RNA müdahale pratik kullanımı: lipozom taşıyıcıları hamamböceği için çift iplikçikli RNA'ın sözlü teslim

Bu protokolün genel amacı, lipozom taşıyıcılarında kapsüllenmiş çift sarmallı RNA'nın oral yoldan alınması yoluyla RNA girişimini kullanarak hamamböceği bağırsaklarındaki gen ekspresyonunu tüketmektir. Bu yöntem, yeni haşere kontrol yöntemlerinin geliştirilmesinde kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin açık alanda temel genleri yıkmak zararlıları öldürebilir mi? Bu tekniğin ana avantajı, lipozomun hedef hücreye iletilmesini sağlamak için gene özgü çift sarmallı RNA'yı korumasıdır.

Prosedürü gösterenler, bir doktora sonrası olan Jia-Hsin Huang ve laboratuvarımdan bir teknisyen olan Yun Liu olacak. Başlamak için, hamamböceklerini üç dakika boyunca hareket etmeyene kadar buz üzerinde uyuşturun. Ardından, ventral tarafına erişmek için başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak bir böcek alın.

Daha sonra, bir arka bacağın bir coxa'sının ucunu coxa ve trokanter arasında kesmek için diseksiyon makası kullanın. Coxa'nın başka bir yerini kesmek, hemolenf koleksiyonları için daha az verimlidir. Şimdi, insizyona 10 mikrolitrelik bir mikropipet yerleştirin ve kanayan hemolenf'i çekerken karnı hafifçe sıkın.

Beş hamamböceğinden gelen hemolenf tek bir mikrosantrifüj tüpüne toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın. Ardından, havuzlanmış hemolenf'i 10 saniye boyunca kısaca döndürün. Daha sonra 10 mikrolitre hemolenfi 50 mikrolitre 1x böcek tuzlu su tamponu ile birleştirin.

Şimdi, hemositleri çözeltiden çıkarmak için seyreltilmiş hemolenfleri 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Son olarak, bir mikro hacimli UV-Vis spektrofotometresi kullanarak toplam protein konsantrasyonunu ölçün ve her bir numunenin konsantrasyonunu mikrolitre başına altı miligram proteine ayarlayın.

Midgut suyunu toplamak için önce hamamböceklerini buz üzerinde uyuşturun. Daha sonra, birini soğuk 1x böcek tuzlu su tamponu ile yüklenmiş bir diseksiyon plakasına aktarın ve ventral tarafı yukarı bakacak şekilde sabitlemek için böcek pimleri kullanın. Şimdi, ince cımbız kullanarak karın bölgesini inceleyin.

Ardından, tüm bağırsağı çıkarın ve 1x böcek tuzlu su tamponu ile taze bir tabağa aktarın. Daha sonra, mahsul ile Malpighian tübülleri arasındaki bölge olan orta bağırsağı izole edin. Bunu yapmak için, hayvanın ön kısmını çıkarın ve arka bağırsağı çıkarın.

Daha sonra, orta bağırsağı hızlı bir şekilde 100 mikrolitre böcek tuzlu su tamponu içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Altı hamamböceğinden orta bağırsakları aynı tüpe toplayın. Ardından, tüpü 10 saniye boyunca girdaplayın.

Daha sonra, hemositleri ve bağırsak dokularını ayırmak için karışımı 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve konsantrasyonu mikrolitre başına altı miligram proteine ayarlayın. Çift sarmallı RNA lipopleksleri, hazırlandıktan sonraki bir saat içinde kullanılmalıdır.

Hazırlanmaları sırasında, seyreltilmiş reaktifin tümünü seyreltilmiş çift sarmallı RNA ile aynı anda birleştirdiğinizden emin olun. Ardından, karışımı hızlı bir şekilde girdap haline getirin ve inkübe edin. Hazır olduğunda, çift sarmallı RNA çözeltisinin dört mikrolitresini kontrol olarak 10 mikrolitre böcek tuzlu su tamponu ile karıştırın veya hemolenf veya orta bağırsak suyundan alınan 10 mikrolitre ekstrakte edilmiş enzim ile karıştırın.

Ardından, iki mikrolitre EGTA ekleyerek enzim inhibe edilmiş bir kontrol yapın. Aksi takdirde, iki mikrolitre RNaz içermeyen su ekleyin. Ardından, numuneleri 25 santigrat derecede bir saat veya daha uzun süre inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, 200 mikrolitre ekstraksiyon reaktifi ve 40 mikrolitre kloroform ekleyin ve ardından girdap yapın. Ardından, numuneleri 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, her bir süpernatantın 150 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın ve 150 mikrolitre izopropanol ekleyerek ve numuneleri buz üzerinde 15 dakika inkübe ederek her numuneden çift sarmallı RNA'yı çökeltin.

İnkübasyondan sonra, numuneleri tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ardından, her pelete 200 mikrolitre %70 etanol ekleyerek ve tüpü santrifüjleyerek RNA peletlerini iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, çift sarmallı RNA peletlerini bir santrifüj vakum yoğunlaştırıcı kullanarak üç dakika kurutun.

Ardından, peletleri 10 mikrolitre RNaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. Son olarak, %1.5'lik bir agaroz jel kullanarak tedavi edilen çift sarmallı RNA'nın bütünlüğünü kontrol edin. Hamamböceklerini günde iki kez, ışıklar açıldıktan bir saat sonra ve ışıklar kapanmadan bir saat önce besleyin.

Bunu ara vermeden sekiz veya 16 gün boyunca yapın. Bu süre zarfında, hamamböceği aksi takdirde sudan mahrum bırakılmalıdır. Beslenme için taze hazırlanmış çift sarmallı RNA lipopleksleri ve çıplak çift sarmallı RNA'yı hazır bulundurun.

Bolus için dört mikrolitre çift sarmallı RNA lipopleksleri veya 250 nanogram çıplak çift sarmallı RNA ile kullanın. Bir hamamböceğini beslemek için önce esnek forseps kullanarak kanatlarından tutun. Hamamböceğinin vücut kısımlarını tutmayın.

Ardından, çözelti damlacığını ağız parçalarına yakın bir yere yavaşça pipetleyin ve hamam böceğinin damlacığı yutmasını izleyin. Son beslemeden sonra, hamamböceklerine su şişeleri sağlayın. Beslenme süresi boyunca, ölüm oranını kontrol etmek için böcekleri günlük olarak değerlendirin ve artık deneyden hareket etmeyen hamamböceklerini çıkarın.

Çift sarmallı küvet lipoplekslerinin sürekli oral uygulaması, orta bağırsaktaki tübülin ekspresyonunu dokuzuncu günde% 40'tan 17. günde% 60'a düşürmeyi başardı. Karşılaştırıldığında, çıplak çift sarmallı RNA'nın hiçbir etkisi yoktu. Bu, büyük olasılıkla, çıplak çift sarmallı RNA'nın orta bağırsak suyuna maruz kalmasının bir saat içinde bozulmaya neden olduğunu, oysa lipozom konjuge çift sarmallı RNA'nın stabil kaldığını bulmasından kaynaklanmaktadır.

Sadece RNA seviyeleri azalmakla kalmadı, aynı zamanda tübülin çift sarmallı RNA lipoplekslerinin sürekli beslenmesi de önemli ölümcüllükle sonuçlandı. Bunun vektörden kaynaklanması olası değildir, çünkü EGFP'ye çift sarmallı RNA taşıyan lipopleksler ölümcüllükle sonuçlanmamıştır. RNA girişiminin bu oral dağıtım sistemini denerken, birkaç gün boyunca çift sarmallı RNA'nın sürekli beslenmesini gerçekleştirmek önemlidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa besleme adımı böcek başına iki dakika içinde yapılabilir. Gerekirse, besleme prosedürünü ve RNAi verimliliğini iyileştirmek için lipozom nanopartiküllerinin farklı formülasyonu uygulanabilir. Sonuç olarak, bu teknik, haşere yönetimi alanındaki araştırmacıların RNAi kullanarak yeni kontrol stratejilerini keşfetmelerini mümkün kılmıştır.