Dopamin D1-Alfa reseptör kemirgen Nucleus Accumbens bir yenilikçi RNA Situ içinde hafiye teknoloji tarafından içinde tanımlaması

Bu yeni RNA in-situ hibridizasyon testinin genel amacı, merkezi sinir sistemi hastalığı sırasında dopaminerjik disfonksiyonu açıklığa kavuşturmak için kritik olan belirli bir beyin bölgesindeki tek RNA moleküllerini görselleştirmektir. Bu yöntem, dopaminerjik anormallikler, davranışsal tepkilere aracılık etme ve çalışma belleği işlevini modüle etme gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin en önemli avantajı, santral sinir sistemi hastalıklarının ilerlemesi sırasında dopamin sistemi disfonksiyonunu araştırmak için yeni bir in-situ hibridizasyon tekniği sağlamasıdır.

Bu yöntem, belirli bir beyin bölgesindeki bir hedef mRNA'nın genel ekspresyon seviyeleri hakkında fikir verebilse de, mRNA transkriptlerinin belirli bir bölgenin hücreleri boyunca nasıl dağıldığını belirlemek için de uygulanabilir. Bu işleme başlamak için, yetişkin bir sıçan beynini topladıktan sonraki beş dakika içinde, 15 saniye boyunca sıvı nitrojene batırın. Daha sonra, beyni eksi 20 santigrat derecede bir kriyostatta bir saat boyunca dengeleyin.

Bir saat sonra, nükleus accumbens içeren 30 mikronluk kesitleri 2,76 milimetreden 2,28 milimetreye kadar bregma önünden kesin ve slaytlara monte edin. Ardından bölümleri eksi 20 santigrat derecede 10 dakika kurutun. Daha sonra, slaytları dört santigrat derecede bir saat boyunca önceden soğutulmuş %4 paraformaldehite batırın.

Daha sonra, slaytları oda sıcaklığında artan bir etanol gradyanına yerleştirin ve ardından slaytları beş dakika daha taze% 100 etanole aktarın. Daha sonra, havanın kurumasını sağlamak için slaytları emici kağıdın üzerine yerleştirin. Bariyer kalemi ile her bölümün etrafına bir bariyer çizin.

Bariyerin bir dakika tamamen kurumasını bekleyin. Beyin bölümlerini ön işleme tabi tutmak için fırını açın ve sıcaklığı 40 santigrat dereceye ayarlayın. Her beyin bölümüne üç damla tedavi öncesi reaktif ekleyin.

Daha sonra bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, slaytları oda sıcaklığında bir dakika boyunca 1X PBS'ye batırın ve slaytları bir dakika daha taze 1X PBS'ye aktarın. Slaytlar 1X PBS'de 15 dakikadan daha uzun süre kalmamalıdır.

Multipleks tahlili çalıştırmak için, hedef probu bir su banyosunda 40 santigrat derecede 10 dakika ısıtın ve ardından oda sıcaklığına soğutun. RNA reaktifini oda sıcaklığına yerleştirin. Slaytlardaki fazla sıvıyı emici kağıtla alın ve tekrar slayt rafına yerleştirin.

Daha sonra her numune dilimine prob olarak üç damla Drd1alpha ekleyin ve numuneleri 40 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Daha sonra, slaytları 1X yıkama tamponunda oda sıcaklığında iki dakika boyunca iki kez yıkayın. Ardından, emici kağıtla slaytlardaki fazla sıvıyı alın ve tekrar slayt rafına yerleştirin.

Kuluçka adımları arasında beyin bölümlerinin kurumasına izin vermeyin. Her numune dilimine üç damla AMP 1FL ekleyin ve numuneleri 40 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, slaytları 1X yıkama tamponunda iki kez oda sıcaklığında her seferinde iki dakika yıkayın.

Ardından, emici kağıtla slaytlardaki fazla sıvıyı alın ve tekrar slayt rafına yerleştirin. Daha sonra, her numune dilimine üç damla AMP 2FL ekleyin. Numuneleri 40 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Ardından, slaytları oda sıcaklığında iki dakika boyunca 1X yıkama tamponuna iki kez daldırın. Slaytlardaki fazla sıvıyı emici kağıtla alın ve tekrar slayt rafına yerleştirin. Her numune dilimine üç damla AMP 3FL ekleyin ve numuneleri 40 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Ardından, slaytları 1X yıkama tamponunda oda sıcaklığında iki dakika boyunca iki kez yıkayın. Slaytlardaki fazla sıvıyı emici kağıtla alın ve tekrar slayt rafına yerleştirin. Daha sonra her numune dilimine üç damla AMP 4FL ALT A ekleyin ve numuneleri 40 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Sürgüyü 1X yıkama tamponunda oda sıcaklığında iki dakika boyunca iki kez yıkayın. Slaytlardaki fazla sıvıyı çıkarın ve hemen her bölüme iki damla montaj reaktifi yerleştirin. Ardından, her beyin bölümünün üzerine 22 milimetreye 22 milimetrelik bir lamel yerleştirin.

Ardından slaytları karanlıkta kuruyana kadar iki ila sekiz santigrat derecede saklayın. Görüntüleme için konfokal mikroskobu açın ve 60X objektife geçin. Z yığını görüntülerini elde edin ve nucleus accumbens bölgesindeki Drd1alpha etiketli hücrelerin görüntülerini elde edin.

Ayrık nokta boyama desenini gösteren nucleus accumbens'ten alınan görüntüler için, dinamik ifade aralığı yarı kantitatif bir analiz kullanılarak değerlendirildi. Her hücre, hücre başına nokta sayısına bağlı olarak sıfırdan dokuza kadar puanlandı. Bu hibritleştirilmiş sinyal skoru yöntemi, böylece tek tek hücreler arasında Drd1alpha ekspresyonunun kapsamını ve değişkenliğini değerlendirebilir.

İşte erkek ve dişi sıçanlarda Drd1alpha ekspresyonunun temsili konfokal görüntüleri, ayrı nokta boyama desenine sahiptir. İç içe veri yapısını hesaba katmak için, her kategori için ortalama sayım değerleri hesaplandı ve istatistiksel analiz için kullanıldı. Erkek ve dişi sıçanlarda medyan hücre sayısındaki farklılıkları değerlendirmek için bir Mann-Whitney U testi yapıldı.

Her kategorideki hücrelerin frekansı, bağıl frekans ve kümülatif frekans kullanılarak analiz edilir. Dişi hayvanlar, erkek hayvanlara göre daha düşük dereceli kategorilerde daha yüksek hücre sıklığı ile dağılımda önemli bir kayma gösterdi. Genel olarak, sonuçlar nucleus accumbens'teki Drd1alpha ekspresyonunda belirgin cinsiyet farklılıkları olduğunu göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yedi saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, sıcaklık değişiklikleri veya dokunun kuruması mRNA'ya zarar verebileceği ve güvenilir bir sinyal alma yeteneğimizi engelleyebileceği için hızlı çalışmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kortikal dokularda yerinde hibridizasyon tekniğinin nasıl uygulanacağını, seçilen beyin bölgelerinde mRNA transkriptlerini floresan olarak nasıl görüntüleyeceğinizi, mRNA transkriptlerinin dağılımını nasıl karakterize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.