Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Bu analitik tekniğin genel amacı, bakterisidal ilaç konsantrasyonlarına ulaşılıp ulaşılmadığını belirlemek için tüberküloz pulmoner lezyon doku bölmeleri içindeki anti-tüberküloz ilacı etambutolü'nü ölçmektir. Bu yöntem, uygulanan ilaçların tüm granülom dokusu kompartmanları içindeki sterilizasyon konsantrasyonlarında bakteri popülasyonlarına ulaşıp ulaşmadığını belirleyerek tüberküloz ilaç keşfi ve geliştirilmesi alanındaki sorulara cevap verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, belirli doku yapıları ve hücre popülasyonları içinde yüksek uzamsal ayrıntıda ilaç konsantrasyonlarının tam olarak ölçülmesini sağlamasıdır.

Doku kontaminasyonu potansiyeli ve membran slaytlarının kırılgan doğası nedeniyle doku kesitleme ve montaj adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi doku toplama ile başlayın. Doku kesitini almak için önce kriyostatı istenen kesme sıcaklığına ayarlayın.

Gama ışınlı akciğer biyopsisini eksi 80 santigrat derece depodan kriyostata aktarın ve doku sıcaklığını dengelemek için 30 dakika bekletin. Cımbız kullanarak, dokunun tabanını aynaya yapıştırmak için az miktarda optimum kesme sıcaklığı yapıştırıcısı kullanarak biyopsiyi kriyostat aynasına sabitleyin. Dokuyu, düz yüzey kesim için açıkta kalan yüzey olacak şekilde yönlendirin.

OCT'nin doku yüzeyini kirletmediğinden emin olun, çünkü bu, sonraki kütle spektrometresi analizine müdahale edebilir. 25 mikron kalınlığında üç doku kesiti kesin ve PET membran slaytlarına monte edin. Membranı doku bölümüne hafifçe dokundurun ve bölümü çıkarın.

Çok fazla basınç uygulanırsa, ince zar yırtılabilir. PET membranı şarj etmemek ve doku bölümünün yapışmasını azaltmamak için montajdan önce sürgünün aşırı tutulmasından kaçının. Çözülme montajını ve dokunun zara başarılı bir şekilde yapışmasını sağlamak için zar sürgüsünü oda sıcaklığında tutun.

Slaytı kriyostattan çıkarın ve sürgünün üç dakika boyunca kurumasını bekleyin. LCM-LC-MS/MS hemen gerçekleştirilmeyecekse, slaytı hava geçirmez sızdırmaz küçük bir torbaya kapatın ve diseksiyon için gerekli olana kadar eksi 80 santigrat derece depoya aktarın. Bitişik bir bölümü 10 ila 12 mikronda kesin ve hematoksilen ve eozin boyama için standart bir cam slayt üzerine çözdürün.

İstenen diğer histokimya lekeleri için bu sırada ek bölümler kesilebilir. Slaytı içeren kapalı torbayı eksi 80 santigrat derece saklama alanından çıkarın ve beş dakika oda sıcaklığına ulaşmasını bekleyin. Soğuk slayt hemen laboratuvar atmosferine maruz kalırsa, doku yoğuşma ile kaplanır ve ilacın mekansal bütünlüğü tehlikeye girebilir.

Mikroskobu ve lazeri açın. Kesimin başlayabilmesi için lazerin ısınması için beş ila 10 dakika gerekir. Düz kapaklı 0.20 mililitre PCR tüplerini tutucuya yükleyin.

Slaytı çantadan çıkardıktan sonra, düz yataklı bir tarayıcı kullanarak PET slayt üzerindeki doku bölümünün optik görüntüsünü alın. Sürgüyü, doku tarafı aşağı bakacak şekilde sürgü tutucuya yerleştirin. Mikroskop yazılımını kullanarak ilgilenilen belirli granülom bölgelerine ayrı toplama tüpleri atayın.

Tipik olarak, bunlar tutulumsuz akciğer, hücresel granülom ve kazeum olacaktır, ancak granülom biyopsisinin spesifik patolojisine bağlı olarak değişebilir. 5X mikroskop objektifini kullanarak dokuya odaklanın. Bu büyütme, hem hücresel hem de nekrotik granülom alanlarını içeren dokuya iyi bir genel bakış sağlamalıdır.

Yazılımda, dokunun altındaki konumuna hareket ettirmek için tüp olarak belirlenen kazeumu seçin. İstenen diseksiyon parametrelerini girin. 25 mikron kalınlığındaki bir akciğer bölümü için tipik ayarlar lazer gücü 30, hız 15 ve açıklık 35'tir.

Ancak bunlar, kullanılan mikroskoba ve lazerin yaşına bağlı olarak potansiyel azalma gücüne bağlı olarak değişecektir. Serbest Çizim aracını seçin ve bir fare veya dokunmatik ekran kalemi kullanarak diseksiyon için istenen bölgeyi ana hatlarıyla belirtin. Bölgenin yüzey alanı yazılımda görüntülenecektir.

Daha kolay diseksiyonu kolaylaştırmak için seçilen bölgeleri 500.000 mikron karenin altında tutun. Tüp kapağında toplam üç milyon mikron kare toplanana kadar diseksiyonu tekrarlayın. Bazen, diseke edilen bölge çevredeki zara yapışmış kalabilir ve toplama kapağına düşmeyebilir.

Yazılım içinde manuel olarak seçip kaldırarak bu bölgeleri kümülatif yüzey alanı toplamından kaldırın. Daha sonra, hücresel lezyon için kapağı seçin ve aynı işlemi kullanarak üç milyon mikron kare doku toplayın. Tutulmamış akciğer için kapağı seçin ve aynı işlemi kullanarak üç milyon mikron kare doku toplayın.

Tutulmamış akciğer dokusunun birçok bronşiyol ve alveolar boşluk içerdiğini unutmayın. Bunların diseksiyon için tanımlanan doku bölgelerinden çıkarılmasına dikkat edin. Kapak tutucuyu çıkarın ve her bir tüpün klipsini dikkatlice açın, kapatın ve etiketleyin.

Diseke edilen dokuları çevredeki hava rahatsızlıklarından koruyun. Diseke edilen dokuları hemen analiz edin veya eksi 80 santigrat derecede saklayın ve işleme ve LC / MS analizinden önce çözün. Doku yoğunluğunun mililitre başına bir gram olduğunu varsayarsak, 50 miligram kontrol dokusunu tartarak ve seyreltmek için PBS tamponu ekleyerek homojenat stoğunu hazırlayın.

Bir boncuk homojenizatörü üzerinde 1750 rpm'de beş dakika boyunca akciğer dokusunu ve PBS tamponunu boncuk çırparak dokuyu homojenize edin. Daha sonra, standart eğri sivri çözeltileri oluşturmak için mililitre ilaç stokları başına bir miligramı bire bir asetonitril / su ile seyreltin. Spike hacmine ve hedef doku hacmine bağlı olarak ani standart konsantrasyonları belirleyin.

Gösterilen örnek, 10 mikrolitrelik bir sivri hacim kullanan mililitre başına 100 nanogram standardı içindir. Mikrodiseke edilmiş dokuyu içeren tüpleri eksi 80 santigrat derece depodan çıkarın ve beş dakika oda sıcaklığına ulaşmasını bekleyin. Mikrodiseke edilen dokuyu içeren tüplere 10 mikrolitre bire bir asetonitril/su çözeltisi ve iki mikrolitre PBS tamponu ekleyin.

Standart eğri ve kalite kontrol tüpleri için, iki mikrolitre kontrol akciğer homojenatına 10 mikrolitre spiking solüsyonu ekleyin. Her tüpe 50 mikrolitre ekstraksiyon çözeltisi ekleyin. Her tüpü beş dakika boyunca girdaplayın.

Ardından, onları beş dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra, her tüpte bir film ve doku peleti oluşturmak için tüpleri beş dakika boyunca 5.000 rpm'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, 50 mikrolitre süpernatantı 96 oyuklu derin kuyu plakasına aktarın ve her kuyucukta ilave 50 mikrolitre deiyonize su ile seyreltin.

Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi LC-MS/MS analizi ve yöntem doğrulaması gerçekleştirin. LCM-LC/MS yöntemi ilk olarak etambutol çivili doku homojenatından lazerle mikrodiseke edilmiş bölgelerin analiz edilmesiyle doğrulanmıştır. Burada gösterildiği gibi, yöntem yüksek oranda tekrarlanabilirdi ve mükemmel ilaç geri kazanımı gösterdi.

Çoklu akciğer dokularında LCM-LC / MS ile ölçülen etambutol konsantrasyonları, yerleşik bir LC / MS yaklaşımı ile belirlenen konsantrasyonlarla doğrudan karşılaştırılarak daha da doğrulandı. Her iki teknikle de eşdeğer konsantrasyonlar tespit edildi. Tutulmamış akciğer parankimi, hücresel lezyon kenarı ve nekrotik kazeum içindeki mutlak etambutol konsantrasyonları LCM-LC/MS ile belirlendi.

Tüm lezyon kompartmanlarında Mycobacterium tuberculosis sterilizasyon düzeylerine ulaşıldı. Makrofajlarda hücre dışı replike eden basillerin %99'unu ve hücre içi basillerin %99'unu öldürmek için gereken minimum konsantrasyonlar belirtilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, tanımlanmış pulmoner granülom yapıları içinde dokuların nasıl mikrodiseksiyon yapılacağı ve ilaç seviyelerinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu teknik, antimikrobiyal ilaç araştırmaları alanındaki araştırmacıların, uygulanan ilaçların sterilizasyon konsantrasyonlarında hedef patojen popülasyonlarına ulaşıp ulaşmadığını doğru ve nicel olarak değerlendirmelerini sağlar. Bu yaklaşımın birçok farklı doku ve hastalık durumuna geniş bir uygulanabilirliği vardır.