Otomatik slayt tarama ve segmentasyon Fluorescently etiketli dokularda Widefield yüksek-içeriği analiz sistemi kullanılarak
3 Mayıs 2018
Burada bir widefield yüksek-içerik analizi sistemi (WHCAS) kullanarak slaytlarda fluorescently etiketli dokuların otomatik bölümleme için bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralının Nefelometri biyolojik bilimler, tıbbi mühendislik ve Sağlık Bilimleri de dahil olmak üzere biyolojik dokularda floresan işaretleri içeren herhangi bir alanda geniş kapsamlı uygulamalar vardır.
Bu görüntüleme ve analiz yönteminin genel amacı, floresan etiketli slayta monte edilmiş herhangi bir doku numunesinin otomatik segmentasyonu için kurulumu kolay bir iş akışı oluşturmaktır. Bu yöntem, biyolojik bilimler alanında, ilgilenilen bir doku örneğinin belirli bir alanında belirli bir proteinin ne kadarının bulunduğuna dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajları, otomatik segmentasyon için zaman optimizasyon protokollerinin kaydedilebilmesi ve bu yöntemin daha sonraki floresan etiketli slaytla monte edilmiş doku örneklerine uygulanmasına izin vermesidir.
Bu yöntem için ilk olarak, beyin dokusundaki yeni hücreleri yüksek bir büyütme oranıyla ölçmemiz gerektiğinde aklımıza geldi. Günlükleri içe aktardıktan sonra, Plaka Edinme Kurulumu iletişim kutusunu açın ve Hedef ve Kamera sekmesini açın. Büyütmeyi dört kata, Kamera gruplamasını bire ve Kazancı ikiye ayarlayın.
Plaka Slayt Tarama sekmesini açın ve uygun deneysel ayarları girin. Ziyaret Edilecek Siteler sekmesi altında, kuyuları sitelerle eşit şekilde doldurun ve uygun deneysel değerleri girmek için Plaka Alt Ayarlarını Düzenle sekmesini açın. Bu ayarları Ayar A olarak kaydettikten sonra, Objektif ve Kamera sekmesini açın ve Büyütmeyi 40 kata, Kamera gruplamasını bire ve Kazancı ikiye ayarlayın.
Plaka Kaydırma Tarama ve Plaka Alt Ayarlarını Düzenle sekmeleri altındaki tüm ayarların Ayar A için girilenle aynı olduğunu onaylayın ve Edinme Döngüsü sekmesini açın. Örnekte bulunan dalga boylarının sayısını girin ve Lazer tabanlı odaklamayı etkinleştir ve Görüntü tabanlı odaklamayı etkinleştir seçeneklerini işaretleyin. Ardından bu ayarları Ayar B olarak kaydedin.Ardından, çentiğin yan tarafındaki etiket aşağı bakacak şekilde üç adede kadar sürgüyü kayar adaptöre yerleştirin.
Ve ana menüyü açmak için F4 tuşuna basın. Slayt Tarama'yı seçin ve slayt adaptörünü geniş alan yüksek içerik analiz sistemine takmak için Açık Kapı Çıkarma Slaytı'na tıklayın. Ardından Kapı Yükleme Slaytını Kapat'ı tıklayın.
Başlamak için uygun dalga boyunun seçildiğinden emin olun. İlgilenilen bölge bulununcaya kadar canlı özellik görüntüsündeki farklı sitelere gidin. Bölgeye odaklanın.
Odakta değilse, Otomatik Odaklama düğmesini kullanın veya odak olana kadar adım boyutunu ayarlayın. Adım boyutunu değiştirerek odağı manuel olarak ayarlıyorsanız, görüntüyü yakalamak için Tuttur'u kullanın. Önceki bir taramayı ayarlamak için önce Ayar A'yı yükleyin ve Slaytları Önizle'yi seçin.
Slayt sayısını belirtin ve Tamam'ı seçin. Büyütme olarak dört kez seçin. Ardından Lamel aşağı'yı seçin ve önceki tarama için temel ayarlarınızı seçmeye devam edin. İptal'i seçmeden önce hem Edinme ayarının hem de Kalibrasyonların işaretli olduğundan emin olun ve Devam'a basın.
W1:DAPI sekmesi altında, Canlı'ya ve ardından Otomatik Açığa Çıkar'a ve ardından Snap'e tıklayın. Bundan sonra Kapat'a basın. Dizini seçin ve önceki bir tarama adını girin.
Bölge Çiz iletişim kutusu otomatik olarak görünecektir. Önceki tarama bölgesinin tamamını seçmek için dikdörtgen bölge aracını kullanın ve Devam'a tıklayın. Önceki taramanın sonunda, Ayar B'yi yükleyin ve Ziyaret Edilecek Siteler sekmesini açın.
Başlamak için uygun dalga boyunun seçildiğinden emin olun. İlgilenilen bölge bulununcaya kadar canlı özellik görüntüsündeki farklı sitelere gidin. Bölgeye odaklanın.
Odakta değilse, Otomatik Odaklama düğmesini kullanın veya odak olana kadar adım boyutunu ayarlayın. Adım boyutunu değiştirerek odağı manuel olarak ayarlıyorsanız, görüntüyü yakalamak için Tuttur'u kullanın. Ardından, W1 DAPI sekmesi altında, Otomatik Pozlama'ya tıklayın ve Plaka Alımları Snap DAPI görüntüsünün net olduğunu onaylayın.
Ana menü altında, Günlük'e tıklayın ve açılır menüden Günlüğü Çalıştır'ı seçin. Başlatmak için Slide Region Acquisition Setup Journal'a çift tıklayın ve Setup Slide Region Acquisition iletişim kutusu göründüğünde Continue (Devam) düğmesine tıklayın. Talimat verildiğinde, düşük büyütmeli slayt görüntüsünü seçmek için DAPI Taraması'nı seçin ve Tamam'a tıklayın. Plaka Edinme Snap'i istendiğinde, Plaka Edinme Snap-DAPI'yi vurgulayın ve Tamam'a tıklayın. Bölgeler Oluştur veya Yükle kutusu görüntülendiğinde, DAPI Taraması'nda ilgilenilen bölgeleri seçmek için Dikdörtgen Bölge aracını kullanın ve Devam'ı tıklatın.
Konum belirleme aracını kullanarak, ilgilendiğiniz bölgeyi vurgulayın ve Bölge Seç iletişim kutusunun altındaki Devam'a tıklayın. Bölgeleri onayla kutusu görüntülendiğinde, Devam'ı tıklatın ve Bölgeleri Kaydet iletişim kutusu görüntülendiğinde bölgenin kaydedilmesi gerekip gerekmediğine karar verin. Üç diyalog kutusu görünecektir.
Kurulum Tamamlandı kutusunu kapatmak için Devam'a tıklayın. Herhangi bir örnek site bulma tahminini ortadan kaldırmak için, Görüntü Ayarları sekmesi altındaki Çekim sırasında görüntüleri görüntüle seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun ve önceden seçilen ilgi alanının aşamasını konumlandırmak için Plaka Al'a tıklamak için Özet sekmesini açın. Kamera, ilgilenilen hücreleri içeren bir sitenin üzerine kaydırıldığında, görüntü alımını durdurmak için İptal'i tıklatın.
Görüntü odak dışındaysa paniğe kapılmayın. Bu adım, yalnızca ilk sitenin sahnesini seçtiğiniz ilgi alanına yerleştirmek içindir. Sahnenin numunenin üzerinde yer aldığını ve site sayısını doğru girdiğinizi onaylayın.
Yüksek dinamik aralıkta odaklanılan bir görüntü elde edildiğinden emin olmak için dalga boyu ayarlarını optimize edin. Ardından, Özet sekmesini tekrar açın ve Plakayı Al'a tıklayın. Analizin sonunda Görüntü sekmesini seçin.
Image Overlay (Görüntü Katmanı) açılır menüsünde, site numaralarını sol üst köşede görüntülemek için Kuyu bilgilerini göster'i seçin. Siteler arasında ilerleyin ve odak dışında olan ve/veya dokuda doku kıvrımları veya kabarcıklar ve yırtıklar içeren siteleri hariç tutun. Bu temsili görüntüde, tanımlanan ilgi alanındaki tüm sitelerin yüksek büyütmeli küçük resimleri gösterilir.
Analizden çıkarılması gereken siteleri belirlemek için her site gözden geçirilmelidir. Örneğin, bu deneyde, 149. bölge odak dışındaydı, 219. site kabarcıklar vardı ve 54. site bir kıvrım içeriyordu. Bu sitelerin üçü de analizden çıkarıldı.
Burada, çok dalga boylu hücre puanlama modülü tarafından oluşturulan ilgili kaplamalar, deneysel spesifikasyonlara göre özelleştirilmiş olarak site 59'da gerçekleştirilen otomatik segmentasyonun sonuçlarını göstermektedir. Segmentasyonu takiben, her bir belirteç, her bir belirteç, her iki belirteç, belirteçsiz, ortalama lekeli alan ve ortalama floresan yoğunluğu için pozitif boyanan hücrelerin oranının kantitatif verileri elde edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, slayta monte edilmiş bir doku örneğinin görüntülenmesi ve segmentasyonu için otomatik bir iş akışı oluşturmak üzere geniş alan yüksek içerik analiz sisteminizi nasıl kuracağınızı iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu makale, geniş alanlı yüksek içerikli analiz sistemleri (WHCAS) kullanılarak floresan işaretli dokuların otomatik segmentasyonu için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, biyolojik bilimler ve tıbbi mühendislik dahil olmak üzere çeşitli alanlara fayda sağlayarak biyolojik dokulardaki floresan markerların nicelendirilmesini kolaylaştırmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyolojik Bilimler
- Tıbbi Mühendislik
- Sağlık Bilimleri
Arka Plan
- Otomatik segmentasyon, floresan işaretli dokuların analizini geliştirir.
- Yüksek içerikli analiz sistemleri, biyolojik örneklerin ayrıntılı görüntülemesini kolaylaştırır.
- Doku örneklerindeki proteinlerin miktarsal tayini, biyolojik süreçlerin anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- Bu yöntem, beyin dokusundaki yeni hücrelerin miktarının belirlenmesindeki zorlukları gidermek için geliştirilmiştir.
Çalışmanın Amacı
- Doku örneklerinin otomatik segmentasyonu için verimli bir iş akışı oluşturmak.
- Floresan işaretleyicilerin nicelleştirilmesindeki doğruluk ve hızı artırmak.
- Çeşitli doku türlerine uygulanabilir standart bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için geniş alanlı yüksek içerikli analiz sisteminin kurulumu.
- Optimal görüntüleme için deneysel ayarların yapılandırılması.
- Görüntü elde etme ve analiz için yazılım araçlarının kullanımı.
- Otomatik odaklama ve görüntü tabanlı odaklama tekniklerinin uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Floresan işaretli dokuların başarılı bir şekilde segmentasyonu gerçekleştirilmiştir.
- Yüksek büyütmeli görüntüleme, doku örneklerinin detaylı görünümlerini sağlamıştır.
- İlgi bölgeleri doğru bir şekilde tanımlanmış ve analiz edilmiştir.
- Odak dışı veya bozulmuş görüntüler için dışlama kriterleri belirlenmiştir.
Sonuçlar
- Otomatik segmentasyon protokolü, analiz süresini önemli ölçüde azaltır.
- Bu yöntem, geniş bir biyolojik doku yelpazesine uygulanabilir.
- Gelecekteki uygulamalar, çeşitli bilimsel alanlardaki araştırmaları geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Geniş alan yüksek içerikli analiz sisteminin (WHCAS) kullanıldığı otomatik slayt tarama ve segmentasyonu, büyük doku kesitlerindeki floresan belirteçlerin miktar tayinindeki darboğazı gidererek hedef doğrulama ve assay geliştirme için tekrarlanabilir, yüksek kapasiteli analizlerin gerçekleştirilmesine olanak tanır. Görüntüleme ve segmentasyon iş akışlarını standart hale getirerek bu yöntem, değişkenliği azaltır ve doku tabanlı biyobelirteçlerin preklinik değerlendirmesini hızlandırarak erken keşif aşamasındaki veri odaklı karar verme süreçlerini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilişkili dokulardaki protein ekspresyon paternlerini nicelendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Bireysel deneyler için protokol optimizasyonuna harcanan süreyi azaltarak, çok sayıda floresan işaretli hedefe hızlı uygulama imkanı sağlar.
- Öngörücü Değer: Markör lokalizasyonu ve ekspresyon seviyelerinin tutarlı, kantitatif okumaları aracılığıyla mekanistik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Yüksek içerikli analizlar için uygun, standartlaştırılmış ve bölütlenmiş doku görüntüleri oluşturarak, aşağı akış taramaları için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Otomatik bölge seçimi ve bozulmuş bölgelerin (örneğin, odak dışı, katlanmış veya kabarcıklı dokular) hariç tutulması yoluyla analiz standartlaştırmasını ve tekrarlanabilirliğini artırır.
- Ölçeklenebilirlik: Protein lokalizasyonu, proliferasyon, viabilite, apoptoz ve anjiyogenez için önceden oluşturulmuş yazılım modülleri aracılığıyla platformun farklı markörler ve doku tipleri genelinde yeniden kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Marker pozitif hücre oranları, ortalama boyanmış alan ve floresans yoğunluğu hakkında kantitatif veriler sağlayarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan süreçte tutarlılığı korur.
- Riski Azaltılmış İlerleme: Gerçek biyolojik sinyali yansıtan, dışlamalı filtrelemeden geçirilmiş güvenilir veri setleri sunarak preklinik karar alma süreçlerini destekler.
- Hastalıkla İlişkili Sistem: Beyin tümörü doku analizlerinde uygulanabilirliği kanıtlanmış olup, lam üzerine monte edilmiş dokulardaki herhangi bir floresan işaretli nükleer veya sitoplazmik markere genişletilebilir.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, Erken Keşif'ten Aday Belirleme'ye ve Preklinik Araştırmalar'a kadar keşif sürecine entegre olarak, her aşamada standartlaştırılmış doku analizine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: İlgi duyulan spesifik doku bölgelerindeki marker ekspresyonunu nicelleştirerek hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma çalışmalarını destekler.
- Tarama: Farklı merkezler arasında güvenilir bileşik değerlendirmesine olanak tanıyan otomatik segmentasyon ve kantitatif çıktılar aracılığıyla analiz hazırlığı sağlar.
- Analitik: Pozitif hücre oranı, ortalama boyanmış alan ve ortalama floresan yoğunluğu dahil olmak üzere ölçülebilir sonuçlar üreterek koşullar arası karşılaştırmaya imkan tanır.
- Translasyonel Araştırma: Validasyon çalışmaları için uygun, biyobelirteçlerle uyumlu kantitatif doku verileri sağlayarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Tutarlı lam tarama ve segmentasyon için önceden oluşturulmuş yazılım modüllerinden ve kaydedilmiş ayarlardan (Ayarlar A ve B) yararlanarak projeler arası yeniden kullanılabilir bir yetenek olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulama konusunda öngörücü güven, doku bazlı analizlerde mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Doku görüntüleme ve analiz iş akışlarının standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: İyileştirilmiş devam/durdur kararları, azaltılmış protokol optimizasyon süresi sayesinde sermaye verimliliği ve daha düşük geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Kantitatif, dışlama ile doğrulanmış doku verilerine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerletme kararları.
Uygulama Hususları
- Geniş alanlı yüksek içerikli analiz sistemi işletimi ve ilgili yazılım navigasyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Slayt tarama, çok dalga boylu görüntüleme ile lazer ve görüntü tabanlı odaklama yapabilen cihazlara bağımlıdır.
- Görüntüleme ayarlarının (örneğin büyütme, binning, kazanç) ve ilgi alanı (ROI) tanımlama protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Yöntemin farklı doku tiplerine, marker ekspresyonlarına veya slayt kalınlıklarına uygulanması sırasında adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Otomatik görüntülemeye rağmen, artefakt içeren bölgelerin (örneğin odak dışı görüntüler, doku katlanmaları, hava kabarcıkları) manuel olarak hariç tutulması gerekliliği gibi pratik sınırlamaları kapsar.
