Name: Mineraller hFOB 1.19 tarafından üretilen ve SAOlar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını Microanalysis Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Öğrenin hFOB 1.19 ve Saos-2 hücrelerinde mineralizasyon profillerini TEM ve EDX analiziyle karşılaştırma yöntemini. Bu protokol kemik biyolojisi ve doku mühendisliği araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MK ve ASK manuel işlemler yapıldı ve LB çizimleri hazır ve film yaptı. ASK LB yazdı makale yazdı ve MK tablo hazırladı. SM, RB ve SP eleştirel tablo, komut dosyası ve el yazması okuyun. Yazarlar Hanna Chomontowska onun mükemmel hakkında yardım almak için ultramicrotomy yanı sıra Szymon Suski ve Henryk Bilski TEM-EDX analizi ile mükemmel onların yardım için teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar dr Patrick bahçeleri mesleki İngilizce dil düzeltme ve Barbara Sobiak talimatları kayıt için teşekkür etmek istiyorum.
Bu eser hibe N N401 140639 bilim ve Yükseköğretim Lehçe Bakanlığından ASK, LB ve 2016/23/N/NZ1/02449 MK, AB FP7 projesi BIOIMAGINE için Ulusal Bilim Merkezi, Polonya 2016/23/N/NZ4/03313 gelen hibe tarafından desteklenmiştir : BIO-görüntüleme araştırma yenilik ve eğitim, GA No 264173 ve Nencki Enstitüsü, Deneysel Biyoloji, yasal fon tarafından Polonya Bilimler Akademisi.

1. hücre kültür ve tedavi
<ol><li>Laminar akış başlık altında tüm gerekli malzemeleri koymak ve onları UV ışık altında sterilize. Kültür Medya: 1:1 karışımı insan fetusu hFOB 1.19 SV40 büyük T antijen transfected için jambon F12 ve DMEM medya ile 2.5 mM L-glutamin 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin, 0.3 mg/mL G418 ve % 10 ile Fetal sığır Serum (FBS) (v/v) desteklenen değil dokusunu ve 1.5 mM L-glutamin 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin ve % 15 ile takviye ile McCoy'un 5A orta FBS (v/v) insan osteosarkom SAO'lar-2 hücreleri için.</li>
	<li>Kültür bir atmosferde % 5 CO2 34 ° C'de hFOB 1.19 hücreleri ve SAO'lar-2 hücreleri 37 ° c % 5'lik bir atmosferde CO2. Kuluçka makinesi laminar akış hood için hücre kültürleri, her iki hFOB 1.19 veya SAO'lar-2 hücreleri, transfer ve orta 10 mL taze kültür orta FBS ile değiştirin.</li>
	<li>Uyarıcılar (resting hücreleri) olmayan hücreler kuluçkaya veya onları 50 µg/mL askorbik asit (AA) 7.5 mM β-Ultrasaf Su daha önce hazırlanan ve 0,22 µm şırınga filtreler aracılığıyla filtre gliserofosfat (β-GP), ardından ile teşvik. Plastik microcentrifuge tüpler kültür ortamının yüzeyine gelen uyarıcılar ekleyin. Yavaşça kültür çanak karıştırın ve 7 gün boyunca kuluçkaya.</li>
</ol>2. kalsiyum mineraller tespiti
<ol><li>Hücre kültürleri fosfat tampon tuzlu su ile yıkamak (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,0).</li>
	<li>%2 (g:100 mL) 5 mL ekleyin AR-S PBS, pH 5,0 ve plakalar mineraller leke 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez PBS ile yıkayın. Dikkatle PBS çanak duvara ekleyin, mineraller yok değil çalışın.</li>
	<li>Kalsiyum mineraller bir ters ışık mikroskobu altında gözlemlemek ve fotoğraf çekmek.</li>
</ol>3. görsel olarak UV ışık altında probları
<ol><li>Hücre lysates için hücre kültürleri, dinlenme ya da 7 gün için uyarılmış göre collagenase sindirim Protokolü24tedavi.</li>
	<li>Orta hücre kültürleri toplamak ve PBS hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>3 mL 500 U/mL collagenase 0.25 M sukroz, 0,12 M NaCl, 0.01 M KCl ve 0,02 M Tris-HCl tampon, pH 7,45, 37 ° c 3 h için bir çözümde hücrelerle sindirmek.</li>
	<li>Mekanik olarak hücreleri kazımak, onları plastik microcentrifuge tüpler için aktarmak ve 0,5 × 16 iğne ile 1 mL 40 U şırınga ile 10 kat geçirin.</li>
	<li>500 × g 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant atın ve hücre Pelet sentetik kıkırdak lenf (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1.83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5.5 mM D-glikoz, 63 mM sukroz, 16.5 mM Hepes, pH 7,4) 500 µL içinde askıya alma.</li>
	<li>Hidroksiapatit (HA), fluorapatite (FA) ve chlorapatite (CA) tozlar UV transilluminator şişe bir spatula ile aktarmak ve denetimleri kullanın.</li>
	<li>Hücre lysates plastik ipuçları ile Plastik tüpler aktarmak ve dikkatle UV transilluminator yer.</li>
	<li>Görüntü altında görünür ve UV ışık al.</li>
</ol>4. probları TEM-EDX için hazırlanması
<ol><li>Mineraller negatif boyama için hazırlanması<ol>
<li>Sentetik üretilen HA, CA ve SK mineraller25 2,5 mg deiyonize su 500 µL içinde askıya alma ve % 5 CO2 1 h için bir ortamda 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Formvar/karbon 300 Ni kafes ızgaralar kutusundan statik olmayan forseps ile almak, bir porselen çok iyi tabağa yerleştirin ve HA, CA ve SK süspansiyonlar 10 µL ızgaralar üzerinde bırak.</li>
		<li>Örnekleri, oda sıcaklığında 30 dk için kuru.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İstirahat hazırlık ve teşvik hücreleri 26 katıştırma için<ol>
<li>Orta hücre kültürleri toplamak ve fizyolojik Desensitizasyon (PD) Orta (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 10 mM glikoz, 20 mM HEPES, pH 7,4) hücrelerle yıkayın.</li>
		<li>5 mL % 3 (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) oxazolidin 100 mM sodyum fosfat tampon pH 7.2, duman başlık altında oda sıcaklığında 1 h için karışımı ile hücreleri tamir.</li>
		<li>5 mL 100 mM sodyum fosfat tampon de hücrelerle yıkama ve arabellek yıkandıktan sonra yavaşça çıkarın.</li>
		<li>Karanlık odada 2 mL % 1 (g:100 mL) osmiyum tetroxide 100 mM sodyum fosfat tampon pH 7.2, duman başlık altında oda sıcaklığında 20 dakika örnekleriyle postfix.</li>
		<li>Osmiyum tetroxide kaldırın ve kullanmak o.</li>
		<li>5 mL 100 mM sodyum fosfat tampon de hücrelerle yıkayın.</li>
		<li>Sonra 5 mL aliquots oda sıcaklığında bir kademeli etanol çözüm serisinin örneklerinde kurutmak: % 25 (VOL) 5 min için % 50 oranında (VOL) 10 dakika için % 75 (VOL) 15 dakika, % 90 (VOL) 20 dk için. Son olarak mutlak etanol iki kez kullanmanız ve 30 dk ve 12 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Mekanik olarak hücreleri plastik Petri kültür yemeklerini kazımak, plastik microcentrifuge tüpler içine toplamak ve 130 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Supernatants kaldırın ve LR beyaz reçine ve hacim oranı 1:2, mutlak etanol karışımından 1 mL hücrelerde askıya alma.</li>
		<li>Cam tüpler kullanımdan önce içeriği karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>130 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Supernatants çıkarın ve 1 mL LR beyaz reçine ve mutlak etanol 1:1 karışımı kullanarak önceki adımı yineleyin.</li>
		<li>Mix iyi ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>130 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Supernatants kaldırın.</li>
		<li>Son olarak, 1 mL saf LR beyaz reçine örnekleri için iki kez ekleyin ve Plastik tüpler içinde oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Her örneğinin 500 µL jelatin kapsül yerleştirin. Not: Örnekleri reçine etiketleri yok etmez küçük bir yaprak kağıt ve bir kalem kullanılarak etiketlenir.</li>
		<li>Jelatin kapsül kapatın, plastik microcentrifuge tüpler içine koydum ve 130 x g 1dk swing-out Open End için de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Kapsüller bir vakum pompası ile Plastik tüpler kaldırın.</li>
		<li>Örnekleri için fırın taşımak ve 48 h için 56 ° C'de polimerize.</li>
		<li>Bloklar onları yuvasına montaj ve onları Piramide süsleme hazırlayın.</li>
		<li>Sahibi ultramicrotome koymak, elmas Ultra 45 ° bıçak eklemek ve deiyonize su ile doldurun; arızi hava kabarcıkları gelen bıçak temiz unutmayın.</li>
		<li>Sonra deiyonize su banyosu üzerine elmas bıçak kullanma bölümlerine (700 Å) kesti.</li>
		<li>Ni ızgara sığır kirpik ve onları Formvar/karbon 300 parlak tarafında mesh yer kullanarak artıkları ayarla ve onları kurutun.</li>
		<li>2.5 oranında (VOL) uranyl asetat içinde belgili tanımlık karanlık bir duman başlık altında mutlak etanol içinde hazırlamak. Uranyl asetat kurşun kabında tutun ve tortu açmamanı unutmayın.</li>
		<li>Karanlık odada, ızgaralar, sentetik apatitler ve hücre örnekleri ile 2.5 oranında (VOL) uranyl asetat etanol duman başlık altında oda sıcaklığında 20 dakika içinde counterstain.</li>
		<li>Kılavuzlar içinde % 50 etanol (vol. tarafından), sonra deiyonize suyla yıkayın ve 24 saat için oda sıcaklığında kuru. Son olarak, ızgaralar ve metin kutusuna koy.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. TEM-EDX Analizi
<ol><li>TEM görüntüleme bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile donatılmış tam kapsamlı enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis ile (EDX) sistem ve 11 megapiksel kamera<ol>
<li>Bir berilyum tutucu mineraller ve hücreleri gözlem için hazırlayın. Antistatik araçları kullanın.</li>
		<li>Vida çifti kaldırın ve Asansör berilyum plaka ve berilyum yıkayıcı hizmetkar kalan uzak.</li>
		<li>Kılavuz, parlak tarafı, tutucu üzerinde binin.</li>
		<li>Dikkatle berilyum yıkayıcı ve berilyum tabak yerleştirin ve sabitleme vidaları sıkıca vidalayın.</li>
		<li>Sahibi vakum odanın içine koymak ve vakum pompası üzerinde açın.</li>
		<li>Bir kez bir vakum elde, yavaşça sahibi görüntüleme odanın içine takın ve denge aletinin üstüne açın.</li>
		<li>Floresan monitörde mikroskop diyafram parametrelerini ayarlamak. Görüntü astigmat düzeltmesi gerçekleştirmek; Zum, odaklama ve çerçeve ayarla; ve 50, büyütme oranında TEM fotoğraf çekmek 000 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>KÖK görüntüleme ve x-ışını microanalysis spektral ve kompozisyon analizi için<ol>
<li>Enerji dağıtıcı x-ışını (EDX) dedektörü tarama transmisyon elektron mikroskobu (kök) görüntüleme odanın içine yerleştirin.</li>
		<li>Odak modu görüntü keskinliğini ayarlamak.</li>
		<li>KÖK görüntüler 15, büyütme oranında tutar 000 X.</li>
		<li>X-ışını microanalysis için örnek bir nokta seçin ve spectra toplamak.</li>
		<li>Örnek (% 100) olarak periyodik tabloda tüm öğeler için tüm atom ağırlıklarının özetliyor ve seçili öğeleri içeriğini belirten veri elde etmek: Ca, F, Cl ve P (olarak atomik %). Sonra her örnek için Ca, F veya Cl p oranları hesaplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İyon eşleme<ol>
<li>Kalsiyum, Flor, klor ve iyon eşleme yapmak ve EDX haritalar seçilen öğelerin örnekleri gerçekleştirmek için fosfor gibi öğeleri seçin.</li>
		<li>Verileri analiz öğeleri lokalizasyonu belirtmek suretiyle elde etmek: Ca, F, Cl ve P (olarak atomik %) ve Co lokalizasyonu (% olarak) Ca, F veya Cl P ile her örnek için hesaplar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3325555">Bone structure and function.</a> Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).</li>
<li>Anderson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+matrix+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of matrix vesicles.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).</li>
<li>Anderson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+vesicles+and+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Matrix vesicles and calcification.</a> Curr Rheumatol. 5 (3), 222-226 (2003).</li>
<li>Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+aspects+of+biomineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Biophysical aspects of biomineralization.</a> Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).</li>
<li>Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+vesicles+from+chondrocytes+and+osteoblasts%3A+Their+biogenesis%2C+properties%2C+functions+and+biomimetic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).</li>
<li>Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-nonspecific+alkaline+phosphatase+and+plasma+cell+membrane+glycoprotein-1+are+central+antagonistic+regulators+of+bone+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14), 9445-9449 (2002).</li>
<li>Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+phosphate+substrate+as+a+major+determinant+of+mineral+type+formed+in+matrix+vesicle-mediated+in+vitro+mineralization%3A+An+FTIR+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study.</a> Bone. 38 (6), 811-817 (2006).</li>
<li>Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+pyrophosphate+as+a+regulator+of+hydroxyapatite+or+calcium+pyrophosphate+dihydrate+mineral+deposition+by+matrix+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr.+Cartil%22%5BJournal%5D)">Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles.</a> Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).</li>
<li>Terkeltaub, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+pyrophosphate+generation+and+disposition+in+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology.</a> Am. J. Phys. 281 (1), 1-11 (2001).</li>
<li>Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+culture+system+for+analysis+of+functional+role+of+phosphate+transport+in+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification.</a> Bone. 27 (1), 69-74 (2000).</li>
<li>Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+mineralization+deficits+and+impaired+biogenesis+and+function+of+chondrocyte-derived+matrix+vesicles+in+Phospho1%28-%2F-%29+and+Phospho1%2FPi+t1+double-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice.</a> J. Bone Miner. Res. 31 (6), 1275-1286 (2016).</li>
<li>Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+biogenesis+and+functions+of+matrix+vesicles+released+from+mineralizing+human+osteoblast-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells.</a> J. Proteome. 74 (7), 1123-1134 (2011).</li>
<li>Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin-mediated+Ca2%2B+influx+regulates+growth+plate+chondrocyte+maturation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 278 (6), 3762-3769 (2003).</li>
<li>Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+osteoblasts+is+involved+in+mineralization+and+bone+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis.</a> Autophagy. 10 (11), 1965-1977 (2014).</li>
<li>Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+intracellular+calcium+phosphate+in+osteoblast-mediated+bone+apatite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 14170-14175 (2012).</li>
<li>Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+matrix+vesicle+nucleation%3A+synergistic+stimulation+of+mineral+formation+by+annexin+A5+and+phosphatidylserine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine.</a> J. Biol. Chem. 282 (36), 26035-26045 (2007).</li>
<li>Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mineral+chaperones%3A+a+role+for+fetuin-A+and+osteopontin+in+the+inhibition+and+regression+of+pathologic+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification.</a> J. Mol. Med. (Berl). 86 (4), 379-389 (2008).</li>
<li>Suchanek, W., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://adsabs.harvard.edu/abs/1998JMatR..13...94S">Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants.</a> J. Miner. Res. 13 (1), 94-117 (1998).</li>
<li>Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+osteosarcoma+cell+lines+MG-63%2C+Saos-2+and+U-2+OS+in+comparison+to+human+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts.</a> Anticancer Res. 24 (6), 3743-3748 (2004).</li>
<li>Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+differentiation+and+characterization+of+the+human+fetal+osteoblastic+1.19+cell+line%3A+a+possible+in+vitro+model+of+human+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 25 (1), 125-131 (2007).</li>
<li>Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+raman-based+imaging+method+for+characterizing+the+molecular+adsorption+and+spatial+distribution+of+silver+nanoparticles+to+hydrated+mineral+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces.</a> Environ Sci Technol. , (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+effect+of+nano-ZnO+and+cetyltrimethyl+ammonium+chloride+on+the+growth+of+Chlorella+vulgaris%3A+Dissolution+and+accumulation+of+nano-ZnO%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO.</a> Chemosphere. 196, 566-574 (2018).</li>
<li>Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocatalytic+reduction+of+carbon+dioxide+over+Cu%2FTiO2+photocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollut+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts.</a> Environ Sci Pollut Res Int. , (2017).</li>
<li>Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin-Mediated+Matrix+Vesicle+Calcification+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> J. Bone Miner. Res. 23 (11), 1798-1805 (2008).</li>
<li>Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+minerals+in+vesicles+produced+by+human+osteoblasts+hFOB+1.19+and+osteosarcoma+Saos-2+cells+stimulated+for+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Bioch%22%5BJournal%5D)">Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization.</a> J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).</li>
<li>Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+vesicles+originate+from+apical+membran%C4%99+microvilli+of+mineralizing+osteoblast-like+Saos-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells.</a> J. Cell. Biochem. 106 (1), 127-138 (2009).</li>
<li>Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+exchanges+in+apatites+for+biomedical+application%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Ion exchanges in apatites for biomedical application.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 16 (5), 405-409 (2005).</li>
<li>Kraus, D. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1179/2047480613Z.000000000181?journalCode=ymew20">Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software.</a> Med. Writ. 23 (1), 25-28 (2014).</li>
<li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+in+humans%3A+making+the+hard+choices+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).</li>
<li>Bonucci, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22201735">Bone mineralization.</a> Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).</li>
<li>Veis, A., Dorvee, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+mechanisms%3A+A+new+paradigm+for+crystal+nucleation+in+organic+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif.+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices.</a> Calcif. Tissue Int. 93 (4), 307-315 (2013).</li>
<li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+collagen+biomineralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro models of collagen biomineralization.</a> J. Struct. Biol. 183 (2), 258-269 (2013).</li>
<li>Alliston, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4134366/">Biological regulation of bone quality.</a> Curr. Osteoporos. Rep. 12 (3), 366-375 (2014).</li>
<li>Wang, W., Kirsch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stimulates+annexin-mediated+growth+plate+chondrocyte+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization.</a> J. Cell Biol. 157 (6), 1061-1069 (2002).</li>
<li>Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+and+terminal+differentiation+of+growth+plate+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes.</a> Exp. Cell Res. 305 (1), 156-165 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Geçerli kağıt AR-S için boyama, UV ışık fluorapatite tanımlaması iletişim kurallarını açıkladığımız ve TEM-EDX vitro görüntüleme hücreleri mineralizing tarafından yayımlanan MVs ve minerallerin MVs. tarafından üretilen Tüm yöntemleri ortak bazı sorun giderme adımlarını takip ederek yukarıda belirtilen adrese mümkündür. En iyi sonuçları elde etmek için birkaç önemli adımlar dikkatle yapılmalıdır. İlk olarak, (asidik olan) AA kültür ortamının pH 7.4 korumak için β-(alkali olan) GP tarafından takip eklemek...

Kemik bağ dokusu iki kısımdan oluşur bir türüdür: organik (hücreleri ve kollajen lifler) ve mineral (kalsiyum ve fosfat bileşikleri). Ana mineral kemikleri apatitler1bileşenleridir. Qafqaz yetkili hücreler kemik (dokusunu), diş (odontoblasts) ve kıkırdak (kondrosit) farklı türde hücre dışı matriks (ECM) proteinler üreten ve matris bırakmadan Qafqaz ilk adımları düzenleyen veziküller (MVs) (Şekil 1). MVs kalsiyum ve fosfat apatit çekirdekleşme kolaylaştırmak biriken ve daha sonra bağlamak kollajen2,3' e 100-300 nm çapında veziküller vardır. Sonra hücre dışı ortama apatitler serbest bırakmak için MVs parçalanır. Apatitler kollajen lifleri ile temas halinde büyümeye ve kemik matris oluşturmak devam. Qafqaz Pben ve Ca2 + ekstraselüler ortamda sürekli tedarik tarafından sürekli. Kısa bir süre önce bazı veriler bizim model4,5desteği. Yumuşak dokular fizyolojik koşullar altında mineralize değil. Ancak, ektopik kalsifikasyon vasküler kalsifikasyon3gibi patolojik şartlar altında meydana gelebilir. Osteoblast fenotip elde damar hücreleri apatitler çekirdekleşme teşvik ve kan damarlarının duvar medial ve intimal katmanlarındaki Qafqaz başlatmak MVs üretebilir. Ektopik kalsifikasyon beri normal endochondral Qafqaz3Qafqaz kemik hücreleri moleküler mekanizmaları anlama, benzer ve kondrosit bazı ipuçları vardır yumuşak dokuların ektopik önkol kemiğinde kireçlenme. sağlamalıdır kurdu.
İskelet doku gelişimi çeşitli enzimler, büyüme faktörleri ve rehberleri veya Qafqaz inhibitörleri tarafından düzenlenir. Uzlaşmaz eylem doku ettiren alkalen fosfataz (TNAP) (Şekil 1) ve ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiesteraz ben (NPP1), ankyrin (ANK), ile birlikte inorganik pirofosfat (PPben) konsantrasyonu kontrol eder 6. PPben, HA oluşumu, güçlü bir inhibitörü TNAP; hidrolize NPP1 nükleotit trifosfatlar arasında ANK PPben için ECM hücreden verir iken PPben oluşturmak üzere hidrolize. Pi/ÜFE oranı apatit oluşumu7,8 olası patolojik sonuçları9ile düzenleyen.
MV membran çekirdekleşme sürecinde (Şekil 1) kalsiyum ve fosfat MVs içinde yağış ilk kolaylaştırmak iyon taşıma proteinlerde zenginleştirilmiştir. Fosfat ışınlama 1 (çukur) MVs10,11perivesicular uzayda oluşturulan Pben dahil etmek için yardımcı olur. Annexins bağlama ve Ca2 + ulaşım ve Qafqaz MV lümen12,13' te başlattığı biyofiziksel süreç içinde tutulabilir. Biz daha önce apatit ECM14,15dakika sonra onun yayılma önce MV içinde iç çekirdekleşme intrasitoplazmik keseleri içinde Qafqaz için önerilen hipotez, iyilik. Vitro modelleme indüksiyon Ca2 +/Pben kompleksleri oluşumu PS ve AnxA516yapılan proteoliposomes doğruladı. Bu o birikimi gösteriyor olabilir sahip Ca2 +, Pben, lipid sallar, microvilli gibi membranesrepresent (NC) çekirdekleşme özünü apatit MVs. Annexins ve TNAP içinde AnxA5 ve PS kompleksleri ayrıca kollajen bağlayıcı kapasiteleri MVs kollajen lifleri boyunca koyarak ve ECM Qafqaz yayılmasını teşvik edici olarak yararlı olabilir. Fetuin A ve osteopontin (OPN)17, Qafqaz kolajen iskele üzerinde yayılmasını yavaşlatmak apatit oluşumu inhibitörleri olarak bilinir. Çekirdekleşme ve yayılma farklı olaylar, ikincisi, önceki eski vardır ve her ikisi de patolojik Qafqaz işlemi için uygun olmayabilir.
Kalsiyum fosfat kompleksleri Kimya fizyolojik Qafqaz ve ektopik kalsifikasyon nasıl değişebilir keşfetmek için hücreleri tarafından üretilen mineraller tanımlamak gereklidir. Apatitler kalsiyum ve fosfat genel kristal birim hücre formülü Ca10(PO4)6X2ile mineraller içeren bir grup, burada X = Cl, F, OH. 18aşağıdaki gibi sınıflandırılır: fluorapatite (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 ve hidroksiapatit (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.
Her hücre kültürünü Qafqaz ayrı bir profil sergileyen bu yana osteoblast hücre hatları seçimi mineral oluşumu ikna etmek için çok önemlidir. Bu raporda, Qafqaz iki insan hücre modelleri tarafından mineraller çekirdekleşme karşılaştırıldığında: osteoblastik hFOB 1.19 hücreleri ve SAO'lar-2 osteosarkom hücreleri. Osteosarkom kaynaklı hücreler osteoblastik modelleri olarak yaygın olarak kullanılır ve farklılaşmamış insan fetal hFOB hücreler yaygın olarak normal osteoblastik bir model olarak kullanılır iken SAO'lar-2 hücreleri en olgun osteoblastik karakter19 korunmuş farklılaşma20. Qafqaz profillerini farklı yöntemlerle analiz edildi: Alizarin Red-S (AR-S) boyama, ultraviyole (UV) ışık görselleştirme, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntü, enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (EDX) Nefelometri ve iyon eşleme. TEM-EDX avantaj önceki çalışmalarda kullanılan alternatif teknikleri bu apatit kristallerinin4,5,21' iyon değiştirme nicel ve nitel sonuçlar veren şeydir. TEM-EDX kullanarak genel amacı görüntüleme ve miktar hücreler farklı türdeki çeşitli mineraller Ca, F ve Cl iyonu dağıtım Qafqaz sürecin farklı aşamalarında için basit bir yöntem bulmak oldu. Bu yöntem başarılı bir şekilde, örneğin, coexisting kimyasallar ile çinko nano tanecikleri ve Sucul organizmalar22kombine etkileri etkileşimi izlemek için kullanılmıştır. Başka bir çalışmada, bir bakır photocatalyst sulu çözüm titanyum malzemeleri hakkında kapsamlı İndüktif Eşleşmiş Plazma optik emisyon spektrometresi (ICP-OES), N2 physisorption (bahis), ile karakterize edildi XRD, UV-vis DRS, FT-IR, Raman Spektroskopi, TEM-EDX ve fotoelektrokimyasal ölçümler23. Amacımız kökeni ve veziküller ve mineraller Qafqaz kemik farklılaşma sırasında kontrol mekanizmasını anlamak için iki hücre satırı özelliklerini karşılaştırmak için oldu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57423/57423fig1.jpg"> Resim 1 . Qafqaz kemik hücreleri içeren hücre dışı matriks (ECM) protein sentezi ve membran matris veziküller (MVs) sürümünden ilk adımların düzenini. MVs kalsiyum kalsiyum bağlayıcı proteinler, annexins ve inorganik fosfat ışınlama (çukur) eylem yoluyla hangi dephosphorylates doku non-spesifik alkalen fosfataz (TNAP), etkinlik tarafından takip fosfat eylem yoluyla birikir PPben böylece apatit çekirdekleşme kolaylaştırmak Pben. O zaman, MVs parçalanır ve hücre dışı ortama apatitler bırakın. Qafqaz Pben ve Ca2 + hücre dışı orta4,5sabit tedarik tarafından sürekli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57423/57423fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktif< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jambon' s DMEM / F12 medya karışımı</td><td>PAA</td><td>E15-813</td><td>1: 1, insan fetüsü için hFOB 1.19 SV40 büyük T antijeni transfekte osteoblastlar (ATCC CRL-11372)</td></tr> <tr><td>McCoy ' İnsan</td> osteosarkomu için s 5A orta <td>PAA</td><td>E82312-0025</td><td>Saos-2 hücreleri (ATCC HTB-85)</td></tr><tr><td>Antibiyotik karışımı (penisilin / streptomisin)</td> <td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>100 U / mL</td></tr><tr><td>her biri G-418</td><td>Sigma</td><td>68168</td><td>0.3 mg / mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>hFOB 1.19 için% 10 ve Saos-2</td></tr><tr><td>AA</td><td>için %15 Sigma</td><td>A-5960 50</td><td>& mikro; g/mL</td></tr><tr><td>&szlig;-GP</td><td>Sigma</td><td>G9422-100G</td><td>HA için 7.5 mM</td></tr><tr><td>Biyo-Jel HTP Jel</td><td>Bio-Rad</td><td>130-0420</td> FA <td>bizim</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>tarafımızdan sentezlenen</td></tr><tr>CA Bizim <td>tarafımızdan sentezlenen</td><td>CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat tamponu Na2HPO4 / NaH2PO4 karışımı</td><td>Sigma</td><td>S7907/S8282</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.0, tarafımızdan hazırlanmıştır</td></tr><tr>PBS <td>Sigma</td><td>A5533-25G'de</td><td>AR-S</td><td>0.5 g/100 mL, pH 5.0</td></tr><tr><td>Kollajenaz tip IA</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>500 U/mL</td></tr><tr><td>SCL tamponu</td><td></td><td></td><td>tarafımızdan üretilen</td></tr><tr><td>deiyonize su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>POCh</td><td>BA6480111</td><td>mutlak% 99.8 ve çözeltiler% 25, 50, 75,90%</td></tr> <tr><td>50 etanol içinde uranil asetat</td><td>Polysciences Inc.</td><td>21447-25</td><td>0.25 g/10 mL</td></tr><tr><td>PD orta</td><td></td><td></td><td>pH 7.4, tarafımızdan hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>Fiksasyon karışımı (paraformaldehit/glutaraldehit)</td><td>Sigma</td><td>158127/G-6257</td><td>%3:%1</td></tr> <tr><td>Sabitleme sonrası OsO4</td><td>Sigma</td><td>75633</td><td>%1</td></tr> <tr><td>LR Etanolde beyaz reçine</td><td>Polysciences Inc.</td><td>17411-MUNC 500g</td><td>1: 2, 1: 1,% 100</td></tr> <tr><td>Aseton</td><td>CHEMPUR</td><td>111024800</td><td>saf</td></tr><tr><td><güçlü > Alet< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kriyojenik şişeler</td><td>Corning Inc.</td><td>430487</td><td>1.2 mL</td></tr><tr><td>Plastik Petri kültürü kapları</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Plastik tüpler</td><td>Falcon</td><td>352096 ve 352070</td><td>15 ve 50 mL</td></tr><tr><td>Serolojik pipetler</td><td>Falcon ve VWR</td><td>357521 ve 612-3700</td><td>1 ve 10 mL</td></tr><tr><td>Plastik mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Sigma</td><td>Z688312 ve Z628034</td><td>1.5 mL siyah ve 2 mL şeffaf</td></tr><tr><td>Plastik uçlar</td><td>VWR</td><td>613-0364, 613-0239 ve 613-1050</td><td>0.1-10 ve mikro; L doğal, 1-200 ve mikro; L sarı ve 200-1000 & mikro; L mavi</td></tr><tr><td>Plastik</td><td>raflar Light Labs</td><td>A-7055-Z, A-7053-C</td><td>tüpler için yeşil, mikro tüpler için turuncu ve TEM probları için mavi</td></tr><tr><td>Laminar Hera Save</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>KS12</td><td>HEPA filtre (DIN EN 1822'ye göre H14)</td></tr><tr><td>İnkübatörler Hera Cell</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>150</td><td>34& derece; hFOB 1.19 ve 37 derece için C; Saos-2 için C</td></tr><tr><td>Çeker ocak</td><td>TEM boyamaları için</td><td>POLON</td><td>WCS-2</td></tr><tr><td>Cam şişeler</td><td>SIMAX</td><td>1632414501050 ve 1632414501100</td><td>50 ve 100 mL</td></tr><tr><td>Kuvars cam tüpler</td><td>SIMAX</td><td>638422010100</td><td>&Oslash; 10 mm, L 100 mm</td></tr><tr><td>Pompa</td><td>IBS Integra Biosciences</td><td>Vakumlu</td><td></td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Memmert</td><td>UNE 400</td><td>56 için VACUSAFE konfor&deg; C</td></tr><tr><td>Porselen çok kuyulu plaka</td><td>Rosenthal technik</td><td>229/12</td><td>12 kuyulu</td></tr><tr><td>Cam kaplar</td><td>SIMAX</td><td>632417010025</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Cam şişeler</td><td>Pocord</td><td>DIN22</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Plastik kutu</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td></td><td>karanlık için</td></tr><tr><td>Snap Fit Jelatin Kapsüller</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>G3741</td><td>boyut 1</td></tr><tr><td>Formvar / Karbon 300 Mesh Ni ızgaralar kutuda</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>Parlak tarafta</td> <td>S162N3</td> film</tr><tr><td>Silikon hücre sıyırıcı</td><td>Sigma</td><td>SIAL0010-100EA</td><td>boyut 1.8 / 25 cm</td></tr><tr><td>İğneli şırınga</td><td>BogMark</td><td>007</td><td>şırınga 1 mL 40 U, iğne 0.5 x 16</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Chirana</td><td>CH005L</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>MPW Tıbbi Aletler</td><td>MPW-350R</td><td>130 x g ve 500 x g</td></tr><tr><td>UV translüminatör</td><td>UVP</td><td></td><td>Görünür ve UV ışığı için</td>M-20</tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>LKB</td><td>NOVA</td><td>700&Aring; bölümler</td></tr><tr><td>Blok tutucu</td><td>LKB</td><td>E6711</td><td>yuvarlak şekil</td></tr><tr><td>Elmas bıçak</td><td>DiATOME</td><td>Ultra 45&deg;</td><td>Boyut 3</td></tr><tr><td>Kirpik tutucu</td><td></td><td></td><td>sığır, tarafımızdan hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>ROTH</td><td>2855.1</td><td>ızgaralar için antistatik</td></tr><tr><td>Spatula seti</td><td>ROTH</td><td>E286.1</td><td>tozlar için antistatik</td></tr><tr><td><güçlü>Görüntüleme</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters Çevrilmiş Işık Mikroskobu</td><td>PowerShot G1 ile donatılmış Canon AxioObserver Z9</td><td></td> <td>ile ZeissFaz kontrastı, İletilen ışık, 20 x objektif, RGB filtreler,</td></tr><tr><td>İletim Elektron Mikroskobu</td><td>TEM Jeol Co., Oxford Instruments ve SiS-Olympus</td><td>JEM-1400 ile donatılmış, tam kapsamlı INCA Enerji Dağıtıcı X-ışını mikroanaliz (EDX) Sistemi ve 11 Megapiksel MORADA G2 kamera</td><td>büyütme, TEM için 50.000X ve STEM ve EDX için 15.000X</td></tr><tr><td>Kamera gövdesi ve lensleri</td><td>Nikon</td><td>Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D </td><td>video kayıtları için</td></tr><tr><td>Mikrofon</td><td>MXL Mikrofonlar</td><td>Ses</td><td>kayıtları için</td> Tempo</tr></tbody></table>

mineraller hfob 1.19 tarafından üretilen ve sao'lar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis analizi

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

Bu video enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (TEM-EDX) iki kemiğin insan hücre hatları ile yayımlanan veziküller mineraller durumunu karşılaştırmak için iletim elektron mikroskobu kullanımını sunar: hFOB 1.19 ve SAO'lar-2. Askorbik asit (AA) ve β-gliserofosfat (β-GP) ile tedavi sonrası bu hücre satırları Qafqaz için nükleer silahların yayılmasına karşı gelen tam osteojenik transdifferentiation geçmesi ve apatit çekirdekleşme tetiklemek matris veziküller (MVs) üretmek hücre dışı matriks (ECM).
Alizarin Red-S (AR-S) boyama ve mineraller ultraviyole (UV) ışık kullanarak hücre lysates veya veziküller ardından EDX Nefelometri ve iyon eşleme TEM Imaging'i kullanma kompozisyon analizi dayalı, biz o osteosarkom sonucuna SAO'lar-2 ve osteoblastik hFOB 1.19 hücreler ayrı Qafqaz profilleri ortaya koyuyor. SAO'lar-2 hücreleri hFOB 1.19 hücreleri daha verimli bir şekilde mineralize ve UV ışığı altında görünür olmayan ancak onlar-si olmak daha fazla Ca ve F oyuncu değişikliği hidroksiapatit (HA) açısından benzerdirler büyük maden yatakları üretmek.
Bu teknikleri kullanarak elde edilen sonuçları Qafqaz sürecinin hücre türüne bağlı olarak farklı olduğunu sonuçlandırmak sağlamak. Hücresel düzeyde, kökeni ve veziküller özelliklerini mineraller türünü kazanmakla, öneriyorum.

TEM-EDX matris veziküller (MVs) hücreleri mineralizing tarafından yayımlanan ve Qafqaz sürecinin farklı şekilde devam edebilirsiniz bu tekniği kullanarak elde edilen sonuçları göstermek Mvs tarafından üretilen mineral vitro görüntüleme sağlar hücreleri çeşitli türleri. İki hücre satırları aynı osteoblastik transdifferentiation tedavi alınan henüz AR-S tarafından kanıtlanan uyarılan SAO'lar-2 hücreleri 1,19 dokusunu, hFOB çok daha etkili biçimde mineralize boyama (<strong...

Biz iki kemiğin insan hücre hatları ile yayımlanan veziküller mineraller durumunu karşılaştırmak için bir iletişim kuralı mevcut: hFOB 1.19 ve SAO'lar-2. Qafqaz profillerini Alizarin Red-boyama, ultraviyole (UV) ışık görselleştirme, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme ve enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (EDX) tarafından S (AR-S) analiz edildi.

Mineraller hFOB 1.19 tarafından üretilen ve SAO'lar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını Microanalysis Analizi

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Mineralizasyonun ilk aşamaları sırasında, hücreler hücre dışı matris proteinleri üretir ve apatit çekirdeklenmesini kolaylaştırmak için kalsiyum ve fosfat biriktiren matris veziküllerini serbest bırakır. Bu raporda, minerallerin çekirdeklenmesini seçilen iki insan hücresi modeli, osteoblastik hFOB 1.19 ve osteosarkom Saos-2 hücreleri ile karşılaştırıyoruz. Cevherleşme profilleri farklı yöntemlerle analiz edilmiştir.Tüm malzemeleri laminerin altına koyun ve UV ışığı altında sterilize edin. Fetal sığır serumu ile ortamı 10 mililitre taze kültür ortamına değiştirin. Dinlenme hücreleri stimülatörler olmadan inkübe edilirken, uyarılmış hücreler hem askorbik asit hem de beta-gliserofosfat ile muamele edilir.İlk olarak, hücreleri uyarmak için askorbik asidi mililitre başına 50 mikrogramlık nihai konsantrasyona yavaşça kültür ortamının yüzeyine bırakın. Daha sonra, hücreleri uyarmak için kültür ortamında 7.5 milimolar nihai konsantrasyona beta-gliserofosfat ekleyin. Kültür kabını yavaşça karıştırın ve yedi gün boyunca inkübatöre koyun.Yedi günlük inkübasyondan sonra, hücre kültürlerini fosfat tamponlu salin, PBS ile yıkayın. Beş mililitre% 2 alizarin kırmızısı ekleyin ve mineralleri lekelemek için plakayı 30 dakika inkübe edin. PBS ile üç kez yıkayın.PBS'yi dikkatlice bulaşık duvarına ekleyin. Mineralleri yok etmemeye çalışın. Mineralleri ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin.Ortamı hücre kültürlerinden toplayın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Yedi gün boyunca dinlenen veya uyarılan hücreleri, mililitre başına 500 birim kollajenaz çözeltisi ile üç saat boyunca 37 derecede sindirin. Ardından, hücreleri mekanik olarak kazıyın.Bunları plastik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Onları 10 kez bir şırıngadan geçirin. Numuneleri 500 g'da beş dakika santrifüjleyin.Süpernatanı atın ve hücre peletini 500 mikrolitre sentetik kıkırdak lenf içinde askıya alın. Hidroksiapatit, florapatit ve klorapatit tozlarını şişelerden spatula ile UV transilluminatör üzerine aktarın ve kontrol olarak kullanın. Hücre lizatlarını plastik tüplerden plastik uçlarla aktarın ve UV transillüminatörüne dikkatlice yerleştirin.2.5 miligram hidroksiapatit, florapatit ve klorapatit tozlarını 500 mikrolitre deiyonize suda süspanse edin. Bir saat boyunca 37 derecede inkübe edin. Formvar / karbon nikel ızgaraları antistatik forsepsli kutudan alın ve porselen çok kuyulu bir tabağa yerleştirin.Izgaraların üzerine 10 mikrolitre hidroksiapatit süspansiyonu bırakın. Klorapatit ve florapatit için de aynısını yapın. Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika kurutun.Gömme için dinlenme ve uyarılmış hücreleri hazırlayın. Hücre kültürlerinden ortam toplayın. Hücreleri fizyolojik duyarsızlaştırma ortamında yıkayın.Hücreleri, çeker ocak altında oda sıcaklığında bir saat boyunca 100 milimolar sodyum fosfat tamponunda beş mililitre% 3 paraformaldehit ve% 1 gluteraldehit karışımı ile sabitleyin. Hücreleri beş mililitre 100 milimolar sodyum fosfat tamponu ile yıkayın. Yıkadıktan sonra tamponu yavaşça çıkarın.Karanlık odada, numuneleri 100 milimolar sodyum fosfat tamponunda iki mililitre% 1 osmiyum tetroksit ile sabitleyin. Numuneleri çeker ocak altında oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Osmiyum tetroksiti çıkarın ve kullanın.Hücreleri beş mililitre 100 milimolar sodyum fosfat tamponu ile yıkayın. Daha sonra, numuneleri oda sıcaklığında, 25, 50, 75 ve% 90 etanolde dereceli bir etanol çözeltisi serisinin beş mililitrelik alikotunda kurutun. Son olarak, mutlak etanolü iki kez kullanın ve 30 dakika ve 12 saat inkübe edin.Hücreleri kültür kaplarından mekanik olarak kazıyın. Hücreleri plastik mikrosantrifüj tüplerine toplayın. Numuneleri 130 g'da bir dakika santrifüjleyin.Süpernatanları çıkarın. Hücreleri, bir ila iki hacim oranında LR Beyaz reçine ve mutlak etanol karışımında askıya alın. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Numuneleri 130 g'da bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanları çıkarın. Bire bir LR Beyaz reçine ve mutlak etanol karışımı kullanarak önceki adımı tekrarlayın.İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Numuneleri 130 g'da bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanları çıkarın.Numunelere saf LR Beyaz reçine ekleyin ve plastik tüplerde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Numuneleri 130 g'da bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanları çıkarın.Tekrar saf LR Beyaz reçine ekleyin. Her numuneden 500 mikrolitreyi jelatin kapsüllere yerleştirin. Numunelerin, reçinenin etiketleri tahrip etmemesi için küçük bir kağıt yaprağı ve bir kalem kullanılarak etiketlendiğini unutmayın.Jelatin kapsülleri kapatın. Kapsülleri plastik mikrosantrifüj tüplerine koyun. Açılır rotorda bir dakika boyunca 130 g'da santrifüjleyin.Bir vakum pompası kullanarak kapsülleri plastik tüplerden çıkarın. Numuneleri fırına taşıyın ve 48 saat boyunca 56 derecede polimerize edin. Blokları tutucuya monte ederek hazırlayın.Tutucuyu ultramikrotomun içine yerleştirin. Elmas bıçağı takın. Deiyonize su ile doldurun.Unutmayın, bıçağı tesadüfi hava kabarcıklarından temizleyin. Ardından, deiyonize su banyosu üzerinde elmas bir bıçak kullanarak bölümleri kesin. Artıkları sığır kirpik kullanarak ayarlayın.Ardından, bunları Formvar / karbon nikel ızgarasının parlak tarafına yerleştirin ve kurutun. Karanlık odada, sentetik apatitlerin ve hücre örneklerinin ızgaralarını etanol içinde %2,5 uranil asetat ile oda sıcaklığında davlumbaz altında 20 dakika boyunca boyayın. Izgaraları %50 etanolde, ardından deiyonize suda yıkayın ve oda sıcaklığında 24 saat kurutun.Son olarak, ızgaraları kutuya koyun. Berilyum tutucuyu minerallerin ve hücrelerin gözlemlenmesi için hazırlayın. Antistatik aletler kullanın.Vida çiftini çıkarın. Berilyum plakasını ve berilyum yıkayıcıyı tutucunun geri kalanından kaldırın. Izgarayı, parlak tarafı yukarı bakacak şekilde tutucuya monte edin.Berilyum rondelasını ve berilyum plakasını dikkatlice yerleştirin. Sabitleme vidalarını sıkıca vidalayın. Tutucuyu vakum odasına yerleştirin ve vakum pompasını açın.Bir vakum elde edildiğinde, tutucuyu yavaşça görüntüleme odasına yerleştirin ve ışını açın. Floresan monitörde, mikroskobun açıklık parametrelerini ayarlayın. Görüntü astigmatizma düzeltmesi yapın.Yakınlaştırmayı, odaklamayı, çerçeveyi ayarlayın ve bir transmisyon elektron mikroskobu görüntüsü alın. Dedektörü görüntüleme odasına taşıyın. Odak modunda görüntünün keskinliğini ayarlayın.X-ışını mikroanalizi için numunede bir nokta seçin ve spektrumları toplayın. İyon haritalaması yapmak için kalsiyum, flor, klor ve fosfor gibi elementleri seçin ve seçilen elementlerin haritalarını gerçekleştirin. Uyarılmış Saos hücreleri, hFOB osteoblastlarından daha verimli bir şekilde mineralize edildi.UV ışığı uyarımı altında sadece florapatitler gözlenebilir. HFOB hücre lizatları, Saos'tan daha fazla floresandı, bu da florapatitlerin bu hücrelerde daha bol olduğunu düşündürdü. Uyarılmış Saos hücreleri, hFOB hücrelerine ve dinlenme Saos hücrelerine kıyasla mineral içeren daha fazla vezikül üretir.Sentetik apatitlerin farklı mineral formları vardı. Yukarıda uygulanan prosedür, istirahat ve uyarılmış koşullar altında hFOB ve Saos hücrelerinde veziküllerin varlığını göstermiştir. Kırmızı noktalar kalsiyum, yeşil fosfor ve mavi flor dağılımlarını gösterir.Uyarılmış koşullar altında, Saos hücreleri tarafından üretilen veziküllerdeki kalsiyum ve fosfor dağılımları arasında ve hFOB hücreleri tarafından üretilen veziküllerdeki flor ve fosfor arasında güçlü bir örtüşme vardı. Sonuç olarak, bulgularımız veziküllerin özellikle hücresel düzeyde mineral çekirdeklenmenin temel belirleyicileri olduğunu göstermektedir. Daha verimli bir şekilde mineralize olan Saos-2 hücrelerinden salınan veziküller ile hFOB 1.19 hücrelerinden salınan veziküllerin karşılaştırılması, matriks veziküllerinin mineral dolu veziküller olduğu hipotezini desteklemektedir.Bu, apatit çekirdeklenmesini indüklemek için matriks veziküllerinin varlığının gerekli olup olmadığı ve bunun fizyolojik ila patolojik mineralizasyonu nasıl değiştirebileceği sorusunu açık bırakır.

analysis-minerals-produced-hfob-119-saos-2-cells-using-transmission

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Burada, senkrotron X-ışını floresansı kullanarak bir numunedeki metallerin miktarının ve dağılımının nasıl belirleneceğine dair bir protokol sunuyoruz. Yapışık hücrelere odaklanıyoruz ve bu numuneyi hazırlamak için kimyasal fiksasyon yöntemini açıklıyoruz. Daha sonra senkrotron X-ışınları kullanarak numunenin nasıl monte edileceğini ve görüntüleneceğini açıklıyoruz.

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

Üç boyutlu tek nanopartiküller içindeki element dağılımlarını karakterize etmek için taramalı transmisyon elektron mikroskobunda enerji dağıtıcı X-ışını tomografisinin kullanımı açıklanmaktadır.

Bireysel Nanopartiküller 3D Elemental Haritalama için Enerji Dağılımı X-ışını Tomografi

Çünkü paladyum, altın ve kobaltın önemi ve yaygın kullanımı   yüksek teknoloji ekipman metaller, onların kazanımı ve geri dönüştürülmesi önemli bir sanayi sorun oluşturmaktadır. Burada tarif edilen metal geri kazanım sistemi basit, düşük maliyetli, kentsel madeninden bu metallerin etkin algılama, kaldırma ve geri kazanımı için anlamına gelir.

Algılama ve Palladium Kurtarma Kentsel Madeninde Altın ve Kobalt Metal Nano Wagon tekerlekli şeklindeki Porların ile Belirlenmiş Yeni Sensörler / adsorbanlar kullanma

Eser metal analizi için dipol destekli katı faz ekstraksiyon mikroçipinin üretim protokolü sunulmuştur.

Su Örneklerinde Eser Metal Analizi için Dipol destekli Katı Faz Ekstraksiyon Microchip Fabrikasyon

Biz kimyasal elementler mevcut içinde in situ insan hücreleri hem de onların vitro miktar tespiti için açıklayınız. Yöntem herhangi bir hücre tipi için uygundur ve Tek Kişilik hücrelerde vitro metal oksit nano tanecikleri pozlama takip kantitatif kimyasal analizler için özellikle kullanışlıdır.

Situ Algılama ve Metal Oksit nano tanecikleri nükleer Microprobe analizi ile tek hücre miktar

Burada, biz x-ışını Floresans uygun yazılımın kullanımı haritalar, Floresans mikroskobu veri miktar için Argonne Ulusal Laboratuvarı tarafından oluşturulan gösterir. Sonuç quantified veri elemental dağılımı ve stokiometrik oranları faiz örneği içinde anlamak için yararlıdır.

HARİTALAR kullanarak x-ışını Floresans veri miktarının

Biz gerçek zamanlı görüntüleme ve boehmite parçacıklar deiyonize su elemental kompozisyon analizi için bir yordam situ içinde sıvı Taramalı elektron mikroskobu ile mevcut.

Situ Su sıvı SEM kullanarak Boehmite parçacıklar karakterizasyonu

Biz dışarı hızlı iki boyutlu x-ışını floresans ve x-ışını microdiffraction eşleme örnekleri Laue (renkliden radyasyon) ya da (tek renkli radyasyon) toz difraksiyon kullanarak tek kristal veya toz taşımak istedim beamline kurulumunu açıklayan. Elde edilen haritalar zorlanma, yönlendirme, faz dağıtım ve plastik deformasyon hakkında bilgi vermek.

Sinkrotron x-ışını Microdiffraction ve Mineral ve kaya örneklerini floresans görüntüleme

Ekstremite lamellae morfolojisi, bileşimi ve aralığıanalizi volkanizma ve metamorfizma ile ilgili jeolojik süreçleri anlamak için gerekli bilgileri sağlayabilir. Bu lamellanın karakterizasyonu için APT'nin yeni bir uygulamasını savuruyoruz ve bu yaklaşımı elektron mikroskobu ve FIB tabanlı nanotomografinin geleneksel kullanımıyla karşılaştırıyoruz.

Çözülmüş Mineral Evrelerinin Atom Prob Tomografisi Analizi

Burada silikon nitrür membranlar ve dalma-donma bir senkrotron kriyojenik X-ışını nanoprobun ile X-ışını floresan görüntüleme öncesinde hücre kültürü için bir protokoldür. Sadece oda sıcaklığında nano-analiz yapıldığında, dondurulmuş numuneler daha da dondurularak kurutulabilir. Bunlar hücre içi element bileşimi hakkında bilgi edinmek için kritik adımlardır.

Silikon Nitrür Membranları ve Synchrotron X-ışını Floresan Nano-Analizi için Kriyopreyeüzerine Hücre Kültürü

Azınlık türlerinden, ışık elementlerinden, oksijen boşluklarından ve diğer nokta/çizgi/düzlemsel kusurlardan güvenilir bir şekilde bilgi alan olay elektron ışını sallama koşulları altında elektron kanallama fenomenlerinden yararlanarak safsızlıkların ve kimyasal durumlarının saha doluluklarını tahmin etmek için nicel mikroanaliz yöntemlerinin genel bir taslağını sunuyoruz.

Kristal Malzemelerdeki Fonksiyonel Dopant/Nokta Kusurlarının Elektron Kanalize-Geliştirilmiş Mikroanaliz ile Nicel Atomik Saha Analizi

Öğrenin hFOB 1.19 ve Saos-2 hücrelerinde mineralizasyon profillerini TEM ve EDX analiziyle karşılaştırma yöntemini. Bu protokol kemik biyolojisi ve doku mühendisliği araştırmalarına katkı sağlar.

Mineraller hFOB 1.19 tarafından üretilen ve SAOlar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını Microanalysis Analizi (Video) | JoVE Journal

Mineraller hFOB 1.19 tarafından üretilen ve SAO'lar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını Microanalysis Analizi

Daha fazla video keşfet