><td>740574</td><td></td></tr><tr><td>klozapin-N-oksit (CNO)</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>BBL-NS105-0025</td><td></td></tr><tr><td>klorokin difosfat tuzu</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>histamin</td><td>Sigma</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>İsim</td><td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Antikorlar (seyreltme)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-GFP (1:1000)</td><td>Moleküler Problar</td><td>RRID:AB_221570</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-NeuN (1:3000)</td><td>Abcam</td><td>RRID:AB_10711153</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Pax2 (1: 200)</td><td>R & D Sistemleri</td><td>RRID:AB_10889828</td><td></td></tr><tr><td>Kobay anti-Lmx1b (1: 10 000)</td><td>Dr Carmen Birchmeier</td><td>Muller et al. 2002</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-GFAP (1: 1000)</td><td>DakoCytomation</td><td>RRID:AB_10013382</td><td></td></tr><tr><td>Eşekte yükseltilen ikincil antikorlar (1:800)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar adeno ilişkili virüs-aracılı transgene ifade

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Omurilik nöronal altgrupları seçici manipülasyon esas olarak iki farklı yöntemlerle elde: 1) Intersectional genetik, mademki ikili ya da üçlü transgenik fareler bir muhabir veya efektör seçici ifade ulaşmak için oluşturulur Gen (örneğin, Rosa26 odağı üzerinden) istenen spinal nüfus. 2) Cre-bağımlı rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV); kesici enjeksiyon Burada seçim muhabir veya efektör gen için kodlama Cre-bağımlı AAV vektörel çizimler Cre recombinase istenen nöronal subpopulation içinde ifade farelerin omurilik içine enjekte edilir. Bu iletişim kuralı Cre-bağımlı rAAV vektörel çizimler oluşturmak açıklar ve nasıl lomber spinal kord dorsal boynuz nöronlarda transduce L3-L5 kesimleri ile rAAVs. L3-L5 innervated hindlimbs duyusal bilgileri iletmek bu çevresel duyusal sinir hücreleri tarafından lomber spinal segmentler kendiliğinden davranış ve enjeksiyon tarafına Ipsilateral hindlimb uygulanan duyusal testler için yanıt olabilir duyusal işleme işlenmiş nöronlarda işlevi sorguya çekmek için analiz. Biz kümelerinden oluşan omurilik sinir hücreleri genetik olarak analiz etmek için bu tekniği nasıl kullanılacağını gösteren örnekler sağlar. Virüs-aracılı transgene ifade Cre transgenik farelerde klasik muhabir fare kaynaklı transgene ifadesine göre başlıca avantajları şunlardır: 1) çeşitli muhabir veya efektör proteinlerin kodlama farklı Cre-bağımlı rAAVs olabilir Böylece birkaç birden fazla transgenik fare satırları oluşturma gereğini üstesinden tek Cre transgenik satır enjekte. 2) kesici enjeksiyon enjeksiyon yeri ve enjeksiyon sonra zaman Cre ifade hücreleri manipülasyon sınırlar. Ana dezavantajları vardır: 1) muhabir gen ifade rAAVs iş daha fazla değişken. 2) cerrahi spinal sinir hücreleri ilgi transduce için gereklidir. İki yöntem daha uygun olduğu ele alınması nöron nüfus ve araştırma soru üzerinde bağlıdır.

Bir işaretleyici protein kodlama rAAV kesici iğne ile elde edilebilir ifade düzeyleri göstermek için ilk AAV1 enjekte. CAG.eGFP lomber spinal kord vahşi tipi farelerin içine. Üç enjeksiyonları aralıklı yaklaşık 1 mm ayrı üretilen lomber spinal segmentler L3 L5 için neredeyse sürekli bir enfeksiyon (şekil 1A-C). Omurilik yüzeyinden 300 µm derinlikte virüs enjeksiyon omurilik dorsal boynuz hücrelerinde baskın enfeksiyon yol açar. Ancak, enfekte...

Recombinase bağımlı rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) kesici enjeksiyon herhangi bir genetik olarak etiketli hücre tipi spinal kord işlemek için kullanılabilir. Burada biz lomber spinal kord dorsal boynuz nöronlarda transduce anlatan. Bu teknik işlenmiş nöron alt türündeki fonksiyonel sorgulama sağlar.

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Rekombinant adeno ile ilişkili virüslerin intraspinal iletiminin genel amacı, dorsal omurilikteki genetik olarak tanımlanmış nöronların histolojik olarak etiketlenmesini ve fonksiyonel manipülasyonunu sağlamaktır. Bu yöntem, farklı ağrı modalitelerinin algılanması için hangi nöronal devrelerin gerekli olduğu gibi ağrı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik olarak etiketlenmiş nöronların özel olarak kısıtlanmış ve zamansal olarak kontrol edilen bir şekilde manipüle edilebilmesidir.Anestezi uygulanmış farenin vertebral kolonu boyunca palpe ederek en kaudal kaburga çiftini bulun. Ardından, sadece rostraldan başlayarak en kaudal kaburga çiftine kadar cilde 1,5 ila 2,5 santimetre uzunlamasına bir kesim yapın. Cildi forseps ile kaldırın ve makasla alttaki kastan ayırın.Ameliyat boyunca, açıkta kalan dokuları steril% 0.9 sodyum klorür ile nemli tutun. İnce forseps ve küçük makas kullanarak, orta hattın hemen yanında, ince zarlı tabakanın yanına bir kesi yapın ve dikenli işlemlerden kesin. Birkaç anatomik dönüm noktası, hedeflenecek doğru omurların belirlenmesine yardımcı olabilir.Burada üç alternatif açıklıyoruz. Vertebral kolon boyunca palpe edin. En kaudal kaburga çifti T13 omurlarının hemen rostral bölgesinde bulunur ve kalça hizasındaki pelvik kemik L6 omurları seviyesindedir.Alternatif olarak, iliak tepeyi ortaya çıkarmak için cildi kuyruğa doğru geri çekin. Aynı seviyede, görünür intetransvers ligamentlerin en kaudal çifti L6 spinal sürecine katılır. İlgilenilen omurları tanımlamak için kaudaldan rostral yöne doğru geriye doğru sayın.Aksi takdirde, vertebral kolonun kenarındaki tendonun en beyaz ve en medial olduğu noktayı bulun. T13 omurları sadece rostral olarak bulunur. Lomber omurilik segmenti L4 bu omurların içinde yer alır.Daha sonra, hayvanı stereotaksik çerçevenin omurga kelepçelerine yükseltmek için kıvrılmış dokulardan oluşan bir yastığın üzerine yerleştirin. Kelepçeleri hedef omurlara bitişik olarak hizalayın. Bir kelepçeyi yerine sabitleyin, ardından ikinci kelepçeyi sabitlerken omur kolonu Adson forseps ile tutun.Hedeflenen omurlara dikkatlice bastırarak uygun kenetlemeyi onaylayın. Ardından, ilgilenilen omurların üzerindeki paraspinöz kası çıkarın. İlk olarak, vertebral kolona paralel tendonların hemen medialinde bir kesi yapın.Ardından, hedef omurlara rostral ve kaudal dik kesiler yapın. Daha sonra, ilgilenilen omurların üzerindeki paraspinöz kası yırtmak veya kesmek için rongeurs kullanın. Omurlar üzerinde veya intravertebral boşlukta duranın üzerinde kalan dokuyu çıkarmak için gerektiği kadar forseps kullanın.Dorsal kan damarı şimdi görünür olmalı ve omuriliğin orta hattını işaretlemelidir. Tek taraflı enjeksiyonlar için, omurların hedef tarafının ortasına çok dikkatli bir şekilde bir delik açmak için 0,5 milimetre küresel kesici ile donatılmış ince bir diş hekimi matkabı kullanarak kısmi laminektomi yapın. Omuriliği ortaya çıkarmak için kalan kemik parçalarını 26 gauge eğimli bir iğne ile çıkarın.Dorsal kan damarının yaklaşık 300 mikron lateralinde, hedef omurlara rostral ve kaudal intravertebral boşluklardaki durayı delmek için iğneyi kullanın. Ardından, delinmiş deliğin altındaki durayı delin. Bu noktada beyin omurilik sıvısı deliklerden kaçmalı ve omurilik hafifçe dışarı çıkmalıdır.Önce cam kılcal damarı mikrolitrelik bir şırıngaya monte ederek enjeksiyon şırıngasını hazırlayın. Sıkı ve güvenli bir şekilde oturduğundan emin olmak için somunu sıkıca sıkın. Mikrolitre şırıngayı steril damıtılmış suyla doldurun, ardından pistona bastırın.Su uçtan kolayca dışarı atılamıyorsa, mikropipet muhtemelen tıkanmıştır ve değiştirilmesi gerekir. Şırıngayı elektronik olarak kontrol edilen bir mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre monte edin. Ardından, suyu ve virüsü ayırmak için yaklaşık bir mikrolitre hava çekmek için mikroenjektörü kullanın.Daha sonra, 2,5 mikrolitrelik bir damla seyreltilmiş virüs solüsyonunu bir parça parafin filmi üzerine pipetleyin. Mikropipetin ucunu sterotaksik çerçeveyi kullanarak dikkatlice damlacığın içine doğru hareket ettirin ve mikropipetin içine çekin. Ardından, uçta bir damla virüs çözeltisi çıkana kadar dağıtıma basın.Şırıngayı geri çekin ve dağıtılan hacmi izlemek için mikropipeti bir ölçekle işaretlemek için bir kalem kullanın. Mikropipetin ucunu duradaki deliklerden birinin üzerinde hareket ettirmek için stereotaksik kolu kullanın ve ardından açıkta kalan omuriliğin yüzeyinde hafif bir çöküntü görünene kadar aşağı doğru hareket ettirin. Enjeksiyonu spinal dorsal boynuza hedeflemek için, dokunun mekanik stabilizasyonunu sağlamak için ucu 100 mikronluk artışlarla 500 mikron derinliğe kadar aşağı ve ardından 200 mikron yukarı hareket ettirin.Ucun son derinliği 300 mikrondur. Pompayı dakikada 50 nanolitre enjeksiyon hızında 300 nanolitre enjekte edecek şekilde programladıktan sonra, infüzyonu başlatmak için başlat düğmesine basın. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, virüs seviyesinin düşüp düşmediğini görmek için mikropipet üzerindeki ölçeği kontrol edin.Basıncın dengelenmesini sağlamak için mikropipeti üç dakika daha yerinde bırakın. Üç dakika sonra, mikropipeti yavaşça geri çekin ve ardından diğer iki enjeksiyon bölgesi için prosedürü tekrarlayın. Son enjeksiyondan sonra, omurga kelepçelerini ve farenin altındaki yastığı çıkarın.Kesi tabakalarını kesintili dikişlerle kapatın, yüzeysel doku tabakalarını emilebilir dikişlerle, cildi ise emilmeyen dikişlerle dikin. Dikişli yara üzerine iyot dezenfektanı uygulayın. Anesteziyi sonlandırın ve hayvanı ev kafesine geri göndermeden önce iyileşene kadar ısı matı üzerinde bırakın.Enjeksiyon bölgesindeki omurga dokusu deneyin sonunda incelenecektir. Bu, başarılı enjeksiyon ve transdüksiyonu doğrulamak ve ameliyatın bir sonucu olarak aşırı doku hasarını dışlamak için gereklidir. Rekombinant AAV'nin intraspinal enjeksiyonu ile elde edilebilecek ekspresyon seviyelerini göstermek için, eGFP floresan proteinini kodlayan bir virüs, vahşi tip farelerin lomber omuriliğine enjekte edildi.Yaklaşık bir milimetre aralıklı üç enjeksiyon, L3 ila L5 lomber omurga segmentlerinde neredeyse sürekli bir enfeksiyon üretti. Omurga yüzeyinden 300 mikron derinlikte virüs enjeksiyonu, omurilik sırt boynuzundaki hücrelerin baskın enfeksiyonuna yol açar. Bununla birlikte, enfekte olmuş hücreler ventral boynuzda da bulunabilir. eGFP'yi eksprese eden cre'ye bağlı bir fleks vektör, GlyT2:Cre transgenik farelerin omuriliğine enjekte edildi.Bu, GLYT2 pozitif nöronların dağılımını yansıtan daha kısıtlı eGFP ekspresyonu ile sonuçlandı. Bu protokolün ardından, art arda üç omurga segmentinin hedeflenmesine izin verilecektir. Bunun sağlam davranış sonuçları elde etmek için yeterli olduğunu gördük.Bu teknik, belirli nöron ve hücre popülasyonlarının ve duyusal yolların işlevinin incelenmesine izin verecektir.

adeno-associated-virus-mediated-transgene-expression-genetically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Smit, RD, et al. Kombine Beyin ve Omurga Cerrahisi Kullanılarak Çift Viral Vektör ile Yenidoğan Sıçanlarda Kortikospinal Sistemin Hedeflenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, yenidoğan bir sıçanda viral vektörlerin kortikospinal nöronlara hedefli olarak verilmesini göstermektedir. Protokol, anterograd ve retrograd viral enjeksiyonlar kullanarak kesin gen ekspresyonunu mümkün kılarak, omurilik yaralanmasını takiben nöral rejenerasyon ve plastisite araştırmalarını kolaylaştırır.

Omurilik Yaralanmasını İncelemek için Yenidoğan Sıçanında Kortikospinal Nöronlara Hedeflenen Viral İletim

Kaynak: Tadokoro, T., et al. Yetişkin Farelerde Subpial Adeno İlişkili Virüs 9 (AAV9) Vektör Dağıtımı. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, farelerde omuriliğe gen iletimi için bir subpial enjeksiyon tekniğini göstermektedir. Prosedür, dura materyalin açığa çıkarılmasını, pia materyalin delinmesini ve floresan protein eksprese eden bir gen taşıyan rekombinant adeno-ilişkili bir virüsün (rAAV) subpial boşluğa enjekte edilmesini içerir. Enjeksiyon ve geri kazanımı takiben virüs, omurilik hücrelerinde gen...

Gen Ekspresyonunu Değerlendirmek için Fare Omuriliğinde Subpial Gen İletimi

Kaynak:Pourshafie, N., et al. Kemirgenlerde nöromüsküler hastalıkları tedavi etmek için rekombinant adeno ile ilişkili virüs serotip 9 kullanılarak mikroRNA'nın sistemik dağıtımı. J. Vis. Uzm. (2018).Bu videoda, spinal ve bulbar kas atrofisi veya SBMA'dan etkilenen bir fare, terapötik mikroRNA'yı kodlayan bir plazmid taşıyan rekombinant AAV (Adeno ilişkili vektörler) vektörlerinin kuyruk veni enjeksiyonuna tabi tutulur. Vektör, mutant AR (Androjen reseptörü)-mRNA'ya (haberci ribonükleik asit)...

Spinal ve Bulbar Kas Atrofisi Fare Modelinde Rekombinant Adeno İlişkili Vektörlerin Enjekte Edilmesi

Viral vektörler hedefli gen manipülasyonu için izin verir. Bu arka boynuzu içine, bir viral vektör stereotaksik enjeksiyon, birincil somatosensoriyel afferentleri ve merkezi sinir sistemi nöronları arasındaki sinaptik bir temas önemli yer kullanılarak, koşullu gen ekspresyonu ya da fare omurilik ablasyonu için bir yöntem göstermektedir.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Bu protokol, duyusal akson rejenerasyonunu incelemek için bir model olarak yetişkin bir sıçanda viral vektör ile bir dorsal kök ganglion (DRG) enjeksiyonunun ve eşzamanlı bir dorsal kök ezilme yaralanmasının kullanımını sunar. Bu model, duyusal akson rejenerasyonunu teşvik etmek için gen terapisinin kullanımını araştırmak için uygundur.

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Bu çalışmanın amacı yetişkin farelerde yeni bir subpial gen dağıtım tekniği kullanarak spinal adeno-ilişkili virüs 9 (AAV9) aracılı gen dağıtımının potensi ve güvenliğini geliştirmek ve doğrulamaktı.

Yetişkin Farelerde Subpial Adeno-ilişkili Virüs 9 (AAV9) Vektör Teslimatı

Fareyi bir geniş ölçekli merkezi sinir sistemi gen teslimi için yöntemleri kaplıdır. Bu örnekte, amacı tüm omurilik etkileyen bir hastalık taklit etmektir. Yaygın iletim bir terapötik protein MSS için bir kerelik, Çevre Yönetimi'nden teslim etmek için kullanılabilir.

Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları

Burada %1 lidokain hidroklorür viral bir çözümde küçük hayvanlar için verimli adeno ilişkili virüs teslim edilmesini sağlamak ve iletim verimliliği merkezi tahmin etmek için bir skorlama sistemi kurmak için bir doğrudan intratekal enjeksiyon tekniği mevcut sinir sistemi geçici zayıflık lidokain tarafından indüklenen derecesine göre.

Rekombinant Adeno ilişkili virüs yetişkin farelerde doğrudan intratekal enjeksiyon

Bu iletişim kuralı retrogradely taşınabilir bir viral vektör enjeksiyon sıçan spinal kord doku içine gösterir. Vektör sinaps kapladığı ve hedef nöron hücre gövdesi nakletti. Bu model önemli spinal yolları veya gen terapisi uygulamaları için hedefleme hücrelerin retrograd izleme için uygundur.

Birden fazla Motor yolları sıçan Spinal Kord Lentiviral bir vektör direkt enjeksiyon vurgulamaktadır

Bu protokol, doğum sonrası yaşlarda yenidoğan sıçanlarda hücrelerin alt popülasyonlarına somatomotor kortekse anterograd kemogenetik modifiye edici ve servikal omuriliğe retrograd taşınabilir bir Cre rekombinaz enjekte ederek gen terapileri uygulamak için yeni bir yöntem göstermektedir.

Yenidoğan Sıçanlarında Kortikospinal Sistemin Kombine Beyin ve Omurga Cerrahisi Kullanılarak Çift Viral Vektörle Hedeflenmesi

Subaraknoid virüs infüzyonu kullanan adeno ilişkili virüsün yaygın olarak verilmesi için yeni bir teknik tanımlanmıştır. Bu yöntem sadece fare neokortikal nöronlarının yüzeysel katmanlarda yaygın olarak transdüksiyonunu sağlamakla kalmaz, aynı zamanda seçici olmayan bir promotör kullanıldığında bile beşinci katman piramidal nöronlarında transgenin seçici ekspresyonu ile sonuçlanır.

AAV2'nin Subaraknoid Enjeksiyonu ile Fare Neokortikal Nöronlarının Yaygın Transdüksiyonu

Öğrenin, fare omuriliğine rAAV enjeksiyonu ile genetik olarak tanımlanmış dorsal boynuz nöronlarını hedeflemeyi. Bu yöntem, ağrı algısındaki nöronal devreleri fonksiyonel olarak incelemek için güçlü bir araç sunar.

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Daha fazla video keşfet