Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

Bu iletişim kuralı plazmid DNA üzerinde tanımlanmış DNA-protein Glossar tamiri ölçmek için hedeftir. Lesioned plazmid alıcı memeli hücre satırları ve düşük molekül ağırlığı birden çok kez puan sonrası transfection hasat içine transfected. DNA onarım Kinetik sayısal qPCR tarafından takip strand özgü astar uzantısı kullanma.

Bu trans-Pasifik primer uzatma QPCR makalesinin genel amacı, memeli hücrelerine transfeksiyonu takiben plazmit DNA'sına çapraz bağlı eklentilerin onarımını kantitatif olarak değerlendirmektir. Bu yöntem, DNA onarımı alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. DNA protein çapraz bağlarının onarımında hangi yolların yer aldığı gibi.

Bu teknik, DNA hasar tepkisinin daha iyi anlaşılmasını sağlama potansiyeline sahiptir. Çünkü DNA protein çapraz bağlarının onarımını ve diğer DNA hasarı türlerinin yokluğunu seçici olarak incelemeye izin verir. Bu yöntem, DNA protein çapraz bağlarının onarımı hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer DNA hasarı türlerine de uygulanabilir.

Abazik bölgeler ve diğer polimeraz bloke edici eklentiler gibi. Bu tekniğin ana avantajı, iki saat gibi kısa bir zaman noktasında addukt içeren plazmitlerin onarımını tespit edebilmesidir. Başlangıçta onarımı incelemek için ev hücresi reaktivasyonunu kullanmayı amaçladık, ancak bu tahliller onarımı doğrudan ölçmez veya onarım verimliliğini abartabilir.

Özellikle RNA polimeraz eksik onarım ürünlerini okuyabiliyorsa. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü saflaştırma ve ipliğe özgü astar uzatma adımlarının görselleştirilmesi zordur. Oligonükleotid içeren sekiz oksoguaninin 80 pikomol içeren 20 mikrolitrelik bir çözeltiyi beş mikrolitre 10x ligaz tamponu ile karıştırın.

Ve 10 birim T4 polinükleotid kinaz içeren bir çözeltiden bir mikrolitre ekleyin. Son hacmi 50 mikrolitreye ayarlayın ve tüpü 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin. Daha sonra buz üzerinde primer-uzama reaksiyonunu oluşturur.

Programı termo-döngüleyiciye ayarlayın ve çalıştırmayı başlatın. İnkübasyondan sonra, farklı reaktifler, enzimler ve tampon ekleyerek toplam hacmi 375 mikrolitreye ayarlayın. Daha sonra reaksiyonu gece boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin.

50:50 oranında bir fenil-kloroform karışımı hazırlamak için eşit miktarda fenol ve kloroform ekleyin. Daha sonra her iki bileşeni de karıştırın ve beş dakika boyunca 21, 130 G'de bir masa üstü santrifüjde döndürün. Sıkma işlemi bittikten sonra, astar uzatma reaksiyonuna 375 mikrolitre organik tabaka ekleyin. Karışım.

Ve tekrar beş dakika boyunca 21, 130 G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, üst tabakayı dikkatlice pipetleyin. Ve amonyum asetat ile 0.3 molar nihai konsantrasyona kadar karıştırın.

Ve sonra iki hacim% 100 etanol ekleyin. Karışımı eksi 20 santigrat derecede en az 30 dakika ila gece boyunca saklayın. Kuluçka süresi sona erdiğinde, numuneyi 15.000 RPM'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Daha sonra süpernatanı atın ve peleti% 70 etanol içinde yıkayın. Numuneyi, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 15.000 RPM'de bir masa üstü santrifüjde tekrar döndürün. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın ve peleti 100 mikrolitre suda çözün.

50 mikrolitre DNA'yı 34 mikrolitre su ve 16 mikrolitre 6x jel yüklemeli boya ile birleştirin. Numuneyi, mililitre başına 0.5 mikrogram etidyum bromür içeren 10 santimetrelik, %0.8 düşük eriyik agaroz jel üzerinde, 1x TAE tamponunda altı saat boyunca santimetre başına iki voltta çalıştırın. Daha sonra süper sarmal DNA'yı çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın.

Ve jel dilimini tartın. Daha sonra, her 10 miligram jel dilimini sindirmek için bir mikrolitre beta-agaraz reaksiyon tamponu ekleyin. Daha sonra dilimi 65 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin ve ardından bir termo döngüleyicide 42 santigrat derecede soğutun.

Jel dilimi çözüldükten ve 42 santigrat dereceye kadar soğuduktan sonra, 10 birim beta-agaraz ekleyin ve termo döngüleyicide bir saat boyunca 42 santigrat derecede bırakın. Bir saat sonra, çözünmüş jel diliminin hacmini ölçün ve 0.3 molar nihai konsantrasyona kadar amonyum asetat ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, karışımı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 15.000 G'de santrifüjleyin.

Sonra süper natanı toplayın ve üzerine iki hacim izopropanol pipetleyin ve karıştırın. Ardından karışımı gece boyunca eksi 20 santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, saflaştırılmış süper sarmal DNA'yı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 15.000 RPM'de bir masa üstü santrifüjde santrifüjleyin.

Süper natanı çıkarın ve peleti 40 mikrolitre suda tekrar süspanse edin. Daha sonra, 12 pikomol DNA içeren bir çözeltinin 15 mikrolitresini, bir mikrolitre 36 pikoguanin glikosilaz çözeltisi ile bir tamponda birleştirin ve son hacmi 30 mikrolitreye ayarlayın. Daha sonra karışımı bir su banyosunda 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Transfeksiyondan bir gün önce, hücreleri altı oyuklu bir kültür plakasına tohumlayın. Ertesi gün, 1.5 mikrogram çapraz bağlı plazmidi 300 mikrolitre serumsuz kültür ortamı ile bir tüpte karıştırın ve bir mikrolitre DNA'yı sıfır saat işaret noktası olarak kaydettiğinizden emin olun. Başka bir tüpte 12 mikrolitre transfeksiyon reaktifini 300 mikrolitre serumsuz ortamla karıştırın.

Daha sonra 300 mikrolitre çapraz bağlı DNA'yı eşit hacimde seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile birleştirin. Ve laminer bir akış başlığında oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, iki kuyucuğun her birine 250 mikrolitre kompleks ekleyin ve 37 santigrat derecede inkübe edin.

En az bir saat sonra, ortamı çıkarın ve 0.1 molar EDTA ile bir mililitre% 0.6 sodyum dodesil sülfat çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri bir lastik polis memuru ile kazıyarak ayırın ve 1,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın. Daha sonra, bir molarin nihai konsantrasyonuna 200 mikrolitre 5 molar sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve tüpü beş kez ters çevirin.

Daha sonra gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün numuneyi dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 21, 130 G'de santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası, süper natantı toplayın.

Ve 0.3 molar'lık bir nihai konsantrasyona amonyum asetat ekleyin, karıştırın ve DNA'yı çökeltmek için iki hacim% 100 etanol ekleyin. Karışımı eksi 20 santigrat derecede en az 30 dakika saklayın. Etanol çökeltme ve geri kazanılan DNA örneklerinin 50 mikrolitre suda yeniden süspansiyonunu takiben, sıfır saat örneğini 500 mikrolitre su ile seyreltin ve transfekte edilmemiş ve transfekte edilmiş numuneleri kullanarak PCR reaksiyonlarını oluşturun.

Ardından programı termo döngüleyiciye ayarlayın ve çalıştırmayı başlatın. Bu trans-spesifik astar uzatma adımı çok önemlidir çünkü bize hasarlı telin amplifikasyonunu satın alır. Kullanılmazsa, delta CT değerleri birden az olur ve bu da düşük DPC onarım seviyelerinin tespit edilmesini zorlaştırır.

Sekiz döngüyü tamamladıktan sonra, ikinci astarın 100 pikomolünü ekleyin. Daha sonra, transfekte edilmemiş ve transfekte edilmiş numunelerden amplifiye edilmemiş DNA'nın bir mikrolitresini 2x ana karışım, su ve her iki primerin 100 pikomolleri ile 60 mikrolitrelik bir nihai hacme karıştırın. Numuneleri 96 oyuklu bir PCR plakasına üç kopya halinde yükleyin.

30 döngü için kantitatif PCR gerçekleştirin ve üçlü numunelerin her biri için döngü eşiğinin ortalamasını alın. Bu çalışmada, onarılan plazmit DNA yüzdesini hesaplamak için ipliğe özgü primer uzantısı olsun ve olmasın QPCR gerçekleştirilmiştir. Primer-uzatılmış ve primer-uzatılmamış numuneler arasındaki döngü eşik değerlerindeki fark, delta olarak adlandırılır CT.As burada görüldüğü gibi, SSPE-QPCR'ye tabi tutulan onarılmış bir numune, onarılmamış bir numuneden daha büyük bir delta BT'ye sahiptir.

Delta CT değerlerinden hesaplanan onarım yüzdesinin temsili verileri, üç saatlik transfeksiyondan sonra geri kazanılan numunelerin %66'sının onarıldığını, sekiz saat sonra geri kazanılan numunelerin ise %93'ünün onarıldığını göstermektedir. Sırasıyla yüksek ve düşük protein çapraz bağlama verimliliğine sahip iki kontrol örneğinden hesaplanan yüzde arka plan değerleri burada gösterilmektedir. Kontrolde bulunan düşük yüzdeli arka plan, transfeksiyonlar için neden yalnızca verimli bir şekilde çapraz bağlı alt tabakaların kullanıldığını gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki ila üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bu testten herhangi bir arka planı çıkarmak için sıfır zaman numuneleri almak önemlidir. Bu prosedürü takiben, aşağıdaki gibi ek soruları yanıtlamak için dizi analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir: DPC onarım hatasına eğilimli mi?

Bu videoyu izledikten sonra, memeli hücrelerinde eklenti içeren plazmitlerin onarımının nasıl hazırlanacağını, transfekte edileceğini ve niceliklendirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Fenol, kloroform ve etidyum bromür ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Ve eldiven giymek, çeker ocakta çalışmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.