Multicopy plazmid rolü antibiyotik direnci gelişimi test

Bu deneysel yöntemin genel amacı, antibiyotik direncinin evriminde multikopya plazmitlerin rolünü test etmektir. Bu yöntem, bakteriyel yeniliklerin evriminde multikopya plazmitlerin rolü gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, sadece temel moleküler biyoloji yöntemleri ve basit bir deney tasarımı gerektirmesidir.

Bu gerçekten harika. İlk olarak, denklem tarafı ATTB'de lambda fajındaki kromozomdaki antikor direnç genini taşıyacak e coli MG1655 suşunu oluşturun. Bunu yapmak için, PCR, ATTB sahasının her iki tarafındaki 500 baz paralong bölgesini amplifiye eder.

Daha sonra PCR, antibiyotik direnç genini çoğaltır. Ardından, homoloji bölgelerini PCR ürününe kaynaştırmak için 30 dakika boyunca 50 santigrat derecede izotermal düzenek kullanın. İzotermal montajdan sonra, ürünün bir mikrolitresini 40 mikrolitre elektroyetkin MG1655 hücresine iki milimetrelik bir küvete aktarın.

Daha sonra hücreleri 4 santigrat derece ve 2,5 kilovoltta elektropoze edin. Elektroporasyondan sonra, hücreleri %0.2 arabinoz ile bir mililitre LB suyuna aktarın. Daha sonra LB et suyu içeren hücreleri bir mikrofüj tüpüne pipetleyin.

Tüpü 30 santigrat derecede iki saat boyunca yoğun bir şekilde çalkalayın. İki saat sonra, antibiyotiklerle desteklenmiş LB agar plakası üzerine 100 mikrolitre kültür plakası. Sonra kalan hücreleri aşağı doğru döndürün.

Ve peleti 100 mikrolitre taze LB suyunda tekrar askıya alın. Bu hücreleri başka bir LB agar plakasına yeniden yerleştirin. Daha sonra plakaları gece boyunca 42 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, PCR, harici primerler ybhC extern ve ybhB extern kullanarak yapıyı doğrulamak için klonları çoğaltır. Ardından, agaroz kabuğu elektroforezi yoluyla amplikon boyutunu onaylayın. Paralel olarak, eklenen genin dizisini doğrulamak için DNA dizilimi yapın.

Multikopi plazmidde antikor direnç genini taşıyacak suşu oluşturmak için, önce PCR antibiyotik direnç geni blaTEM-1'i çoğaltır. PCR tamamlandıktan sonra, amplifiye edilmiş ürünü T4 polinükleotid kinaz kullanarak fosforile edin. Ardından, PBAD plazmid omurgasını PCR amplifiye etmek için yüksek kaliteli polimeraz ve oligonükleotidler PBAD FINV ve PBAD RINV kullanın.

Daha sonra iki PCR fragmanını T4 ligaz kullanarak bağlayın. Daha sonra, 40 mikrolitre DH5 alfa hücrelerini 1 mikrolitre ligasyon ürünü ile elektropore edin. Daha sonra agar plakaları üzerindeki antibiyotik direnç geni ve plazmit omurgası için uygun antibiyotiği seçin.

Ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak plazmit ekstraksiyonu gerçekleştirin. Daha sonra, evrim deneylerinden önce herhangi bir olası mutasyonun olmadığını doğrulamak için ilgilenilen direnç geninin sanger dizilimini gerçekleştirin. Dizinin doğrulanmasından sonra, son olarak MG1655 suşunu taşıyan plazmidi elde etmek için e coli suşu MG1655'teki plazmiti elektropore edin.

Bu protokoldeki en kritik adımlar, model sistem suşlarının inşası ve deneysel evrim sırasında gözlemlenen mutasyonların yeniden yapılandırılmasıdır. İlk olarak, ilgilenilen MG1655 suşlarını LB agar plakalarına sürün. Daha sonra 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre LB ortamı ekleyin.

Daha sonra, her bir suşun 48 izole kolonisini plakanın ayrı oyuklarına aşılayın. Aşılamadan sonra, plakayı gece boyunca dakikada 200 devirde bir çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Yine, kurucu popülasyonla birlikte her bir kuyudan iki mikrolitre kültür, ayrı ayrı kuyucuklarda 198 mikrolitre LB ortamı içeren yeni bir 96 kuyu plakasına aşılayın.

Bu, evrimsel kurtarma deneyini başlatacaktır. Plakayı 37 santigrat derecede 20 saat boyunca dakikada 200 devirde bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Her gün, antibiyotik konsantrasyonunu bir önceki güne göre iki katına çıkarın.

Ertesi gün, ilgili kültürün 2 mikrolitresini taze 96 kuyulu plakaya aktarın ve buna her gün devam edin. Optik yoğunluk okumasını 600 nanometrede tek tek kuyucuklardan bir plaka okuyucuya kaydedin. Protokolün kritik bir adımı, deneysel evrim ve artan antibiyotik konsantrasyonlarıdır.

Antibiyotik konsantrasyonlarının değişim hızı, antibiyotik direncinin gelişimini teşvik etmek için değiştirilebilecek parametrelerden biridir. Yine, plakayı 20 saat boyunca dakikada 200 devirde bir çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, plaka okuyucuda her gün hayatta kalan her popülasyon için 600 nanometrede optik yoğunluk okumasını ölçün.

Popülasyonları her üç ila beş günde bir periyodik olarak dondurun. Evrimleşmiş popülasyonlardan toplam DNA'yı ve farklı suşlardan ve tedavilerden klonları çıkarın. Ardından, DNA'nın kalitesini belirlemek için spektrofotometrede 260:280 ve 260:230 nanometredeki absorbans oranlarını ölçün.

Daha sonra bir floresan DNA bağlayıcı boya kullanın ve plaka okuyucudaki floresanı ölçerek DNA'nın konsantrasyonunu onaylayın. Ek olarak, DNA bozulması veya RNA kontaminasyonu olmadığını doğrulamak için DNA'yı agaroz jel elektroforezine tabi tutun. Ardından, antibiyotik direncinin genetik temelini incelemek için tüm popülasyonlardan ve bireysel klonlardan elde edilen örneklerle derin DNA dizilimi gerçekleştirin.

Bu çalışma, üç e coli suşu kullanan deneysel sistemin olası sonuçlarına bir örnektir. Bu suşlar, MG1655 resA kromozomunda direnç genini taşıyan e coli MG1655, MG1655 ve multikopi plazmid MG1655 pRESA'da direnç genini taşıyan MG1655'tir. Kullanılan antibiyotikler seftazidim ve meropenemdir.

Bu sol panel, artan seftazidim konsantrasyonları altında hayatta kalma eğrilerini göstermektedir. Grafikten, MG1655 pRESA suşunun popülasyonunun alt kümesinin, her gün seftazidim konsantrasyonunu iki katına çıkardıktan sonra bile 14 günden fazla büyüyebildiği açıktır. Aksine, diğer suşlar benzer konsantrasyonlarda seftazidim konsantrasyonlarına maruz kaldıklarında 8 günden fazla hayatta kalamazlar.

Bununla birlikte, aynı suşlar, başka bir antibiyotik olan meropenemin benzer konsantrasyonuna maruz kaldıklarında hayatta kalma süresinde önemli farklılıklar göstermez. Her üç suş da meropeneme maruz kaldıklarında sadece 6 ila 8 gün arasında hayatta kalır. Bu, multikopya plazmidde resA geninin varlığının, seftazidime karşı direncin evrimini güçlendirdiğini, ancak meropeneme olmadığını gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, tam deney protokolü, uygun şekilde yapılırsa birkaç hafta içinde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bakterilerdeki yeniliklerin evriminde çok kopyalı plazmitlerin rolünü nasıl araştıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.