Name: Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Öğrenin, C. elegans bağırsak lizozomlarında lizozomal asitlik kaybını cDCFDA boyama yöntemiyle değerlendirmeyi. Bu basit ve tekrarlanabilir teknik, otofaji araştırmalarında lizozomal fonksiyonu incelemek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Caenorhabditis genetik Merkezi suşları, Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Vakfı için yenilik (finansmanı için CFI) teşekkür etmek istiyorum. Dr. Lizhen tüm C. elegans deneyler için onun laboratuar İmkanları sınırsız kullanımına izin veren için Chen (hücre sistemleri bölümü ve anatomi, UT sağlık San Antonio) yanı sıra Dr Exing Wang (müdür, optik görüntüleme tesis teşekkür etmek istiyorum UT sağlık San Antonio) confocal mikroskobu konusunda yardım almak için. Biz de doktor Myron Ignatius destek ve video çekimi kolaylaştırmak için cesaret verdiğiniz için teşekkür ederiz istiyorum.

1. leke ve bağırsak organellerin görüntü
<ol><li>Tohum nematodunun büyüme medya (NGM) ile OP50 tabaklar
	<ol>
<li>NGM tabak başı olarak önerilen protokolü19 hazırlamak ve oda sıcaklığında 2 gün kuru kapalı plakalara sağlar.</li>
		<li>OP50 bakteri steril Luria suyu (LB) suyu aşılamak ve titreyen bir inkübatöre veya su banyoda 37 ° c 36 h ya OD 0,2 0,4 aramda kadar büyür. Bir bakteri kültürü ile OD kullanmaktan kaçının > 1 veya OD < 0,2.</li>
		<li>NGM tabak kuru olduğunda, OP50 inoculum Merkezi plaka üzerine bir damla (~ 30 µL) yerde ve daha sonra yaklaşık 2 cm x 2 cm boyutunda bir yama içine damla yayılırlar. Not: Herhangi bir kalan OP50 inoculum 4 ° C'de için bir ay kadar saklanır.</li>
		<li>İnoculum (yaklaşık 10-15 dk) kuruduktan sonra OP50 plakaları ters çevir ve plakaları için 36 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>36 h sonra plakaları kuluçka ve mağaza 4 ° C'de daha sonra kullanmak kadar kaldırın. Not: Tabakları 4 ° C'de 1 ay için iyi olmalıdır</li>
	</ol></li>
	<li>CDCFDA OP50 için ilave
	<ol>
<li>CDCFDA OP50 plakalar üzerine ek 10 mM cDCFDA Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde bir çalışma hazır hazır olun. Işık ve daha sonra kullanmak için-20 ° C'de mağaza korunuyorsunuz cDCFDA çözüm tutmak.</li>
		<li>Öyle ki tüm yama düzgün cDCFDA ile kaplıdır yavaşça 100 µL 10 mM cDCFDA çözüm 2 cm x 2 cm OP50 yama yüzeyine yerleştirin. Not: OP50 tüm yama cDCFDA ile kaplıdır çok önemlidir. Gerekirse, cDCFDA 150 µL her plaka için kullanın. OP50 yama dışarı akar herhangi bir cDCFDA yemek dahil değil ve azaltılmış boyama şiddeti neden olur bu yana cDCFDA çözüm OP50 yama, sınırların ötesinde kapsamaz zorunludur.</li>
		<li>Tüm cDCFDA çözüm absorbe kadar bakteriyel yama tezgah üstüne koyu bir kutu içinde OP50 tabak koyun (genellikle yaklaşık 25-30 dakika).</li>
	</ol></li>
	<li>Solucan cDCFDA kullanarak boyama
	<ol>
<li>Bir kez cDCFDA tamamen OP50 yama nüfuz, plaka başına 20'den fazla solucanlar yerleştirin ve en az 14 h 20 ° C'de ters plakaları kuluçkaya. Not: Bu cDCFDA plakaları yakmak için pozlandırmayı en aza indirmek için opak bir kutuya koyun önerilir.</li>
		<li>Deneyler arasındaki farklar alımı için kontrol etmek ve cDCFDA sinyalleri, normalize etmek (önerilen) 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) () ile ortak leke difluoro) Bor (bir taze yapılmış 1 mM çözüm 2.5 µL), kimin Floresans asidik pH spektrum üzerinde büyük ölçüde değişken olmayan olduğunu bir acidotropic zayıf Amin boya ( Malzemeler tablo bkz: reaktifler ortak adları için). Not: Bu yetersiz cDCFDA boyama yoğunluğunu sağlamak ve yanlış yorumun lizozomal pH vermek beri solucanlar az 14 h için leke değil.</li>
	</ol></li>
	<li>Slaytlar mikroskopi için hazırlanıyor
	<ol>
<li>Teyp yaklaşık 3 inç apart pürüzsüz düz bir yüzeye, bir ayna (şekil 1) gibi etiketleme iki paralel şeritler yerleştirin.</li>
		<li>Su geçirmez sprey ile ayna yüzeyine ceket ve fazla sıvı temizle.</li>
		<li>(Çözünmüş distile H2O) % 2 özel bir mikrodalga tamamen sıvılaşmış kadar erime sonra teyp iki şeritler arasında özel bir 50 µL damla koyun ve öyle ki slayt dikey şeritler için hızlı bir şekilde mikroskop kaydıraklı, açılan kapak kaset. Özel katılaşmış sonra oluşturan dairesel bir yastık altında slayt, slayt ters çevirin ve 5 mM sodyum azid (NaN3) özel yastık üzerine 10-15 µL ekleyebilirsiniz. Not: NaN3 sitokrom C inhibitörü olduğunu o zaman düşük konsantrasyonlarda kullanılır, böylece onlar görüntüleme sırasında hareket etmez geri dönülebilir olarak solucan anesthetizes.</li>
		<li>Solucan cDCFDA ile desteklenmiş OP50 plaka almak ve herhangi bir OP50 olmadan temiz bir NGM plakasına aktarmak. Solucanlar solucan yüzeyinden kaldırılacak OP50 çoğunu izin vermek bir kaç saniyeliğine taşımak izin ve sonra 5 mM sodyum azid içeren özel yastık solucanlar aktarın.</li>
		<li>Hemen özel yastık bir kapak notu ile kapak. Bu solucan patlama neden olabilir bu yana çok fazla baskı uygulamadan kapak notu yavaşça yerleştirdiğinizden emin olun. Not: cDCFDA ile desteklenmiş OP50 bakteri mikroskobu tarafından görüntülenir zaman bulabilsem, bu nedenle solucanların en iyi temizlemek mümkün olduğunca sodyum azid içeren özel yastık bunları yerleştirmeden önce önemlidir. 6'dan fazla (N2, vahşi türü denetimi de dahil olmak üzere) C. elegans suşları prepping, böylece solucanlar özel yastık üzerinde kurumasına olduğunu sağlamak için 6, toplu halde örneklerinde hazırlamak için tavsiye edilir. Bazı suşları vulva kapak notu baskısı nedeniyle uzun bir süre sonra buna göre planlamak önemlidir bu yüzden rüptürü başlanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Confocal mikroskobu Not: Bazı mikroskoplar otomatik olarak artırır floresan yoğunluğu Floresans çeşitli düzeyleri için telafi etmek için yerleşik bir özelliği var. Böyle mikroskoplar de doğal olarak örnekleri floresan yoğunluğu artacak bu yana cDCFDA ile lekeli solucanlar görüntüleme için çalışmayabilir.<ol>
<li>488/530 için ayarla uyarma/emisyon dalga boylarında kullanarak standart confocal mikroskop düşsel gerçekleştirmek nm cDCFDA için. Uçak bağırsak organellerin (değil Z-yığınlar) görüntülerini alın ve odak (maksimal sinyal yoğunluğu) yoğunluk miktar için çoğu organellerin kullanın. Not: Belki de boya kullanılabilirlik farklılıkları nedeniyle, bağırsak hücreleri için farinks doğrudan arka organellerin yoğunluğu ne olursa olsun genotip veya yaş boyama cDCFDA korumak, dolayısıyla bu hücrelerde organellerin Imaging önlemek için özen gösterilmelidir.</li>
		<li>2 gün eski vahşi N2 ilk solucanlar türünü içeren slayt görüntü. Bunu yaparken de, lazer gücü, iğne deliği ve diyafram yoğunluğu boyama cDCFDA değil doygun olduğunu emin olmak için gibi confocal görüntüleme parametreleri ayarlayın. Not: Bu ayarlar ayarladığınızda, onları o gün için görüntüleme tüm süresince değiştirmeyin.</li>
		<li>Bağırsak (solucanı başına 3-4 görüntü) tek bir uçağın 1024 x 1024 piksel çekim bir 60 X büyütme objektif kullanarak. Not: Solucan cDCFDA emisyon spektrumunda 520 nm rastlayan bağırsak autofluorescence (şekil 3) ayrı bir belirli sinyal okuma sağlayan onun bildirilen Floresans spektrum20ile tek bir önemli en yüksek verim.</li>
		<li>RAW confocal resim (.lsm dosyaları) her kanal için .tiff dosyası olarak dışa aktarın.</li>
		<li>Daha sonra ImageJ açın ve dosyasını tıklatın | Açık sayısal için görüntü dosyası açmak için. Görüntü yükler sonra oval şekil seçim aracını ImageJ içinde faiz (ROI) bir bölge seçmek için kullanın.</li>
		<li>Bundan sonra tıklayın analiz | Ölçü floresan yoğunluğu için ki ROI ölçmek için. 4 – 5 farklı, odakta organellerin resim başına seçin ve faiz (ROI) her bölgede ortalama göreli floresan yoğunluğu hesaplayın.</li>
		<li>Her görüntü için arka plan floresan yoğunluğu arasında organellerin bağırsak bölgesinde ölçmek. Arka plan Floresans yoğunluk değerleri lizozomal Floresans yoğunluk değerleri üzerinden çıkarma.</li>
		<li>Toplamda, yaklaşık 30-50 normalleştirilmiş değerlerini cDCFDA yoğunluğu (6-10 hayvanlar) test edilen her zorlanma için ayrı ayrı toplamak. Bu değerler herhangi bir uygun istatistiksel yazılım kullanarak bir kutu ve bıyık arsa çizmek için kullanın. Not: floresan yoğunluğu karşılaştırmalar yalnızca aynı boyama deneme sürecinde örnekleri içinde anlamlıdır öyle ki boyama önemli ölçüde sıcaklık, kuluçka süresi ve genel sağlık/yaş hayvan gibi faktörlere bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle boyama her denemede denetimleri işlemek önemlidir. İstatistiksel farklar hesaplama (t-testleri) herhangi bir uygun istatistiksel yazılım kullanarak.</li>
		<li>Görüntü tüm (aynı gün lekeli) aynı deneme görüntüleme parametrelerden birini değiştirmek için dikkat çekici sırayla suşları.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+aging+and+failure+to+segregate+damaged+proteins+in+Sir2+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants.</a> Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).</li>
<li>Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2758740/">Autophagy for the avoidance of neurodegeneration.</a> Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).</li>
<li>Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+intracellular+protein-degradation+pathways+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration.</a> Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).</li>
<li>Cuervo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+aging%3A+the+importance+of+maintaining+%26%2334%3Bclean%26%2334%3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy and aging: the importance of maintaining &#34;clean&#34; cells.</a> Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).</li>
<li>Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+identifying+effectors+of+alpha-synuclein+misfolding+and+dopaminergic+cell+death+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease.</a> Methods. 53 (3), 220-225 (2011).</li>
<li>Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+amyloid+formation%2C+and+neurodegeneration%3A+a+critical+role+for+molecular+chaperones%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?</a> Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10806201">Age-related decline in chaperone-mediated autophagy.</a> J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).</li>
<li>Tonoki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+linking+age-dependent+attenuation+of+the+26S+proteasome+with+the+aging+process%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process.</a> Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).</li>
<li>Squier, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+protein+aggregation+during+biological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and protein aggregation during biological aging.</a> Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).</li>
<li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enhance+autophagy+and+reduce+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models.</a> Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).</li>
<li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li>
<li>Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+function+and+dysfunction%3A+mechanism+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).</li>
<li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-aging+treatments+slow+propagation+of+synucleinopathy+by+restoring+lysosomal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function.</a> Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).</li>
<li>Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+permeabilization+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease.</a> Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+intracellular+proteolytic+systems+change+with+age%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">How do intracellular proteolytic systems change with age?</a> Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10767573">When lysosomes get old.</a> Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).</li>
<li>Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((btn1%2C+the+Schizosaccharomyces+pombe+homologue+of+the+human+Batten+disease+gene+CLN3%2C+regulates+vacuole+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/?report=reader">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+vacuolar+pH+in+yeast+and+identification+of+acidification-defective+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).</li>
<li>Pringle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+methods+for+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy methods for yeast.</a> Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).</li>
<li>Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Lysosomal+Function+by+the+DAF-16+Forkhead+Transcription+Factor+Couples+Reproduction+to+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).</li>
<li>Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+lysosomal+acidification-The+emerging+role+of+v-ATPase+in+aging+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease.</a> Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).</li>
<li>Kang, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+identifies+ATM+as+a+target+for+alleviating+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence.</a> Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).</li>
<li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).</li>
<li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-lysosomal+axis+theory+of+aging%3A+accumulation+of+damaged+mitochondria+as+a+result+of+imperfect+autophagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis.</a> Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).</li>
<li>Gerland, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autolysosomes+accumulate+during+in+vitro+CD8%2B+T-lymphocyte+aging+and+may+participate+in+induced+death+sensitization+of+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells.</a> Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).</li>
<li>Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+analysis+of+differential+protein+expression+and+oxidative+modification+of+specific+proteins+in+the+brains+of+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice.</a> Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).</li>
<li>Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+basis+of+lipofuscin%2C+ceroid%2C+and+age+pigment-like+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores.</a> Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).</li>
<li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na%2B%2FH%2B+exchanger+NHX-2+increases+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).</li>
<li>Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+lumenal+chloride+in+the+lysosome+is+critical+for+lysosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Hücresel ve moleküler olayları çeşitli katkıda bulunmak için yaşlanma, yaşam öyküsü özellikleri ve genetik faktörlerden etkilenir. Bizim son çalışma22 üreme döngüsü lizozomal pH dynamics düzenlenmesi aracılığıyla soma fitness denetlenmesinde önemli bir rol oynar öneriyor. Biz hayvanlar aktif olarak sırayla asidik organellerin sağlar v-ATPaz transkripsiyon upregulation tarafından yeniden iken o lizozomal aracılı proteolizis yükseltilir gösterdi. Üreme, v-ATPaz ifade damla, sonu üzerine organellerin...

Protein toplamları görünümünü yaygın bir hallmark ökaryotik hücreler1,2,3ve hangi hücresel yaşlanma4 ilke sürücüleri arasında düşünülmektedir oluşumu yaşlanma olmak kabul , 5 , 6 , 7. yaş hücreleri gibi protein katabolizma protein toplama artışa önde gelen Engelli olduğunu büyüyen kanıtıdır. Hücrelerin yaşlanma içinde proteolizis çöküşü autophagy8 yanı sıra proteasome-aracılı protein yıkımı9bir bozulma içerir. Son olarak, geri dönüşü olmayan protein oksidasyon daha fazla protein katabolizma10bozulması eski hücrelerde artar.
Autophagy başlangıçta için toplu bozulma bozuk proteinlerin non-selektif bir süreç olduğu düşünülüyordu ama son yıllarda yapılan çalışmalarda bu autophagy çok seçici protein toplamları ve işlevsel olmayan organelleri olmayan katabolizma belirttiler mükellef bozulması diğer protein izni mekanizmaları11ile için. Autophagy işlemi sırasında zarar görmüş ve toplanan proteinleri autophagosome denilen bir çift-membran vezikül münzevi. Bu autophagosome sonra da autophagosome kargo12düşmesine neden organellerin, denilen asidik organelleri ile Sigortalar. Organellerin autophagic yolun son nokta temsil ve membran tamir, transkripsiyon kontrolü ve besin algılama gibi farklı hücresel süreçler iştirak; hücresel homeostasis (ref. 13 gözden) içindeki merkezi rolü vurgulayarak. Çeşitli çalışmalarda lizozomal işlevi bir yaş bağımlı azalma ve çeşitli nörodejeneratif hastalıklar13arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Sürekli olarak, büyük hücrelerdeki lizozomal işlevi geri yükleme fenotipleri yaşlanma ile ilgili14,15başlangıçlı gecikme. İntralumen ortamın kompozisyonu çalışmalarının lizozomal büyük hücre işlevinde çöküşü lizozomal proteaz16üretim azalma nedeniyle değil öneririz. Alternatif olarak, intralysosomal asit, enzimatik faaliyet, kritik bir gereklilik kaybı lysosome-aracılı proteolizis17düşüş altında yatan önerilmiştir. Bu hipotez keşfetmek için güçlü olmak, reaktifler ve dinamik değişiklikleri canlı hücrelerdeki lizozomal pH yinelenebilir ve tutarlı bir şekilde soruşturma için protokolleri geliştirmek esastır.
C. elegans bağırsak solucanları önemli metabolik doku ve sistemik homeostazı ve ömrü kritik bir regülatör. Biz deneyleri değişikliklerini değerlendirip geliştirdik solucan nasıl lysosome-aracılı proteolizis belirlemek için bağırsak organellerin Lümen asitliği yaşlanmaya katkıda bulunur. PH-duyarlı fluorophores daha önce C. elegans içinde bağırsak organellerin işaretlemek için kullanılmıştır rağmen henüz küçük artışlar lizozomal pH vivo18'. algılayabilir başarılı bir iletişim kuralı kurmak çabası olmadı Burada, OP50 maması pH duyarlı fluorophore (cDCFDA) içeren basit ve uygun beslenme protokolü kullanarak lizozomal asit kaybı C. elegans bağırsak hücreleri algılamak için kullanılan bir protokol sağlar.

<table><tbody><tr><td>OP50 ( E. coli)</td> <td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>5 (6) -karboksi-2 ', 7'-diklorofloresein diasetat ve nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Yaygın olarak cDCFDA</td></tr><tr><td>9-dietilamino-5H-benzo(a)fenoksazin-5-on ve (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipirrol-5-il-kappaN(1))metiliden]-2H-pirrol-5-il-kappaN}-N-[2- (dimetilamino)etil]propanamidato)(difloro)bor</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td> olarak <td>bilinir Yaygın olarak Lysotracker Kırmızı</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop olarak bilinir (ör. Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Et suyu tozu</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol tozu</td><td>Sigma</td><td>C3045'ten</td> ücretsiz indirin;<td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Fişleri</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aynası veya diğer pürüzsüz düz yüzey</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bağırsak hayatın caenorhabditis elegans lizozomal alkalinization değerlendirilmesi

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans (C. elegans) uzun ömür ve gelişim yolları çalışma için yaygın olarak kullanılan bir modeli sistemidir. Bu tür çalışmalar hayvan, ileriye ve geriye doğru genetik deneyleri, üreten fluorescently etiketli protein göreli kolaylığı ve ya erken microinjected floresan boyalar kullanımı yeteneği şeffaflık tarafından kolaylaştırdı embriyo veya hücre organelleri (örneğin phenoxazine-5-1 9-diethylamino-5 H-benzo (a) ve (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - etiketlemek için onun gıda (E. coli zorlanma OP50) içine dahil [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Burada, bağırsak organellerin, lekeleri floresan bir pH duyarlı boya kullanımı canlı solucanlar lizozomal asitliği dinamik, fizyolojik değişikliklerin görsel bir okuma sağlayan mevcut. Bu iletişim kuralı lizozomal pH ölçmek değil, ama oldukça fizyolojik alakalı varyasyonları lizozomal asitliği değerlendirirken, güvenilir bir yöntem kurmayı amaçlıyor. cDCFDA floresan fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) hidroliz üzerine tarafından hücre içi esterazlar dönüştürülür hücre permeant bir bileşiktir. Organellerin içinde Protonation cDCF içinde nerede biriken bu organelleri yakalar. 4.8 düşük onun pKa nedeniyle, bu boya Maya bir pH sensör olarak kullanılmıştır. Burada bağırsak organellerin asitliği değerlendirmek için bir gıda takviyesi olarak cDCFDA kullanımı açıklamak C. elegans. Bu teknik canlı hayvanlar, alkalinizing organellerin tespiti için izin verir ve deneysel uygulamalar yaşlanma, autophagy ve lizozomal Biyogenez çalışmalar da dahil olmak üzere geniş bir yelpazesine sahiptir.

cDCFDA bir pH bağımlı şekilde organellerin lekeleri ve onun düşük pKa ve hazır Alım organellerin içine bir ideal pH sensör21yapar. cDCFDA yoğunluğu boyama lizozomal pH (Yani boyama yoğunluğu arttıkça pH azalır)18,22' ye ters orantılıdır. cDCFDA sinyalleri sürekli zayıf organellerin hayvanların klorokin, lizozomal asitleştirme bir inhibitörü 20 mM ile tedavi ve v-ATPaz, protein kompleksi için proton...

Lizozomal asit pH duyarlı hayati boya 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA) kullanarak C. elegans bağırsak kaybı soruşturma için bir adım adım kılavuz

Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Bu prosedürün genel amacı, C. elegans'ın bağırsak lizozomlarında nispi bir lizozomal asitlik kaybını değerlendirmektir. Bu yöntem, lizozomal fonksiyon ve protein bozunması hakkında dolaylı olarak bilgi sağlayarak otofaji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit, ucuz, kullanışlı ve tekrarlanabilir olmasıdır.Bu yöntem için ilk olarak, mayadaki vakuolar alkalinizasyonu değerlendirmek için kullanılan boyama tekniğini gözlemlediğimizde aklımıza geldi. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü OP50 gıdasına cDCFDA eklenmesi ve iki günlük vahşi tip solucanların görüntülenmesi gibi bazı adımlar kritiktir. NGM plakalarını hazırladıktan sonra, kapakları kapalı olarak iki gün boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.Ardından, OP50 bakterilerini steril Luria suyuna aşılayın. Aşılamadan sonra, OD 0,2 ile 0,4 arasında olana kadar aşılayıcıyı inkübatörde bırakın. Ardından, kuru NGM plakasının ortasına bir damla OP50 aşılayıcı yerleştirin.Daha sonra, aşılayıcıyı kabaca iki ila iki santimetre yama halinde yaymak için bir yayıcı kullanın. Yaklaşık 15 dakika sonra, aşılayıcı kuruduktan sonra OP50 plakasını ters çevirin. Ardından, plakayı 36 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçka bittikten sonra, plakayı kullanıma kadar dört santigrat derecede aktarın. Ardından, M9 tamponunda 10 milimolar cDCFDA'lık bir çalışma stoğu hazırlayın. cDCFDA solüsyonunu eksi 20 santigrat derecede ışıktan uzakta saklayın.Ardından, tüm OP50 yamasını plaka üzerinde eşit şekilde kaplamak için 100 mikrolitre 10 milimolar cDCFDA pipetleyin. cDCFDA plakalarını yaklaşık 30 dakika tezgah üstünde karanlık bir kutuda bırakın. cDCFDA, OP50 yamasına tamamen nüfuz ettikten sonra, plakaya 20 solucan aktarın, ardından plakayı 20 santigrat derecede yaklaşık 14 saat ters durumda bırakın.Ardından, iki şerit etiketleme bandı alın ve bunları pürüzsüz, düz bir ayna yüzeyine 1,5 inç aralıklarla yerleştirin. Ardından aynanın yüzeyini su itici sprey ile kaplayın ve fazla sıvıyı çıkarın. Daha sonra, mikrodalgada damıtılmış suda% 2 agarozu eritin.Agaroz sıvılaştıktan sonra, bantların iki şeridi arasına bir damla agaroz yerleştirin ve damlayı mikroskop lamı ile kapatın. Agaroz, sürgünün altında dairesel bir ped şeklinde katılaştıktan sonra, sürgüyü çevirin. Ardından, agaroz pedi üzerine 10 ila 15 mikrolitre beş milimolar sodyum azid ekleyin.Şimdi, solucanları cDCFDA takviyeli plakadan herhangi bir OP50 olmadan temiz bir NGM plakasına aktarın. OP50'nin yüzeylerinden çıkarılması için solucanların birkaç saniye hareket etmesine izin verin. Ardından, solucanı beş milimolar sodyum azid içeren agaroz ped üzerine aktarın.Agaroz pedini bir kapak fişi ile hızlı bir şekilde örtün. Ardından, 60X büyütme lensi kullanın ve iki günlük vahşi tip ve mutant solucanlardan bağırsağın tek bir düzleminde görüntüler yakalayın. Ardından ImageJ'yi açın ve dosyaya tıklayın.Ardından, nicelik belirlemesi gereken dosyayı açmak için Aç'a tıklayın. Görüntü yüklendikten sonra, ilgilenilen bölgeyi seçmek için oval şekilli Seçim Aracını kullanın. Ardından, Analiz Et'e tıklayın ve son olarak, ilgilenilen bölgenin floresan yoğunluğunu ölçmek için Ölç'e tıklayın.Lizozomal fonksiyonel aktiviteyi incelemek için, cDCFDA boyama yoğunluğu konfokal görüntüleme kullanılarak ölçülür. Bu görüntüde, vahşi tip iki gün C.Elegans'ın bağırsak lizozomlarında sağlam bir cDCFDA floresan sinyal yoğunluğu vardır. Bu, işlevsel olarak yetkin bir asidik lizozomu gösterir.Aksine, floresan yoğunluğu, vahşi tip sekiz eski solucanların bağırsak lizozomlarında önemli ölçüde bastırılır. Bu, ikinci gün solucanlarının bağırsak lizozomları ile karşılaştırılır. Sonuç, sekizinci gün eski solucanlarda işlevsel olarak yetersiz alkali lizozomun varlığını gösterdi.İlginç bir şekilde, yoğunluktaki cDCFDA floresansı, vahşi tip solucanla karşılaştırıldığında, hem ikinci hem de sekizinci gün eski RNAi solucanlarında belirgin şekilde azalır. Burada, lizozomal astardaki vakuolar ATPaz alt birimlerini kodlayan vha geni, ikinci ve sekizinci gün eski solucanlarda yıkıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm bu boyama ve mikroskopi rejimi, uygun şekilde yapılırsa 18 saatten daha kısa sürede tamamlanabilir.Bu prosedürü denerken, solucanları OP50 mamasında cDCFDA takviyesinde en az 14 saat kuluçkaya yatırmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, canlı C.elegans'ın bağırsak lizozomlarında lizozomal asitlik kaybının nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

assessing-lysosomal-alkalinization-intestine-live-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Kaynak: Le, T. A. N . ve diğerleri, Caenorhabditis elegans'ın bağırsak geçirgenliği üzerindeki bakteri ve kimyasalların etkilerini ölçmek. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, Pseudomonas aeruginosa'ya maruz kalmak üzere C. elegans'ta bağırsak geçirgenliğini niceliklendirmek için floresan tabanlı bir testi göstermektedir. Kontrollerle beslenen Escherichia coli ile karşılaştırıldığında, patojenle tedavi edilen solucanlarda vücut boşluğuna florofor sızıntısı artar ve bu da epitel bariyer hasarını...

Bakteriyel Maruziyetten Sonra C. elegans'ta Bağırsak Geçirgenliğinin Değerlendirilmesi

Bu videoda, laktat dehidrojenaz enzimi kullanılarak hücre lizatlarında laktat ölçümü için bir kolorimetrik test açıklanmaktadır. Bu enzim, NAD'nin tetrazolyum boyalarla reaksiyona giren NADH'ye dönüştürülmesiyle birlikte laktatı piruvata dönüştürür ve laktatı kantitatlamak için spektrofotometrik olarak ölçülebilen renkli bir ürün verir.

Test Numunelerinde Laktat Miktarının Belirlenmesi için Kolorimetrik Test

Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler...

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

Saydam C. elegans bağırsak "sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası" olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

C. elegans boşaltım kanalı görsel vivo içinde analiz polarize de novo membran dipnotlar için benzersiz bir tek hücreli modelidir. Bu iletişim kuralı standart genetik/RNAi ve yaklaşımlar, uyarlanabilir kimlik ve tek hücreli tubulogenesis ve apikal membran ve Lümen Biyogenez yönetmenlik molekülleri karakterizasyonu için Imaging birleşimidir açıklar.

C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme

Değiştirilmiş küçük ölçekli çıkarma ve laktat ve Yuvarlak solucanlar pyruvate Renkölçer deneyleri tarif C. elegans. Ticari tahlil kitleri kullanarak, teknik geliştirme hassasiyet ve doğruluk önemlidir. Ayıklama protein yağış hücre içi metabolitleri kantitatif tayini için en önemli adımdır.

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Bu protokol, Caenorhabditis elegansbağırsak geçirgenliği ölçmek için nasıl açıklar. Bu yöntem bağırsak bakterileri ve ev sahibi arasındaki etkileşim ile ilgili bağırsak sağlığı temel biyolojik araştırma ve sızıntılı bağırsak sendromu ve inflamatuar barsak hastalıkları nın tedavisi için probiyotik ve kimyasal ajanları belirlemek için tarama için yararlıdır.

Bakteri ve Kimyasalların Caenorhabditis elegans'ın Bağırsak Geçirgenliği Üzerine Etkilerinin Ölçülmesi

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskopisi, spesifik kimyasal moieties'in seçici, etiketsiz görüntülenmesini sağlar ve lipit moleküllerini in vivo olarak görüntülemek için etkili bir şekilde sunulmuştır. Burada, SRS mikroskopi prensibine kısa bir giriş sağlıyoruz ve Caenorhabditis elegans'talipid depolama görüntülemede kullanımı için yöntemleri açıklıyoruz.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Biyolojik bilimlerin öğretilmesi, deneylerin kullanılmasıyla öğrenciler için daha teşvik edici hale getirilebilir. Bu el yazması, öğrencileri yüksek kalorili diyetler, açlık ve yaşlanma ile ilgili hipotezleri formüle etmeye ve test etmeye teşvik etmek için sınıfta kullanılabilecek iki farklı ancak tamamlayıcı protokol sunmaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Glikojen Birikimini ve Bağırsak Bütünlüğünü Görselleştirmek için Düşük Maliyetli Boyaların Kullanılması

Öğrenin, C. elegans bağırsak lizozomlarında lizozomal asitlik kaybını cDCFDA boyama yöntemiyle değerlendirmeyi. Bu basit ve tekrarlanabilir teknik, otofaji araştırmalarında lizozomal fonksiyonu incelemek için değerli bir araçtır.

Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet