Gümüş nano tanecikleri ve onların antibakteriyel faaliyetleri ve sitotoksik özellikleri değerlendirilmesi ile modifiye çok duvarlı karbon nanotüpler sentezi

Bu prosedürün genel amacı, nanotüpün yüzeylerinde sentezlenen gümüş nanopartiküller ile karbon nanotüplerden oluşan antibakteriyel nanokompleksler üretmektir. Bu yöntem, çeşitli bakteri ve biyofilm türlerine karşı güçlü septik özelliklere sahipken, insanlar için düşük toksisiteye sahip yeni bakteriyel nanomalzemelerin geliştirilmesinde kullanılabilir. Protokol, nanokomplekslerin insanlarla biyo-karşılaştırılabilirliklerini korurken bakterileri yok etmede değerlendirilmesini açıklar.

Prosedüre başlamak için, 50 mililitrelik bir şişeye 30 ila 50 miligram MWCNT yerleştirin. Bir mililitrelik pipet ucu ile donatılmış bir mikropipet kullanarak, MWCNT'lere hacimce üçe bir sülfürik asit ve nitrik asit çözeltisinden sekiz mililitre yavaşça ekleyin. Ekzotermik reaksiyonun bitmesi için 30 dakika bekleyin, ardından MWCNT'ler şişenin dibine yerleşene kadar çözeltiyi 60 ila 80 santigrat derece ve 160 watt'ta sonikleştirin, bu genellikle yaklaşık bir saat sürer.

Karışımı bir santrifüj tüpüne aktarın. Karboksilik asit ile işlevselleştirilmiş MWCNT'lere damla damla dikkatlice 30 mililitre damıtılmış su eklemek için bir mikropipet kullanın ve karışımın gerektiği gibi soğumasını sağlamak için duraklayın. Daha sonra karışımı 12.000 G'de 15 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı, bir mililitrelik pipet ucu ile donatılmış bir pipetle çıkarın. Katıya beş mililitre etanol ekleyin ve şişenin duvarlarını ilave etanol ile durulayın. Karışımı aynı ayarlarla tekrar santrifüjleyin ve süpernatantın pH'ını pH kağıdı ile kontrol edin.

Süpernatan pH nötr olana kadar katıları etanol içinde santrifüjleme ile yıkamaya devam edin, ardından süpernatanı çıkarın ve çökeltiye bir mililitre damıtılmış su ekleyin. Karboksilik asit ile işlevselleştirilmiş MWCNT'leri suya dağıtın ve dispersiyonu vakum altında eksi 60 santigrat derecede dondurarak kurutun. 10 miligram dondurularak kurutulmuş karboksilik asit işlevselleştirilmiş MWCNT'leri 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin.

Tüpe 30 mililitre damıtılmış su ekleyin. Altı mililitre 0.1 normal gümüş nitrat ve 18 mililitre damıtılmış suyu başka bir 50 mililitre konik tüpte birleştirin. Her iki karışımı da bir saat boyunca 60 santigrat derece ve 160 watt'ta sonikleştirin.

Daha sonra, MWCNT dispersiyonunu 60 santigrat derece ve 160 watt'ta sonikleştirirken, gümüş nitrat çözeltisini bir mililitre pipet ucu ile donatılmış bir pipet kullanarak MWCNT dispersiyonuna damla damla ekleyin. Ekleme tamamlandıktan sonra, karışımı bir saat boyunca sonikasyona devam edin, daha sonra karışımı oda sıcaklığında 12.000 G'de 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Gümüş MWCNT'leri 30 dakika boyunca 24 santigrat derecede sonikasyon ile 30 mililitre damıtılmış suda yeniden dağıtın.

Santrifüjlemeyi 30 mililitre damıtılmış suda tekrarlayın ve süpernatantın iki kez uzaklaştırılmasını sağlayın. Daha sonra, yıkanmış gümüş MWCNT'leri beş dakika boyunca sonikasyon ile bir mililitre damıtılmış su içinde dağıtın. Dispersiyona beş mililitre etanol ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında bir saat karıştırın.

Daha sonra karışımı oda sıcaklığında 12.000 G'de 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatantın pH'ını kontrol edin. Süpernatanı çıkarın ve karışımı girdaplama yoluyla beş mililitre etanol içinde yeniden dağıtın. Süpernatan pH nötr olana kadar çökeltiyi santrifüjleme ile etanol içinde yıkamaya devam edin.

Son olarak, yıkanmış gümüş MWCNT'leri bir mililitre damıtılmış suya dağıtın. Dispersiyonu eksi 70 santigrat derecede 24 saat vakum altında dondurarak kurutun ve dispersiyonu kapalı bir kapta saklayın. Testi hazırlamaya başlamak için 18.12 gram R2A agar ve bir litre damıtılmış suyu karıştırın ve otoklavlayın.

Jeli oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Jel dökülmeye hazır olduğunda, 90 milimetrelik Petri kaplarına 10 mililitre jel koyun ve agarın sertleşmesine izin verin. Bir davlumbazda, kültür ortamının yüzeyine 100 mikrolitre bir metilobakteri türü karışımı sürmek için alkol alevinde sterilize edilmiş bir halka ve iğne kullanın.

Bulaşıkları 30 santigrat derecede 48 saat inkübe edin, ardından 3.12 gram R2A suyunu bir litre damıtılmış suyla karıştırın ve ortamı 121 santigrat derecede 15 dakika otoklavlayın. Kolonileri R2A büyüme ortamına aktarmak için sterilize edilmiş bir halka ve iğne kullanın. Numuneyi 30 santigrat derece ve 180 RPM'de çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin.

Optik yoğunluk 0,7'den büyük olana kadar optik yoğunluğu saatte 600 nanometrede ölçün. Ardından, 10 mililitre R2A agar içeren başka bir Petri kabı hazırlayın. Daha sonra 3.12 gram R2A suyu ve sekiz gram agarı bir litre damıtılmış su ile karıştırın.

Karışımı 121 santigrat derecede 15 dakika otoklavlayın. 100 mikrolitre metilobakteri kültürünü agar karışımına karıştırın. Petri kabındaki R2A agarın alt tabakası üzerine 10 mililitre metilobakteri içeren jel dökün, ardından damıtılmış suda istenen dondurularak kurutulmuş gümüş MWCNT konsantrasyonunun bir dispersiyonunu hazırlayın.

Bu dispersiyonun 50 mikrolitresini altıya bir milimetrelik steril bir kağıt diske yüklemek için bir mikropipet kullanın. Kontrol olarak başka bir steril kağıt diske damıtılmış su uygulayın. Her iki diski de UV ışığı altında bir vakum odasında 30 dakika kurutun ve sterilize edin.

Daha sonra gümüş MWCNT örneğini ve kontrolü agar üzerine yerleştirin ve agar plakasını 48 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Bittiğinde gümüş MWCNT numunesinin etrafındaki inhibisyon bölgesini ölçün. Testten önce, otoklavda üçlü damıtılmış suyu 121 santigrat derecede 15 dakika bekletin.

Bu steril suda karboksilik asit işlevselleştirilmiş MWCNT'lerin mililitre başına 1000 mikrogram dispersiyonu ve mililitre başına 50 mikrogram, mililitre başına 40 mikrogram ve mililitre başına 30 mikrogram gümüş MWCNT dispersiyonları hazırlayın. Antibakteriyel test prosedürüne başlamak için, daha önce tarif edildiği gibi bir metilobakteri kültürü hazırlayın ve optik yoğunluğunu 600 nanometrede izleyin. Optik yoğunluk maksimum olduğunda, 100 mikrolitre metilobakteri kültürünü üç mililitre taze R2A kültür ortamına innoküle edin.

Bu çözeltiden 500 mikrolitreyi beş adet 15 mililitrelik konik tüpün her birine yerleştirin. Metanol referans örneğini hazırlamak için tüplerden birine 100 mikrolitre metanol ekleyin. Dört dispersiyonun her biri için aynı şekilde bir numune hazırlayın.

Numuneleri ve kalan metilobakteri kontrol kültürünü, kontrolün optik yoğunluğu maksimum aktiviteyi gösterene kadar 180 RPM ve 30 santigrat derecede inkübe edin. Her numuneyi Petri kaplarında katı R2A agar jeli üzerine yaymak için sterilize edilmiş bir yayıcı kullanın. Bulaşıkları 48 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

Elde edilen bakteri kolonilerini sayın ve minimum bakteriyosidal konsantrasyonu belirleyin. Gümüş MWCNT'ler, tarif edilen prosedür kullanılarak başarıyla sentezlendi. Ortalama biriken gümüş parçacık boyutu yaklaşık 3.83 nanometre idi.

Mililitre başına 50 mikrogram veya mililitre başına 40 mikrogram gümüş MWCNT dispersiyonları ile kültürlendiğinde metilobakteri büyümesi gözlenmedi. Bakteri popülasyonu, gümüş MWCNT'lerin mililitre başına 30 mikrogram dispersiyonu ile kültürlendiğinde kontrol numunesine göre 100.000 kat azaltıldı. Gümüş MWCNT'lerin mililitre başına 10 mikrogram dağılımından hazırlanan bir numunenin etrafında bir inhibisyon bölgesi gözlendi.

Mililitre dispersiyon başına bir mikrogramdan hazırlanan bir numune için herhangi bir inhibisyon bölgesi gözlenmedi. Gümüş MWCNT'lerin mililitre başına 40 mikrogram dispersiyonu eklendiğinde bir miktar sitotoksisite gözlendi. Mililitre başına 30 mikrogram dispersiyon eklendiğinde önemli bir sitotoksisite gözlenmedi.

Bir tripan mavisi tahlili, gümüş MWCNT'lerin mililitre başına 30 mikrogram dispersiyonu eklendiğinde minimum sitotoksisite olduğunu doğruladı. Bu protokol, araştırmacılara doğrudan karbon nanomalzemeleri üzerinde etkili olan metal nanopartiküllere sahip nanokomplekslerin hazırlanmasında yardımcı olacaktır. Bu protokolü takiben, araştırmacılar hazırlanan nanokomplekslerin antibakteriyel özelliklerini de değerlendirebileceklerdi.