Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

Bu protokolün genel amacı, larva zebra balığı beyinlerinden nöronları, makrofajları ve mikrogliaları izole etmek ve qPCR ve transkriptomik gibi aşağı akış analizi yapmak için yüksek kaliteli RNA'yı çıkarmaktır. Transgenik larva zebra balığı, canlı görüntüleme için güçlü bir araçtır ve bize zaman içinde yaşam ortamlarında mikroglia gibi tek tek hücreleri gözlemleme fırsatı sunar. Bununla birlikte, işlevlerini ayrıntılı bir şekilde anlamak için gen ekspresyon profillerini anlamamız gerekir ve izolasyon ve sıralama protokolümüz bu amaç için tasarlanmıştır.

Bu tekniğin temel avantajı, gen ekspresyon profillerinde minimum değişiklikle farklı hücre tiplerini merkezi sinir sisteminden izole edebilmesidir, böylece hücre fonksiyonları ve özellikleri karakterize edilebilir. Bu protokolün etkinliği, etkinliğine yansır. Bu protokol ile, çeşitli alt uygulamalar için kısa süreler içinde yeterli miktarda RNA üretilebilir.

Zebra balığı embriyolarını metin protokolüne göre PTU içeren E3 ortamında büyüttükten sonra, DsRED pozitif nöronlarda GFP pozitif makrofajlar ve mikroglia için larvaları iki dpf'de taramak için bir floresan stereomikroskop kullanın. Embriyoları bir noktada homojenize etmek için, anestezi hazırlamak için 50 ml ortam başına 50 ml 15 milimolar Trikain hazırlayın. Daha sonra, bir seferde 10 larvayı, terminal anestezik hale getirmek için Trikain içeren buz gibi E3 ortamı ile doldurulmuş 55 ml'lik bir Petri kabına aktarmak için üç ml'lik bir Pasteur pipeti kullanın.

Bir steromikroskop altında, Petri kabının ortasına 10 larvayı hizalayın, ardından cerrahi mikro makas kullanarak larva başlarını yumurta sarısı kesesinin üzerinden geçirin. Üç ml'lik bir Pasteur pipeti ile tüm başlıkları alın ve mümkün olduğunca az sıvı ile bir ml buz gibi içeren buz üzerinde bir cam homojenizatöre aktarın. Medya A. Buz gibi soğuk E3 artı Trikain içeren her küçük Petri kabını her 30 dakikada bir yenisiyle değiştirin ve transeksiyonun soğuk E3 artı Trikain ortamında yapıldığından emin olun. Renk solmaya başladığında cam homojenizatördeki buz gibi Ortam A'yı değiştirin.

Tüm kafa grubu toplandıktan sonra, tüm Ortam A'yı cam homojenizatörden çıkarın ve bir ml taze buz gibi soğuk Ortam A ile değiştirin. Homojenizatör hala buz üzerindeyken, üç ila beş dpf larvası için 40 tur kırma ve dönüş ve yedi ve sekiz dpf larvaları için 50 tur gerçekleştirerek beyin dokusunu bozmak için sıkı oturan bir tokmak kullanın. Daha sonra, hücreleri seyreltmek ve miyelin ile aglomerasyonlarını azaltmak için hücre süspansiyonuna iki ml Ortam A ekleyin. Hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek buz üzerinde 50 ml'lik soğuk bir şahin tüpüne geçirerek hücre aglomerasyonunu ortadan kaldırın.

Bu adımı üç kez tekrarlayın. Bir ml hücre süspansiyonu alikotunu soğuk bir nokta beş ml'lik tüplere aktarın ve 10 dakika boyunca 300 kez g ve dört santigrat derecede döndürün. Ardından, 23 gauge bir inçlik iğne ile 10 ml'lik bir şırınga kullanarak süpernatanı çıkarın.

Bir ml buz gibi yüzde 22 yoğunluk gradyan ortamıyla, sıfır noktası beş ml buz gibi soğuk 1X dbps ile nazikçe kaplı, hücre peletini nazikçe yeniden süspanse edin. Tüpleri 30 dakika boyunca dört santigrat derecede yavaş ivmelenmede ara vermeden 950 kez g'de döndürün. Döndürmeden sonra, interfazlarında sıkışan miyelin içindeki dbps yoğunluk gradyan ortamını atın.

Daha sonra hücreleri yıkamak için yüzde iki NGS ile sıfır nokta beş ml Ortam A kullanın ve tüpleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 300 kez g'de döndürün. Mümkün olduğu kadar çok süpernatanı çıkarın, ardından hücre peletlerini aynı deneysel koşuldan yüzde iki NGS ile bir ml Ortam A'da bir araya getirin. İlgilenilen hücreler bir floresan proteini ifade ediyorsa, hücre süspansiyonunu 35 mikronluk bir hücre süzgeci kapağından geçirin ve bunları ışıktan korunan buz üzerinde soğuk 5 ml FACS tüplerine aktarın.

Mikroglia'yı immünostain etmek için, hücre peletini yeniden süspanse etmek için sıfır nokta üç ml Orta A artı yüzde iki NGS kullanın, daha sonra hücreleri üç adet bir nokta beş ml'lik tüp arasında bölün, biri otofloresanı ölçmek için boyanmamış hücreler için, biri ikincil bir antikorun mikrogliaya spesifik olmayan bağlanmasını ölçmek için ve üçüncüsü bir test olarak. Tüm tüplere, immünoglobulinlerin FC alanı ile CD16, CD32 etkileşimlerini bloke etmek için yüzde bir düşük endotoksin azid içermeyen veya bir yaprak ekleyin. Daha sonra hücreleri her beş dakikada bir hafif çalkalama ile 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra, üçüncü tüpe 4C4 antikorunu ekleyin ve her 10 dakikada bir hafif çalkalama ile 30 dakika inkübe edin. Daha sonra tüpleri 10 dakika boyunca 300 kez g ve dört santigrat derecede döndürün. Süpernatanı attıktan sonra, tüpleri tekrar döndürmeden önce peleti sıfır nokta beş ml Media A artı yüzde iki NGS ile bir kez yıkayın.

Hücre peletini sıfır nokta beş ml Media A artı yüzde iki NGS ile yeniden süspanse edin, ardından yüzde bir yaprak ekleyin ve hücreleri her beş dakikada bir hafif çalkalama ile 10 dakika inkübe edin. İkinci ve üçüncü tüplere ikincil antikorlar ekleyin ve tüpleri karanlıkta yerleştirin. Tüpleri döndürdükten ve süpernatanı attıktan sonra, numuneleri iki kez yıkamak için sıfır nokta beş ml Media A artı yüzde iki NGS kullanın, ardından hücre peletlerini bir ml Orta A artı yüzde iki NGS ile yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu 35 mikronluk bir hücre süzgeci kapağından geçirin ve ışıktan korunan buz üzerinde soğuk beş ml'lik FACS tüplerine aktarın. Son olarak, metin protokolüne göre FACS sıralaması ve RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. Bu çalışmada, nöronlar ve makrofajlar artı mikroglia, sekiz dpf mpeg1 EGFP pozitif NBT dsRED-pozitif larvadan izole edildi.

FACS, hücreleri büyüklükleri ve taneciklikleri nedeniyle döküntülerden ayırmak için kullanıldı. Tek hücreler daha sonra çiftlerden veya hücre aglomeralarından ayrıldı. Tek hücre popülasyonundan, ölü hücreleri ortadan kaldırmak için bir kapı çizildi.

Karşılık gelen nokta grafiği, bu deneysel protokolün, ölü hücrelerin oranı sadece yüzde 26.7 olduğu için hücre plazma zarı bütünlüğünü koruduğunu ortaya koydu. Burada gösterildiği gibi, nöronlar ve makrofajlar artı mikroglia, canlı hücre popülasyon kapılarından kolayca ayrıldı. Beyin içinde, nöron popülasyonunun makrofaj ve mikroglia popülasyonundan daha belirgin olduğu ortaya çıktı.

İkinci bir çalışmada, FACS sınıflandırması, mikrogliaları spesifik olarak etiketleyen bir antikor olan 4C4 ile larva beyinlerinden canlı mikrogliaları izole etmek için kullanıldı. Bu mikroglia izolasyonu ve RNA ekstraksiyon verileri tablosunda özetlendiği gibi, zebra balığı larva beyinlerindeki mikroglia sayısı değişir ve üç dpf'de çok düşüktür. Son olarak, beş dpf larva zebra balığı beyninin mikrogliasından bir deneyle elde edilen RNA ekstraksiyon sonuçları, ribozomal RNA'nın net bir görselleştirmesi ile bu elektroforez izinde gösterilmiştir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, koşul başına kaç kafaya ihtiyaç duyulduğuna bağlı olarak 12 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, RNA bozulmasını önlemek için her şeyi soğuk tutmayı ve yüzeyleri temiz tutmayı unutmamak önemlidir. Bu teknik, geliştirildikten sonra, fizyolojik ve patolojik koşullar altında farklı hücrelerin gen ekspresyon profillerini araştırmak için zebra balığını model olarak kullanan nörobilim alanındaki araştırmacıların önünü açıyor.

Videoyu izledikten sonra, larva zebra balığı beyinlerinden nöronları, makrofajları ve mikrogliaları nasıl izole edeceğinizi ve qPCR ve transkriptomik gibi aşağı akış analizlerini gerçekleştirmek için yüksek kaliteli RNA'nın nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız.