Bir Protein Mikroarray tahlil antijen spesifik antikor yanıt aşağıdaki Clostridium difficile enfeksiyon serolojik belirlenmesi için

Bu yöntem, Clostridium difficile enfeksiyonu için klinik olarak yararlı immünoterapilerin hastaya özgü bir şekilde optimize edilmesine ve seçilmesine ve Clostridium difficile'ye karşı insan immün yanıtlarının aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, C. difficile antijenlerine karşı çoklu izotip ve suş spesifik antikor yanıtlarının doğru ve eşzamanlı olarak ölçülmesini sağlamasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edeceklerdir çünkü yüksek oranda saflaştırılmış antijenlerden oluşan bir panelin kurulması ve optimize edilmesinde ve teknolojik platformun kurulmasında uzmanlık gereklidir.

Mikrodalga plakasının hazırlanmasında yer alan metodolojik liste türleri, dizilerin yazdırılması, güvenli bir prosedür ve veri analizi ayrıntılara dikkat gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Prosedürün bir kısmını göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Sam Greenwood tarafından yapılacak. Başlamak için, Clostridium difficile antijenlerini ve baskı tamponunu optimum konsantrasyona seyreltin.

Daha sonra, 10 mikrolitre antijen çözeltisini 384 oyuklu bir plakaya aktarın. Plakayı bir plaka contası ile örtün ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca yerçekiminin 300 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Mikrodizi yazdırma için, silikon PIN'i her biri iki saniye boyunca üç kez ısıtmak için elde tutulan bir gaz brülörü kullanın.

Ardından, silikon PIN'i her biri üç saniye boyunca temiz suda üç kez durulayın. Mikrodizi plakasını bir dizileyicinin yükleme kartuşuna yerleştirin. Tepsiyi çıkarın ve ardından amino silan slaytlarını sürgülü tepsiye yerleştirin ve vakumu açmak için OK düğmesine basın.

Tüm slaytların güvenli olduğundan emin olun ve Tamam'ı tıklatın. Tepsiyi başlangıç noktasına geri koyun ve kapağı kapatın. Ardından, uygun programı başlatın ve Dosya'ya, ardından Mikro Dizi Parametreleri'ne ve ardından Aç'a gidin. Tüm antijenleri dörtlü olarak yazdırmak için Clostridium difficile dosyasını seçin.

Bu pencerenin altında, örnek depolamayı belirtmek için Kaynak sekmesini ve mikrodizi ayrıntılarını girmek için Hedef sekmesini açın. Ardından, yıkama aletini seçmek için Seçenekler sekmesini açın. Çalıştırma Tercihleri'nin Genel sekmesi altında, TAS uygulama paketi araç çubuğunda, Çalıştırmanın başlangıcında Yıka'yı ve Çalıştırmanın sonunda yıka'yı seçin.

Klima sekmesini açın ve nem seviyesini %55 ila %60 arasında ayarlayınŞimdi çalıştırmayı başlatın ve düzgün çalıştığından emin olmak için dizileyiciyi periyodik olarak kontrol edin. Yazdırdıktan sonra, yazdırılan slaytları 16 çok kuyulu hazneli bir slayt tutucuya dikkatlice yerleştirin. Ardından her bloğa 100 mikrolitre %5 BSAT ekleyin.

Slaytları örtün ve çalkalayarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Her bloğu beş kez, her biri bir dakika boyunca çalkalanarak yıkamak için 120 mikrolitre PBST kullanın. Daha sonra, C difficile ile enfekte hastalardan ve sağlıklı kontrollerden elde edilen serum örneklerini 20 dakika boyunca buz üzerinde çözdürün.

Ana bloğa ticari olarak temin edilebilen antikor seyreltici ekleyin ve ardından ana bloğa örnekler ekleyin ve karıştırın. Yıkama tamponunu atın ve deney bloklarına her seyreltilmiş numuneden 100 mikrolitre ekleyin. Negatif kontrol bloğu için, sadece antikor seyrelticiden 100 mikrolitre ekleyin.

Ardından, slaytları hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, her bloğu her biri üç dakika boyunca beş kez çalkalanarak yıkamak için 120 mikrolitre PBST kullanın. Daha sonra her bloğa antikor seyreltici ile seyreltilmiş 100 mikrolitre biyotinile keçi anti-İnsan antikoru ekleyin.

Slaytları örtün ve hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Her bloğu beş kez, her biri üç dakika boyunca çalkalanarak yıkamak için 120 mikrolitre PBST kullanın. Daha sonra, her bloğa bir ila iki bin oranında,% 5 BSAT içinde seyreltilmiş 100 mikrolitre streptavidin SY5 konjugatı ekleyin.

Slaytları folyo ile örtün ve hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Slaytları önce 120 mikrolitre PBST ile her biri bir dakika boyunca beş kez yıkayın ve ardından PBS ile her biri bir dakika boyunca iki kez daha yıkayın. Slaytları kurutmak için, yerçekiminin 300 katı ile beş dakika döndürün.

Isınmasını sağlamak için taramadan 30 dakika önce lazer tarayıcıyı açın. Ardından, plaka ışığı sabit yeşile dönene kadar slaytı, yazdırılan yüzey yukarı bakacak şekilde tarayıcıya yerleştirin. Ardından, Ayarlar düğmesine basın.

İlk sekmede, Otomatik kaydırma ve Barkod'un işaretli olmadığından emin olun. Ardından, Piksel boyutunu 10'a, Tarama Modu'nu Orta'ya, Alım'ı yalnızca 635'e, Edinme Modu'nu Manuel'e, kazancı 20'ye ve gücü düşük olarak ayarlayın. İkinci sekmede, slayt türünün etiketsiz olduğundan emin olun.

Üçüncü sekmede, Odak ayarını Otomatik odaklama olarak ayarlayın. Taranan görüntüyle ilişkilendirilmiş uygun dizi listesini seçmek için ızgarayı içe aktar düğmesine basın. Ardından, ızgarayı slayttaki noktalarla hizalamak için otomatik bul düğmesine basın.

Son olarak, her noktanın floresan yoğunluğunu ölçmek için Miktar Belirleme İşlemi düğmesine basın. Ardından, daha fazla analiz için sonuçları uygun bir formatta kaydedin. Bu protokolde, bu iki teknik arasındaki tekrarlanabilirliği değerlendirmek için bir protein mikrodizisi ELISA ile karşılaştırılır.

Spearman korelasyon katsayısı analizi, serum örneklerinde IgG, Anti-toksin A ve Anti-toksin B seviyelerini tespit etmek için mikroarray ve ELISA arasında anlamlı bir uyum olduğunu göstermektedir. Protein mikro dizisinin giriş testi ve testler arası tekrarlanabilirliği, yedi hastanın serum örnekleri kullanılarak hesaplandı. Toksin A, Toksin B, SLP001, SLP002, SLP027, Toksin B'den sadece CCUG suşu üreten Toksin B'ye karşı iki farklı dizi slaytı üzerinde analiz edilen numuneler ve pCDTb antijenleri iyi tekrarlanabilirlik ortaya koymaktadır.

Clostridium difficile toksinlerine karşı izotipe özgü bir antikor tepkisini tespit etmek için bir protein mikrodizisi gerçekleştirilir. Hastaların ve sağlıklı bireylerin serum örnekleri, sadece suş ifade eden bir Clostridium difficile Toksin B'den Toksin A, Toksin B, Toksin B'ye karşı IgG ve IgA seviyelerini ve ikili toksinin bir B fragmanının öncü formunu tespit etmek için kullanılır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yedi saat içinde yapılabilir.

Kalite kontrol deneyi, numuneler çalıştırılmadan önce uygun yüzey kimyasının seçimi, baskı tamponları, bloke edici tamponlar ve serum numunelerinin ve ikincil antikorların seyreltilmesi gibi farklı parametreler değerlendirilmelidir. Yüksek kaliteli bir dizi yazdırmak, parametrelerin yazdırılmasını deneysel protokole göre ayarlamak için dizinin veya yazılımın iyi bir şekilde anlaşılmasını gerektirir. Deney boyunca dizileyicinin optimum performansını ve tozsuz bir ortamı korumak çok önemlidir.

Bu teknik, immünoloji ve moleküler biyoloji alanındaki araştırmacıların, enfeksiyona karşı humoral immün yanıtları karakterize etmesi ve serodiagnostik antijenleri keşfetmesi açısından önünü açacaktır. Enfekte kan örnekleri ve bakteriyel toksinlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Genel olarak laboratuvarda bu işlem yapılırken güvenlik ve standart önlemler her zaman göz önünde bulundurulmalıdır.