Name: RNA müdahale pratik kullanımı: lipozom taşıyıcıları hamamböceği için çift iplikçikli RNAın sözlü teslim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Öğrenin lipozom taşıyıcılar kullanarak Alman hamamböceği orta bağırsağında RNA müdahalesi ile gen ekspresyonunu azaltma yöntemini. Bu teknik yeni haşere kontrol stratejileri geliştirmek için etkili bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada (Bakanlığı bilim ve teknoloji, en 100-2923-B-002-002-MY3 ve H.J.L. 106-2313-B-002-011-MY3), Tayvan gelen hibe tarafından desteklenmiştir Çek Cumhuriyeti (Grant ajansı South Bohemia Üniversitesi, GAJU vermek 065/2017/P Y.H.L için) ve İspanya ( X.B. ve Katalan hükümet İspanyolca Ekonomi Bakanlığı ve rekabet gücünü, CGL2012-36251 ve CGL2015-64727-P verir 2014 SGR 619 X.B. için vermek); Bu aynı zamanda ekonomik ve bölgesel kalkınma (FEDER fon X.B. için) için Avrupa fonundan mali destek aldı.

1. sentez ve dsRNA hazırlanması
<ol><li>DsRNA hedef siteleri 3' Çevrilmeyen bölgesi hedef genlerin tanımlamak. DsTub α-tübülin (küvet) gen hedefleme için kullanılır (GenBank üyelik numarası: KX228233), ve dsEGFP negatif dsRNA Denetim dizisi tasarlandığı gibi gelişmiş yeşil Floresans protein (EGFP; GenBank üyelik numarası: LC311024).</li>
	<li>DsRNA Şablonlar T7 organizatörü sıra içeren gen özgü astar ile sentezlemek için standart PCR güçlendirme gerçekleştirmek (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). PCR güçlendirme koşulları ve kullanılan astar bilgi bildirilen bu Lin ve arktarafından alıyor. (2017) 12 ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>T7 transkripsiyon kullanarak dsRNA hazırlık ile devam edin (bkz. Tablo reçetesi) Kit, üreticinin yönergeleri izleyin. Not: Yüksek miktar dsRNA verim için iki reaksiyonlar (içinde toplam 40 µL) bir tüp içinde karıştırın ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Dnaz 2 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) dsRNA örnekleri Özet DNA şablonları için 37 ° C'de 15 dakika içine.</li>
	<li>200 µL ayıklama reaktif ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) ve 40 µL kloroform, o zaman girdap.</li>
	<li>13.000 x g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi sonra süpernatant (150 µL) yeni microcentrifuge tüp içinde toplamak.</li>
	<li>DsRNA 150 µL isopropanol ekleyip 15 dakika buzda kuluçka çökelti.</li>
	<li>13.000 x g 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi, sonra süpernatant kaldırın.</li>
	<li>DsRNA granül yıkamak için % 70 etanol 200 µL ekleyin. Santrifüj 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için</li>
	<li>Etanol kaldırmak ve etanol yıkama adımları yineleyin.</li>
	<li>Etanol ve kuru dsRNA pelet tarafından 3 dk santrifüj vakum yoğunlaştırıcıları kaldırın ve sonra dsRNA RNase free su ile resuspend.</li>
	<li>Bir mikro-cilt UV-VIS Spektrofotometre kullanarak saf dsRNA sayısını belirle ( Tablo malzemelerigörmek) için üreticinin yönergelerini according ve istenen konsantrasyonu (örneğin, 0,25 µg/µL hazırlanması için ayarlamak dsRNA lipoplexes).</li>
	<li>DsRNA örnekleri-20 ° C'de 3 aya kadar saklayın.</li>
</ol>2. dsRNA Lipoplexes hazırlanması
<ol><li>Transfection reaktif 4 µL seyreltik ( Tablo malzemelerigörmek) %5 glikoz çözüm 4 µL ekleyerek. DsRNA (1 µg) 4 µL %5 glikoz çözüm 4 µL ekleyerek sulandırmak.</li>
	<li>Seyreltilmiş lipozom reaktif çözüm hemen hepsini birden seyreltilmiş dsRNA çözüm içine ekleyin. Kısaca bunları karıştırın, daha sonra 25 ° C'de 15 dakika kuluçkaya girdap Not: Ters sırada çözümleri birlikte kullanmayın.</li>
	<li>DsRNA lipoplexes kullanıma hazır. Hazırlık 1 saat içinde kullanın ve 1 saat sonra atın. Not: Üreticinin yönergelerine göre lipoplexes en kısa zamanda kullanılmalıdır.</li>
</ol>3. Hemolymph ve Midgut suyu ekstrasellüler enzimler topluluğu
<ol><li>
Böcek tuzlu arabellek (10 x hisse senedi)
	<ol>
<li>900 mL 109.3 g NaCl, 15.7 g KCl, 6.3 g CaCl2ve 8.3 g MgCl2·6H2O. ile Çift Kişilik distile su karışımı</li>
		<li>PH 6.8 için ayarlamak ve 1000 mL doldurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hemolymph koleksiyonu
	<ol>
<li>3 dakikadır hareket değil kadar buz hamamböceği anestezi.</li>
		<li>Hamam böceği (başparmak ve işaret parmağı) iki parmağınızla basılı tutun ve hamamböceği ventral tarafında sesini aç.</li>
		<li>Arka bacak coxa ihbar kesmeye diseksiyon makas kullanın. Not: Coxa ve trochanter arasında bağlı kavşak kesti. Coxa diğer kısmı eksizyon hemolymph toplamak için daha az verimli.</li>
		<li>Karın orta parmağınızla hafifçe sıkmak ve kesi 10 µL micropipette ile gelen kanama hemolymph toplamak.</li>
		<li>Üzerinden birkaç Hamam böcekleri (5 kişi) bir microcentrifuge tüp hemolymph havuz. Not: Microcentrifuge tüpler melanization önlemek için buz üzerinde tutun. Ortalama erkek Hamam böceği elde edilen hemolymph 2-3 µL birimdir.</li>
		<li>Spin hemolymph kısa bir süre için 10 benchtop santrifüj ile s.</li>
		<li>Hemolymph (Yani, 10 µL) istenen hacmi aktarmak ve 1 x böcek tuzlu arabellek 50 µL ile karıştırın.</li>
		<li>Santrifüj 1000 x g hemocytes spin 4 ° c de 10 dakika. Süpernatant temiz microcentrifuge tüp aktarın.</li>
		<li>Bir mikro-cilt UV-VIS Spektrofotometre A28015ölçerek kullanarak toplam protein konsantrasyonu ölçmek.</li>
		<li>Her örnek aynı protein konsantrasyonu (6 mg/µL toplam protein) için ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Midgut suyu toplama
	<ol>
<li>Buzda hamamböceği anestezi. Hamamböceği ventral yan diseksiyon plaka üzerinde böcek iğne kullanarak soğuk 1 x böcek serum fizyolojik ile tampon düzeltmek.</li>
		<li>Karın iyi cımbızla incelemek. (Ön, orta ve arka bağırsak dahil) tüm gut böcek tuzlu arabellek x 1 ile taze bir yemek için kaldırın.</li>
		<li>Ve hızlı bir şekilde transfer midgut 100 µL böcek tuzlu arabellek içeren bir microcentrifuge tüp ön ve arka bağırsak çıkarın.</li>
		<li>Aynı tüp ve 10 için girdap altı hamamböceği üzerinden midguts havuz s.</li>
		<li>Santrifüj 1000 x g aşağı belgili tanımlık hemocytes ve bağırsak dokularında dönmeye 4 ° c de 10 dakika. Süpernatant temiz microcentrifuge tüp aktarın.</li>
		<li>Bir mikro-cilt UV-VIS Spektrofotometre A28015ölçerek kullanarak toplam protein konsantrasyonu ölçmek.</li>
		<li>Her örnek aynı protein konsantrasyonu (6 mg/µL toplam protein) için ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. dsRNA bozulması tahlil
<ol><li>Taze çıplak dsRNA veya dsRNA lipoplexes (1 µg) 4 µL hazırlayın.</li>
	<li>DsRNA çıkarılan çözümlerle böcek tuzlu arabelleği (kontrol), 10 µL enzimler hemolymph veya midgut suyunu karıştırın.</li>
	<li>EGTA (20 mM) ya da RNase free su örnekleri enzim aktiviteleri inhibisyonu için denetimler olarak ayırmak için 2 µL ekleyin.</li>
	<li>1 saat veya daha uzun (6, 12 veya 24 saat) 25 ° C'de için kuluçkaya</li>
	<li>200 µL ayıklama reaktif ve 40 µL kloroform, sonra girdap ekleyin.</li>
	<li>13.000 x g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi sonra süpernatant (150 µL) yeni microcentrifuge tüp içinde toplamak.</li>
	<li>DsRNA 150 µL isopropanol ekleyip 15 dakika buzda kuluçka çökelti.</li>
	<li>13.000 x g 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi, sonra süpernatant kaldırın.</li>
	<li>DsRNA granül yıkamak için % 70 etanol 200 µL ekleyin. Santrifüj 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için</li>
	<li>Etanol kaldırmak ve etanol yıkama adımları yineleyin.</li>
	<li>Etanol ve kuru dsRNA pelet tarafından 3 dk. Resuspend dsRNA RNase free 10 µL suyla için santrifüj vakum yoğunlaştırıcı kaldırmak.</li>
	<li>% 1.5 özel jel üzerinde Jel Elektroforez ile tedavi dsRNA bütünlüğünü denetleyin.</li>
</ol>5. sözlü dsRNA İdaresi
<ol><li>Kuru gıda (köpek yemi) bir ad libitum diyet Hamam böcekleri korumak. Bir gün önce dsRNA yenmesi deneyler hamamböceği su kaynağından mahrum.</li>
	<li>Hamam böceği tarafından kapma kanat esnek forseps (şekil 1, Adım 5) ile tutun. Not: Hamam böceğinden vücut parçaları kapmak değil.</li>
	<li>Çıplak dsRNA yanı sıra dsRNA lipoplexes beslenmesi için 2 bölümünde açıklandığı gibi hazırlayın. Not: DsRNA lipoplexes taze besleme önce hazırlanmalıdır.</li>
	<li>DsRNA lipoplexes ya da çıplak dsRNA 4 µL besleme (250 ng) ile bir micropipette.</li>
	<li>Yavaş yavaş dsRNA çözüm damlacık Hamam böcekleri ağız için kapatın ve hamamböceği izin damlalıklı tamamen damlacığı yutmayın.</li>
	<li>Sindirim denemeleri 8 gün veya 16 gün sürekli olarak günde iki kez (1 h sonra ışıkları ve ışıkları önce 1 h) gerçekleştirir. Not: Tüm hamamböcekleri manuel dsRNA çözüm veya denetim reaktifleri ile (örneğin, nükleaz boş su, glikoz çözüm ve lipozom reaktif) sindirim deneyler sırasında beslenme yoluyla su satın aldı.</li>
	<li>Su şişeleri Hamamböceklerine sindirim dsRNA deneyler 16 gün sonra sağlar.</li>
</ol>6. nakavt değerlendirmek
<ol><li>Seçilen zaman puan (2, 9 ve 17 gün sonra dsRNA yenmesi tahlil), dsEGFP ve dsTub tedavi böcekler toplamak ve seçilen doku (örneğin, midgut) incelemek.</li>
	<li>Nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirin. Lin ve arktarafından belirlendiği şekilde astar bilgi ve qRT-PCR güçlendirme koşulları. (2017) 12.</li>
	<li>Denetim ve mortalite denetlemek ve artık hareket ediyor hamamböceği kaldırmak için dsRNA tedavi böcekler her gün değerlendirmek.</li>
</ol>

<ol><li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicing+and+slicing%3A+The+core+machinery+of+the+RNA+interference+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway.</a> FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/journal/19376448/312">International Review of Cell and Molecular Biology</a>. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).</li>
<li>San Miguel, K., Scott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+insecticides%3A+dsRNA+is+stable+as+a+foliar-applied+insecticide%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide.</a> Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).</li>
<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).</li>
<li>Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+efficiency%2C+systemic+properties%2C+and+novel+delivery+methods+for+pest+insect+control%3A+What+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far.</a> Front. Physiol. 7, (2016).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).</li>
<li>Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+a+cDNA+encoding+extracellular+dsRNase+and+its+expression+in+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).</li>
<li>Wynant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+functional+characterization+and+phylogenetic+analysis+of+double+stranded+RNA+degrading+enzymes+present+in+the+gut+of+the+desert+locust%2C+Schistocerca+gregaria%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).</li>
<li>Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+hypertrehalosemic+hormone+receptor+in+relation+to+hemolymph+trehalose+and+to+oxidative+stress+in+the+cockroach+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica.</a> Exp. Endocrinol. 2, 114(2012).</li>
<li>Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+permethrin+susceptibility+by+glutathione+S-transferase+%28BgGSTD1%29+in+the+German+cockroach+%28Blattella+germanica%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica).</a> J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).</li>
<li>Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+taiman+in+insect+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">A role for taiman in insect metamorphosis.</a> PLOS Genet. 10, 1004769(2014).</li>
<li>Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-2+family+regulates+insect+metamorphosis+by+controlling+the+juvenile+hormone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).</li>
<li>Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+dsRNA+lipoplexes+to+German+cockroach+protects+dsRNA+from+degradation+and+induces+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response.</a> Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).</li>
<li>Gharavi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+cationic+polyamines+for+chiral+microcapsules+and+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).</li>
<li>Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingested+double-stranded+RNAs+can+act+as+species-specific+insecticides%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+responses+of+migratory+locusts+to+systemic+RNA+interference+via+double-stranded+RNA+injection+and+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding.</a> Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).</li>
<li>Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+BmToll9-1+and+RNAi+machinery+genes+to+exogenous+dsRNA+in+the+midgut+of+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori.</a> J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).</li>
<li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+mosquito+and+mosquito-borne+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control.</a> Insects. 8, 4(2017).</li>
<li>Taning, C. N. T., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10340-016-0736-9">Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages.</a> J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).</li>
<li>Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+systems+for+in+vivo+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Lipidic systems for in vivo siRNA delivery.</a> AAPS J. 11, 639-652 (2009).</li>
<li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).</li>
<li>Xia, Y., Tian, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+properties+on+liposomal+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery.</a> Biomaterials. 79, 56-68 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı için dsRNA lipoplexes, sözlü teslim yoluyla etkili RNAi Alman Hamam böceği midgut suyu ribonükleaz sindirim karşı koruma içeren bir yöntem sunuyor. Böcek türleri diğer çalışmalarda gösterildiği gibi zavallı RNAi etkisi dsRNA sözlü teslim yoluyla çoğunlukla için dsRNA8,9,10bozulması tarafından muhasebeleştirilir. Bu iletişim kuralı oral teslimat dsRNA gut düşmesine karşı koruyucu araçlar olarak hizmet lipozomla...

RNAi döngüsünün birçok Ökaryotlar1dsRNA moleküller tarafından tetiklenen bir çoğu silencing bir mekanizma aracılığıyla devirme gen ekspresyonu için etkili bir yöntem olarak kanıtlanmıştır. Çalışmanın son on yıldır, RNAi enjeksiyon yoluyla belirli genlerin ifade tüketen ve/veya çeşitli takson böcekler2,3dsRNA, besleme için davranış geliştirme genlerin fonksiyonları eğitim için yararlı bir araç haline gelmiştir. Özgüllük ve sağlamlık tüketen etkisi nedeniyle, uygulama, RNAi şu anda haşere kontrol yönetimi4,5için potansiyel bir strateji olarak kabul ediliyor. Ancak, RNAi verimliliğini yaygın hedef farklı genler ve teslim yöntemleri bağlı olarak böcek türler arasında değişir. Kanıt büyüyen bir vücut dsRNA, ribonükleaz tarafından bozulmuş, istikrarsızlık RNAi5,6sınırlı etkinliği kritik bir faktör olduğunu göstermektedir. Örneğin, Manduca sexta düşük RNAi duyarlılık hemolymph ile karışık dsRNA 1 saat7içinde hızlı bir şekilde bozulmuş gerçeği açıkladı. Benzer şekilde, verimli bir şekilde alınan dsRNA düşürebilir, alkalin enzimler içinde midgut varlığı kuvvetle farklı böcek sipariş8,9,10düşük RNAi verimlilik ile ilişkilidir.
DsRNA oral teslimat RNAi uygulamada bir haşere kontrol stratejisi için özellikle ilginç, ancak midgut enzimler tarafından dsRNA bozulma geri zekalı bir yöntem henüz, hangi etkili sağlamak için potansiyel var geliştirilmiştir değil RNAi besleme yoluyla. Ancak, RNAi yanıt alamama durumu dsRNA oral teslimat için dsRNA, örneğin 50 µg Bombiks moriiçinde büyük miktarda besleme veya 8 gün (Toplam 8 µg dsRNA) keçiboynuzu türler için sürekli besleme tarafından bildirilmiştir. Alman Hamam böceği, Blattella germinica, RNAi için son derece hassas dsRNA11,12,13,14enjeksiyonu ile ama besleme yoluyla dsRNA yanıt vermiyor. Son zamanlarda, Lin vd. (2017) dsRNA nakavt için başarılı RNAi lipozom taşıyıcıları sonuçlarında ile α-tübülin gen ekspresyonu midgut ve tetikleyici önemli mortalite Alman Hamam böceği15kapsüllenmiş olduğunu göstermiştir. DsRNA midgut içinde bozulma sözlü RNAi için sınırlayıcı bir faktör olduğu gibi lipozom taşıyıcıları bozulması, kolayca diğer böcekler gut güçlü nükleaz faaliyetleri ile ilgili olan dsRNA korumak için bir araç olarak hizmet vermektedir. Dikkat, belirli transfection reaktif seçtiğiniz için nedeni, lipozom gemisi geçerli protokol bu böcek hücre satırı transfection için daha az toksisite ile test edilmiş olduğu gibi biz kullanılan ( Tablo malzemelerigörmek) göre prosedürü yerine getirin. Gharavi ve ark. farklı lipozom transfection sistemlerinde karşılaştırma göre (2013) 16, transfecting küçük müdahale RNA (siRNA) verimliliğini yaklaşık bu ve diğer böcekler17,18 dsRNA dağıtım sistemleri için kullanılan piyasada bulunan diğer sistemleri arasında aynıdır . Ayrıca, bizim besleme yöntemi dsRNA uygun miktarda her hamamböceği tarafından yutulur ve sonuçları sağlam ve onaylanan emin olmak dikkatli olduğunu. Özet olarak, dsRNA lipoplexes kullanarak dsRNA istikrar geliştirir ve gelecekte haşere kontrolü için umut verici bir yaklaşım olduğu tasarım RNAi, strateji oral teslimat için kapıyı açar mevcut iletişim kuralı ve sonuçları göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA in vitro Transfeksiyon reaktifi</td><td>Lipoplex hazırlama için</td><td>SignaGen</td><td>SL100499</td></tr><tr><td>Blend Taq plus</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>PCR</td>Hızlı SYBR Green Master Mix için <td>BTQ-201</td></tr><tr><td></td><td>ABI&nbsp;</td><td>3</td> 'UTR tanımlaması <td>için qPCR</td></tr><tr><td>FirstChoice RLM-RACE Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td> için <td>4385612&nbsp;</td></tr><tr><td>DSRNA sentezi için</td> <td>MEGAscript T7 Transkripsiyon Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td><td>dsRNA'dan DNA şablonunu çıkarın</td></tr><tr><td>dsRNA veya toplam RNA ekstraksiyonu için</td><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td></tr><tr><td>RQ1 RNaz İçermeyen Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td>, <td>toplam RNA&nbsp'den DNA şablonunu çıkarın;</td></tr><tr><td>kloroform&nbsp;</td><td>dsRNA veya toplam RNA ekstraksiyonu için</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td></tr><tr><td>dsRNA veya toplam RNA ekstraksiyonu için</td><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td></tr><tr><td>dsRNA veya toplam RNA ekstraksiyonu için</td><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td></tr><tr><td>Dietil pirokarbonat,</td><td>RNaz içermeyen su hazırlama</td>glikoz çözeltisi için DEPC <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Lipoplex hazırlama için G3285</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür, NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>böcek tuzlu su tamponu formülü</td></tr><tr><td>Potasyum klorür, KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>böcek tuzlu su tamponu formülü</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür, CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>böcek tuzlu su tamponu formülü</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat, MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>böcek tuzlu su tamponu formülü</td></tr><tr><td>EGTA ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>enzim inhibitörü ve nbsp;</td></tr><tr><td>diseksiyon makası</td><td>FST</td><td></td><td>hamam böceği diseksiyon</td></tr><tr><td>ince cımbız</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>hamam böceği diseksiyon</td></tr><tr><td>esnek cımbız</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>hamamböceği tutma&nbsp;</td></tr><tr><td>pipetman</td><td>RAININ</td><td>P10</td><td>numune hazırlama</td></tr><tr><td>mikrosantrifüj tüpü</td><td>Axygen</td><td>MCT175C, PCR02C</td><td>numune hazırlama</td></tr><tr><td>pipet ucu&nbsp;</td><td>Axygen</td><td></td><td>numune hazırlama</td></tr><tr><td>vortexter</td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td>numune hazırlama</td></tr><tr><td>Minispin santrifüj</td> Sıvı döndürme için <td>Gruffin Group</td><td>GMC 206</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>ALC</td><td>PK121R</td><td>numune hazırlama</td></tr><tr><td>pH metre&nbsp;</td><td>pH ayarlı</td>mikro hacimli spektrofotometre için <td>JENCO</td><td>6071</td></tr><tr><td></td><td>Quawell</td><td>Q3000</td><td>nükleik asit kantitatif</td></tr><tr><td>PCR Termal döngüleyici</td><td>ABI&nbsp;</td>Şablon PCR için <td>2720</td><td>veya&nbsp; dsRNA sentezi inkübasyonu&nbsp;</td></tr><tr><td>kantitatif gerçek zamanlı PCR</td><td>ABI&nbsp;</td><td>StepOne artı</td><td>gen ekspresyonu kantitatif</td></tr><tr><td>Santrifüj Vakum Konsantratörleri</td><td>dsRNA veya toplam RNA ekstraksiyonu için</td><td>eppendorf</td><td>5301</td></tr><tr><td>Multipette&nbsp;</td><td>Gerçek zamanlı PCR numune yükleme için</td> <td>eppendorf</td><td>xstream</td>&nbsp;</tr><tr><td>Nükleik asit elektroforezi</td>için <td>Agarose I</td><td>amresco</td><td>0710</td></tr><tr><td>küvet gen specfifc ileri preimer</td><td>tri-I biyoteknoloji</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>küvet gen specfifc ters preimer</td><td>tri-I biyoteknoloji</td><td></td><td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td></tr><tr><td>dsTub şablonu ileri astar</td><td>tri-I biyoteknoloji</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA ETİKETİ GGA CAA GCC GGA GTG CAG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsTub şablonu ters astar</td><td>tri-I biyoteknoloji</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA ETİKETİ GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsEGFP şablonu ileri preimer</td><td>tri-I biyoteknoloji</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA ETİKETİ GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG</td></tr><tr><td>dsEGFP şablonu ters preimer</td><td>tri-I biyoteknoloji</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA ETİKETİ GGT GGC GGA TCT TCT TGA AGT TCA</td></tr><tr><td>CC küvet qPCR ileri astar</td><td>tri-I biyoteknoloji</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT</td></tr><tr><td>GGC küvet qPCR ters preimer</td><td>tri-I biyoteknoloji</td><td></td><td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td></tr><tr><td>ef1 qPCR ileri primer</td><td>tri-I biyoteknoloji</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td></tr><tr><td>ef1 qPCRters preimer</td><td>tri-I biyoteknoloji</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td></tr></tbody></table>

rna müdahale pratik kullanımı: lipozom taşıyıcıları hamamböceği için çift iplikçikli rna'ın sözlü teslim

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA müdahale (RNAi) biyolojik fonksiyonları çok sayıda gen açığa çıkarmak için yaygın olarak uygulanan ve bir haşere kontrol aracı temel gen ekspresyonu bozulma tarafından işletim olarak öngörülen. Besleme ve iliklerine kadar enjeksiyon gibi farklı yöntemler çift iplikçikli RNA (dsRNA) başarılı teslimi için bildirilmiş olan, RNAi verimliliği oral dsRNA teslimini aracılığıyla farklı böcek grupları arasında son derece değişken olsa da. Alman Hamam böceği, Blattella germanica, birçok çalışma daha önce Yayınlanan tarafından gösterildiği gibi dsRNA, enjeksiyon için son derece hassas olur. Bu da çalışmanın lipozom gemileri ile kapsüllü dsRNA dsRNA bozulma midgut suyu tarafından geri zekalı için yeterli olduğunu ispat yöntemi açıklanır. Özellikle önemli ölçüde lipozomlar tarafından kapsüllü dsRNA sürekli besleme midgut tübülin ifadede azaltır ve hamamböceği ölümüne yol açtı. Sonuç olarak, formülasyonu ve dsRNA enzimler karşı korumak, dsRNA lipoplexes kullanımı pratik kullanımı RNAi Böcek ilaçlama için gelecekte olabilir.

İletişim kuralı dsRNA oral teslimat için basitleştirilmiş bir düzeni nereye dsRNA lipoplexes hazırlanması için önemli adımlar gösterilir şekil 1' de sunulmuştur.
B. germanica, dsTub lipoplexes midgut suyu ile inkübe nerede yapılmıştır bir ex vivo tahlil ve dsRNA bütünlüğünü midgut suyu dsRNA bozulması üzerine lipozom taşıyıcıları tarafından verilen koruma araştırmak için daha sonra...

Bu el yazması Almanca hamamböceği lipozomlar içinde kapsüllü çift iplikçikli RNA'ın sözlü sindirim yoluyla gen ifadesinin içinde midgut tükenmesi gösterir.

RNA müdahale pratik kullanımı: lipozom taşıyıcıları hamamböceği için çift iplikçikli RNA'ın sözlü teslim

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

Bu protokolün genel amacı, lipozom taşıyıcılarında kapsüllenmiş çift sarmallı RNA'nın oral yoldan alınması yoluyla RNA girişimini kullanarak hamamböceği bağırsaklarındaki gen ekspresyonunu tüketmektir. Bu yöntem, yeni haşere kontrol yöntemlerinin geliştirilmesinde kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin açık alanda temel genleri yıkmak zararlıları öldürebilir mi? Bu tekniğin ana avantajı, lipozomun hedef hücreye iletilmesini sağlamak için gene özgü çift sarmallı RNA'yı korumasıdır.Prosedürü gösterenler, bir doktora sonrası olan Jia-Hsin Huang ve laboratuvarımdan bir teknisyen olan Yun Liu olacak. Başlamak için, hamamböceklerini üç dakika boyunca hareket etmeyene kadar buz üzerinde uyuşturun. Ardından, ventral tarafına erişmek için başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak bir böcek alın.Daha sonra, bir arka bacağın bir coxa'sının ucunu coxa ve trokanter arasında kesmek için diseksiyon makası kullanın. Coxa'nın başka bir yerini kesmek, hemolenf koleksiyonları için daha az verimlidir. Şimdi, insizyona 10 mikrolitrelik bir mikropipet yerleştirin ve kanayan hemolenf'i çekerken karnı hafifçe sıkın.Beş hamamböceğinden gelen hemolenf tek bir mikrosantrifüj tüpüne t

practical-use-rna-interference-oral-delivery-double-stranded-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

RNA girişim gen fonksiyonu analiz etmek için çok etkili olduğu...

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Burada larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri / kitosan kullanımı yoluyla hastalık taşıyıcıları sivrisinek gen fonksiyonunun inhibe edilmesine müdahale için bir prosedür tarif eder.

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Dermestes maculatus

Bu makalede damar doku bitkiler için RNA müdahale (RNAi) böcekler besleme phloem sap ile çift iplikçikli RNA (dsRNA) oral teslimat için geliştirilen roman tekniklerini gösterir.

Phloem ve Hemipteran böcekler bitki su besleme RNA müdahale ikna etmek için çift iplikçikli RNA Oral teslim yöntemleri

Bu iletişim kuralı biz standart ve birkaç yıl boyunca belirli miktarda nükleik asitler, sivrisinekler ve evi sinekler hemolymph doğrudan teslim etmek için kullanılan bir mikroenjeksiyon metodoloji açıklar. Bu iletişim kuralı en az enjeksiyon mortalite sonuçları ve ilişkili doz ölçümleri verimlilik sağlar.

Tekrarlanabilir dsRNA mikroenjeksiyon ve Oviposition Bioassay sivrisinekler ve evi sinekler

RNA paraziti, gen ekspresyonunu belirli gelişimsel evrelerde manipüle etmek için yaygın olarak uygulanabilir ve güçlü bir tekniktir. Burada, sudalış böceği Thermonectus marmoratusbu tekniğiuygulamak için gerekli adımları açıklar , gen dizilerinin edinimi gelen yapı veya davranışı etkileyen genlerin yıkılması.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

Caenorhabditis elegans'ta rutin olarak kullanılan RNA girişimi (RNAi) için bir dağıtım yöntemi olan bakteriler tarafından üretilen dsRNA'nın oral yoldan uygulanması, burada yetişkin sivrisineklere başarıyla uygulanmıştır. Yöntemimiz, enjeksiyon kullanmadan sağlam ters genetik çalışmalarına ve iletimi engelleyen vektör çalışmalarına izin verir.

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

Mevcut protokol, P. americana'daki RNAi operasyon teknikleri için adım adım kılavuzları açıklamaktadır.

Amerikan Hamamböceğinde RNA Girişiminin Uygulamaları

Burada sunulan, ipekböceği Bombyx mori larvalarında yutma yoluyla gen susturmayı indüklemek için kitosan/dsRNA nanopartikül dağıtımı için bir protokoldür.

İpekböceği Bombyx mori'de Chitosan/dsRNA Nanopartikül Dağıtımı ile Larva RNA Girişimi

Bu yöntem, Gaussia lusiferaz (GLuc) geni içeren lineerize edilmiş bir plazmidden hem kaplı hem de kaplanmamış mRNA'nın yüksek verimli in vitro sentezini tanımlamaktadır. RNA saflaştırılır ve kaplanmamış RNA'nın bir kısmı Vaccinia virüsü kaplama enzimi kullanılarak enzimatik olarak kaplanır. Son adımda, mRNA HeLa hücrelerine transfekte edilir ve hücre kültürü süpernatantları lusiferaz aktivitesi için analiz edilir.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

Öğrenin lipozom taşıyıcılar kullanarak Alman hamamböceği orta bağırsağında RNA müdahalesi ile gen ekspresyonunu azaltma yöntemini. Bu teknik yeni haşere kontrol stratejileri geliştirmek için etkili bir araçtır.

RNA müdahale pratik kullanımı: lipozom taşıyıcıları hamamböceği için çift iplikçikli RNA'ın sözlü teslim

Daha fazla video keşfet