Sıvı işleme bir yüksek üretilen iş ileri kimyasal genetik ekran Arabidopsis thaliana yapmak için Robot kullanımı en iyi duruma getirme

Bu protokolün genel amacı, Arabidopsis fideleri üzerinde yüksek verimli ileri kimyasal genetik taraması yapmaktır. Bu yöntemle, bitki fizyolojisini etkileyen yeni küçük molekülleri verimli ve etkili bir şekilde keşfedebiliriz. Bu keşifler, hücre duvarı sentezi gibi fizyolojik süreçlere yönelik daha ileri çalışmalar için temel sağlayacaktır.

Bu tekniğin temel avantajı, on binlerce küçük molekülün kısa sürede taranabilmesidir. Bu protokol model bitki türü Arabidopsis için tasarlanmış olsa da, böcekler, mikroorganizmalar veya hücre kültürü gibi diğer organizmalara kolayca uyarlanabilir. Bu protokol fikri ilk olarak, üniversitenin genomik merkezinin fazla sıvı işleme robotu için bir ev bulması gerektiğini öğrendiğimizde aklımıza geldi.

Hemen ellerinden almak için gönüllü olduk. Seyreltme kitaplığını ve Çok Kanallı Uç Yıkama Otomatik Laboratuvar Yazılımı Konumlandırıcısını veya ALP'yi metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. İstifleyici karuseline bağlı İstifleyici 10'ları manuel olarak yükleyin.

A'dan D'ye kadar olan otellerde, önce Birinci Odaya bir kutu AP96 P20 pipet ucu yükleyin. Ardından, iki üst plaka sipariş edilen kitaplıktan stok konsantrasyonlarını içeren ve diğer iki alt plaka boş olacak şekilde İki ila Beş Arasındaki Odalara dört adet 96 kuyulu V-alt plaka yükleyin. Ek olarak, Altıncı Odaya bir kutu AP96 P20 pipet ucu yükleyin.

Dört adet 96 kuyulu V-tabanlı plakayı, sipariş edilen kitaplığın stok konsantrasyonlarını içeren iki üst plaka ve iki alt plaka boş olacak şekilde Yedi ila Dokuzuncu Odalara yükleyin. P3'te rezervuarda 300 mililitre su, P300'de 70 mililitrelik %7 etanol banyosu, Uç Yükleyici ALP ve Çok Kanallı Uç Yıkama ALP ile güverteyi kurun. Sıvı işleme robotunun işletim yazılımını kullanarak, İstifleyici 10'dan AP96 P20 pipet uçlarını sunun ve bunları Uç Yükleyici ALP'ye taşıyın.

Otel A'dan İkinci Odayı sunun ve güvertedeki dört adet 96 oyuklu V-alt plakayı ayırın, alttaki ikisini P4 ve P8'e ve üstteki ikisini P5 ve P9'a yerleştirin. AP96 P20 pipet uçlarını Uç Yükleyici ALP ile 96 kanallı 200 mikrolitrelik kafaya yükleyin. 300 mililitrelik su haznesinden 90 mikrolitre aspire edin ve P4 üzerindeki 96 oyuklu V-tabanlı seyreltme plakasına dağıtın. P8'deki plaka için adımı tekrarlayın. 5 mikrolitreyi üç kez tekrar tekrar aspire ederek ve dağıtarak P15 üzerindeki kimyasal kitaplık plakasını karıştırın. Ek olarak, P5 üzerindeki kimyasal kütüphane plakasından 10 mikrolitre aspire edin ve 10 mikrolitreyi P4 üzerindeki seyreltme plakasına dağıtın. Plakanın çözeltilerini P4 üzerinde, 50 mikrolitreyi toplam üç kez tekrar tekrar aspire ederek ve dağıtarak karıştırın.

Karıştırdıktan sonra, AP96 P20 pipet uçlarını P7'den 70 mikrolitre %70 etanol aspire ederek ve dağıtarak temizleyin, ardından bunları dört kez %110 hacimde su aspire ederek ve dağıtarak Çok Kanallı Uç Yıkama ALP'de yıkayın. P8 ve P9'daki ikinci plaka çifti için bu adımları tekrarlayın. İkinci 96 oyuklu V-dip seyreltme plakasını oluşturduktan sonra, P9, P5, P8 ve P4 plakalarını aşağıdan yukarıya doğru bu sırayla istifleyin. Ardından, yığını boş bir statik ALP'ye yerleştirin.

P1, P2, P6, P10, P11, P12 veya P13 kullanın. Otel A'daki Beşinci Oda boşalana kadar bu adımları tekrarlayın, ardından Altıncı Odaya ulaştığınızda, yeni AP96 P20 pipet uçlarını Uç Yükleyici ALP'ye taşıyarak ve kullanılmış AP96 P20 pipet uçlarını boş bir statik ALP'ye yerleştirerek işlemi yeniden başlatın. Otel A'nın 9 numaralı odası boşalana kadar işlemi tekrarlayın.

Otel B'ye devam etmek için, güvertedeki plakalar ve uçlar Otel A'ya yeniden yüklenmelidir.Robot denetimsiz çalışabilmesine rağmen, her seyreltme döngüsünden sonra su rezervuarını yeniden doldurmak gerekir. Döngü yetersiz su ile yeniden başlarsa, robot havayı aspire eder ve kimyasallar seyreltilmez. 300 mililitrelik su haznesini manuel olarak doldurun.

Bilgisayar programı, bu mesajı detaylandıran bir duraklama içerebilir ve kullanıcının bir sonraki adımı gerçekleştirmeden önce Devam'a basmasını gerektirir. Kalan üç Otel için seyreltme adımlarını tekrarlayın. Ortama 100 mililitre başına 0.1 gram yoğunlukta manuel olarak tohum ekleyin.

Bu yoğunluk, 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına ortalama 3-10 tohum ile sonuçlanır. Hotel A'nın Birinci ve İkinci Odalarına dört adet 96 kuyulu düz tabanlı plakayı manuel olarak yerleştirin.Tip Yükleyici ALP'ye bir kutu AP96 P250 pipet ucu, P3'te ortam-tohum karışımıyla doldurulmuş 300 mililitrelik bir rezervuar ve P7'de %70 etanol ile doldurulmuş 300 mililitrelik bir rezervuar yerleştirin. İşletim yazılımını kullanarak, Otel A'daki Birinci ve İkinci Odaları sunun ve dört tabaktan oluşan yığınları ayırın. Boş statik ALP'lerin her birine bir plaka yerleştirin, ardından AP96 P250 pipet uçlarını 96 kanallı 200 mikrolitrelik kafaya yükleyin.

P3 üzerindeki 300 mililitrelik ortam tohumu rezervuarından 90 mikrolitre aspire edin ve ilk 96 oyuklu düz alt plakaya dağıtın. Sekiz plakanın tümü ortam-tohum karışımını içerene kadar bu işlemi tekrarlayın. AP96 P250 pipet uçlarını, P7 üzerinde %70 etanol ile doldurulmuş 300 mililitrelik rezervuardan 70 mikrolitre aspire ederek ve dağıtarak temizleyin. Uçları Çok Kanallı Uçta yıkayın ALP'yi %110 hacimde su aspire ederek ve dağıtarak dört kez yıkayın, ardından uçları TL1'de boşaltın.

Son olarak, plakaları elinizle toplayın. Bir kutu AP96 P250 pipet ucunu Hotel A'nın Birinci Odasına manuel olarak yükleyin.Ayrıca, iki adet 96 oyuklu V-dipli seyreltme kitaplık plakasını İki, Dört, Altı ve Sekizinci Odalara yükleyin. İki adet 96 kuyulu düz tabanlı eleme plakasını Üç, Beş, Yedi ve Dokuzuncu Odalara yükleyin.

İşletim yazılımını kullanarak, güverteyi P7'de 300 mililitre %70 etanol içeren bir yıkama rezervuarı içerecek şekilde yapılandırın. Ortam-tohum rezervuarı P3'te güvertede bırakılabilir. Ek olarak, Çok Kanallı Uç Yıkama ALP'den su dolaştırmak için cihaz denetleyicisinin bağlantısı aracılığıyla konsol sürücüsünü açın. Bu, protokolün sonunda otomatik olarak kapanacaktır. Hotel A'dan AP96 P250 pipet ucu kutusunu sunun ve Uç Yükleyici ALP'ye taşıyın.

Ardından, Otel A'nın İkinci Odasından güverteye 96 oyuklu V-dip seyreltme kitaplık plakalarını sunun. Bir plakayı statik ALP P4'e ve bir plakayı P8'e yerleştirin. Ardından, Otel A'nın Üçüncü Odasından 96 kuyulu düz tabanlı eleme plakalarını güverteye sunun. Bir plakayı statik ALP P5'e ve diğerini P9'a yerleştirin. AP96 P250 pipet uçlarını Tip Yükleyici ALP ile 96 kanallı 200 mikrolitrelik kafaya yükleyin.

96 oyuklu V-alt seyreltme plakasını P4 üzerinde 50 mikrolitreyi üç kez aspire ederek ve dağıtarak karıştırın. Bunu takiben, bu plakadan 10 mikrolitre aspire edin ve P5'teki 96 oyuklu düz tabanlı tarama plakasına dağıtın. 50 mikrolitreyi üç kez aspire edip dağıtarak plakadaki çözeltileri P5'te karıştırın. AP96 P250 pipet uçlarını, P70'deki rezervuardan 70 mikrolitre %7 etanol aspire ederek ve dağıtarak etanol ile temizleyin. Ardından, uçları Çok Kanallı Uç Yıkama ALP'de %110 hacimde su aspire ederek ve dört kez dağıtarak yıkayın.

İkinci 96 oyuklu V-dip seyreltme kitaplık plakası ve 96 oyuklu düz tabanlı tarama plakası için bu adımları tekrarlayın. İki adet 96 oyuklu V-dipli seyreltme kitaplık plakasını ve iki 96 oyuklu düz tabanlı tarama plakasını birlikte istifleyin. Plakaları statik ALP'lere taşıyın.

Ardından, işlemi üç kez tekrarlayın ve eleme plakalarına toplam sekiz kez seyreltilmiş kimyasallar ekleyin. Son olarak, görsel onay yoluyla tarama plakalarının her bir oyuğundaki tohum sayısını kontrol edin. Sterilize edilmiş ve vernalize edilmiş tohum ekleyerek kuyuları üçten az tohumla destekleyin.

Fidelerin büyüdüğü ortamın kurumamasını sağlamak çok önemlidir, çünkü bu zayıf çimlenmeye neden olacaktır. Fide içeren plakalar yüksek nemde tutulmalı veya kurumaya dayanıklı kaplarda saklanmalıdır. 96 oyuklu düz tabanlı eleme plakalarını, kurumaya dayanıklı bir kapta 16/8 aydınlık / karanlık döngüsünde 22 santigrat derecede bir çevre odasında dört gün boyunca inkübe edin.

96 oyuklu düz tabanlı tarama plakalarını diseksiyon mikroskobu altında görselleştirin ve daha fazla araştırma için tüm anormal fenotipleri kaydedin. Normal ve anormal fenotiplere örnek olarak, görünür morfolojik anormalliklerin olmaması, kahverengi kök kılları, bodur kök, ciddi bodur kök, ağartılmış, yeşil müsilaj, eksik çimlenme ve çimlenme olmaması verilebilir. Yüzdeye göre görünür fenotipler bir pasta grafikte görüntülenir.

Fideler kök morfolojisi, pigmentasyon, kök kılları ve çimlenmede anormallikler sergiledi. Ayrıca, yeşil müsilaj üretimini de içeren çeşitli diğerleri de dahildir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, büyük ileri kimyasal genetik ekranların verimliliğini ve doğruluğunu büyük ölçüde artırabilir.

Bu prosedürü denerken, tohumu sterilize etmeyi ve vernalize etmeyi, seyreltme adımları sırasında su haznesini yeniden doldurmayı, numunelerin kurumaya dayanıklı kaplarda saklandığından ve tüm görüntülemenin düz tabanlı plakalarda yapıldığından emin olmayı unutmamak önemlidir. Araştırmak istediğiniz fizyolojik sürece bağlı olarak, bu ilk ekran, her bir kimyasalın etki şeklini belirlemeye yardımcı olmak için ek tahlillerle takip edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, kimyasal bir genetik ekranın verimliliğini ve doğruluğunu artırmak için bir sıvı işleme robotunun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.