Canlı, insan direnç arterler tarafından etiket içermeyen Floresans mikroskobu kolajen ve Elastin basınç bağımlı Microarchitectures değerlendirilmesi
9 Nisan 2018
Biz aynı anda mekanik test tarif ve insan direnç arterler ve elastin ve kolajen mekansal organizasyon ve birim yoğunlukları miktar için Fiji ve Ilastik görüntü analizleri 3D görüntüleme izole, atardamar duvarı yaşıyor. Atardamar duvarı mekaniğinin matematiksel modellerinde bu veri kullanımını tartışın.
Bu metodolojinin genel amacı, hücre dışı matrisin mikro mimarisi ile arter duvarının mekaniği arasındaki ilişkinin analizi için canlı insan direnç arterlerinin görüntülerini elde etmek için standartlaştırılmış bir prosedür sağlamaktır. Bu yöntem, basıncın genel geometride ve vasküler duvarın mikro mimarisinde nasıl değişikliklere neden olduğu gibi vasküler biyoloji ve mekanikteki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tekniğin ana avantajı, görüntüleme için numunenizi etiketlemeniz gerekmemesidir.
Bu yöntem dirençli arter mekaniği hakkında bilgi sağlayabilse de, protokolün değiştirilmiş bir versiyonu bronşlar gibi diğer tüp benzeri organlara veya insan mesanesinden veya bağırsak duvarından şeritlere uygulanabilir. Başlamak için, ameliyat sırasında eksizyonlarından hemen sonra ilgilenilen doku örneklerini toplayın ve damarları ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Kanüllü bir arteri beş milimetre cıvaya kadar basınçlandırın.
Ardından, iki fotonlu lazeri etkinleştirerek ve uyarma dalga boyunu 820 nanometreye ayarlayarak görüntüleme için optik yolu ayarlayın. Emisyon ışığını fotoğraf çarpanları arasında bölmek ve emisyonu aynı anda iki kanalda toplamak için 460 nanometre uzunluğunda geçişli bir dikroik ayna yerleştirin. Elastin otofloresansını toplamak için 520 nanometrede ortalanmış 30 ila 60 nanometre genişliğinde bant geçiren filtreler ve kollajen ikinci harmonik üretim sinyalini toplamak için 410 nanometrede ortalanmış başka bir bant geçiren filtre kullanın.
Şimdi lazer bekleme süresini ve pikseli 10 mikrosaniyeye ayarlayın. %100 görüş alanı için çözünürlüğü 512 x 512 piksel olarak ayarlayın. Fotoğrafın canlı artere zarar vermesini önlemek için sürekli taramayı etkinleştirin ve mümkün olduğunca düşük uyarma ışık gücü ve piksel bekleme süresi kullanın.
Ardından, maksimum çapa sahip düzlemi bulmak için arteri manuel olarak tarayın. Ardından, arterin en geniş çapını kaplayan dikdörtgen bir dilim seçin ve piksel başına 300 nanometre veya daha küçük piksel boyutuna sahip tek bir kareyi tarayın. Bu görüntüyü daha sonra analiz etmek üzere kaydedin.
Arterin maksimum çapında lümen çapını ve duvar kalınlığını belirlemek için önce görüntüyü Fiji'ye yükleyin. Ana menüye tıklayarak ölçeği ayarlayın ve ardından analize gidin ve ardından ölçeği ayarlayın. Buraya piksel başına mikrometre ve piksel oranını girin.
Ardından, Fiji çizgi aracını seçin ve arteriyel lümenin her iki yanındaki iki iç elastik lamina arasına bir çizgi çizin. Ardından, sonuç tablosundaki uzunluğu raporlamak için Kontrol M'ye tıklayın. Her duvarın kalınlığını ölçmek için daha fazla çizgi çizmeye devam edin ve son ölçümü kaydedin.
Bir veya daha büyük sayısal diyafram açıklığına sahip 60X objektife geçin. Arteriyel duvarın tüm kalınlığını tarayarak kollajen ve elastin mikro mimarisini beş milimetre cıvada görüntüleyin. Ardından, Z yığını başlangıç ve bitiş derinliğini ve Z adım aralığını ve piksel yoğunluğunu tanımlayın.
Z yığınlarınızı tasarlarken, sonraki analizlerinizde herhangi bir eğrilik çıkarımını önlemek için ilgi alanınızın yeterince küçük olduğundan emin olun. Tamamlandığında, her kanalı ayrı ayrı kaydedilecek şekilde ayarlayın. Son olarak, bir ila üç farklı ilgi alanı bulun ve iyi kalitede 3D görüntü yığınları elde edin.
Elastin otofloresanınız ağartılıyorsa, çok yüksek uyarma ışık gücü kullanıyorsunuz demektir. Bundan kaçınılmalıdır. Devam eden deneyinizi bitirmek için, elastin otofloresansını arttırmak için seyreltik bir eozin konsantrasyonu ekleyebilirsiniz.
Bittiğinde, tüm işlemi 100 milimetre cıvaya kadar değişen basınçlarda tekrarlayın ve her basınç adımından sonra miyograf odasındaki tamponu yeni 37 santigrat derece HBS ile değiştirin. Görüntü analizine başlamak için Fiji'de elastin görüntü yığınını açın. Ardından görüntüye gidin, yığınlara tıklayın ve çalışılacak görüntüleri seçmek için Z projesini seçin ve projeksiyon türü için maksimum yoğunluğu seçin.
Maksimum yoğunluk projeksiyonunu bir TIFF görüntüsü olarak kaydedin. Ardından mümkün olduğu kadar çok iç elastik lamina fiber dallanma noktası seçin ve bunları açı aracını kullanarak ölçün. Her görüntü üzerinde sistematik olarak çalışın ve işiniz bittiğinde Fiji sonuç sayfasını kaydedin.
Adventitial kollajenin dalgalılığını ölçmek için Fiji'deki kollajen görüntü yığınını açın. Ardından, görüntü yığınlarına kadar aşağı gidin ve çalışılacak görüntüleri seçmek ve maksimum yoğunluk projeksiyonunu ayarlamak için Z projesini seçin. Şimdi görüntüyü, türü ve ardından sekiz biti tıklatarak görüntü türünü sekiz bitlik bir TIFF görüntüsüne değiştirin.
Maksimum yoğunluk projeksiyonunu bir TIFF görüntüsü olarak kaydedin. Fiji'ye tıklayarak ve eklentiler altında Neuron J'yi seçerek Neuron J eklentisini açın. Ardından sekiz bitlik TIFF dosyasını Neuron J'de açın. Açıldıktan sonra, izleme ekle'ye tıklayın ve her bir fiberin başına ve sonuna tıklayarak analiz etmek için fiberleri seçin.
Ardından, izlemeleri ölçmeye gidin ve iletişim kutusunda ekran izleme ve köşe ölçümlerini seçin. Kolaj lifi düzlüğünü hesaplamak için önce Fiji izlemeleri penceresindeki değerleri Excel'e kopyalayın. İzleme penceresindeki uzunluk değerleri, analiz edilen kollajen liflerinin tam uzunluklarının ölçüleridir Lf.İkincisi, Fiji köşeleri penceresinin ilk ve son XY koordinatlarını analiz edilen her kollajen lif demeti için kopya Excel'e analiz edilir.
Ardından, Pisagor Teoremini kullanarak analiz edilen kollajen lifi L0'ın her iki ucunu birleştiren düz çizginin uzunluğunu hesaplayın. Kollajen lifi düzlüğü son olarak L0/Lf olarak hesaplanır. Az önce gösterilen protokolü takiben, arterin en geniş kısmı tespit edildi ve bu noktada arter, maksimum damar çapını ve damar duvar kalınlığını ölçmek için etiketsiz floresan mikroskobu kullanılarak tarandı.
Yüksek sayısal açıklık objektifine daha yüksek bir büyütme kullanarak, sadece damar çapı ve duvar kalınlığı değil, aynı zamanda kollajen ve elastinin mikro mimarileri de ölçülebilir. Elastin lifi dallanma açılarının ve kollajen düzlüğünün mikro mimarileri, uygun görüntü analiz yazılımı kullanılarak ardışık görüntü bölümlerinde belirlenebilir. Bu, kollajen ve elastin'in mikro mimarilerindeki basınca bağlı değişiklikler ile farklı basınçlarda artımlı elastik modül arasındaki ilişkinin doğrudan analizine izin verir.
Bu prosedürü takiben, görüntülerden başka bilgiler de çıkarılabilir. Bu, damar longitudinal ekseni boyunca adventisyel kollajenin oryantasyon melekleri olabilir veya tunika ortamındaki ekstraselüler matriksin mikro mimarisi olabilir. Bu yöntem kullanılarak görüntülerden çıkarılan nicel ölçümler, sağlıklı ve ölmüş insan dolaşımının farklı koşullara nasıl tepki verdiğini aydınlatmak için matematiksel modellere beslenebilir.
Bu videoyu izledikten sonra, basıncın dirençli arter duvarının mikro mimarisinde değişikliklere neden olduğu hakkında bilgi elde etmek için görüntüleme deneylerinizi ve müteakip görüntü analizinizi nasıl tasarlayacağınız konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. İki foton uyarmalı floresan mikroskobu ile çalışırken görünür ve görünmez ışığa maruz kalmaktan kaçınmanız gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, hücre dışı matris mikroarkitektürü ile arter duvar mekaniği arasındaki ilişkiyi analiz etmek amacıyla canlı insan direnç arterlerinin görüntülenmesi için standartlaştırılmış bir metodoloji sunmaktadır. Bu teknik, örnek etiketlemeye gerek kalmadan, basıncın damar duvarının geometrisi ve mikroarkitektürü üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Vasküler Biyoloji
- Biyomekanik
- Hücre Dışı Matris Analizi
Arka Plan
- Arter duvar mekaniğini anlamak, vasküler sağlık için kritik öneme sahiptir.
- Ekstraselüler matriks, vasküler yapı ve fonksiyonda önemli bir rol oynar.
- Canlı görüntüleme teknikleri, dinamik biyolojik süreçlere dair içgörüler sağlayabilir.
- Basınç kaynaklı vasküler geometri değişiklikleri, kardiyovasküler hastalıkların anlaşılması için önemlidir.
Çalışmanın Amacı
- Direnç arterlerini etiketleme yapmadan görüntülemek için bir yöntem geliştirmek.
- Arter duvarının mikroyapısı ile mekaniği arasındaki ilişkiyi incelemek.
- Diğer tüp benzeri organlara uygulanabilir bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Cerrahi eksizyondan hemen sonra doku örneklerinin toplanması.
- Damarların detaylı protokole uygun olarak hazırlanması.
- Kanüle edilmiş arterlerin beş milimetre cıva basıncına getirilmesi.
- Elastin ve kollajen görüntü analizleri için Fiji ve Ilastik kullanımı.
Temel Sonuçlar
- Canlı insan direnç arterlerinin görüntülemesi başarıyla gerçekleştirilmiştir.
- Elastin ve kollajenin uzamsal organizasyonunun kantifikasyonu yapılmıştır.
- Elde edilen veriler, arteriyel mekanik matematiksel modellerine entegre edilebilir.
- Yöntem, diğer organ sistemlerinde uygulanabilirlik potansiyeli göstermektedir.
Sonuçlar
- Geliştirilen metodoloji, vasküler mekaniğin anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Arter duvar özelliklerini incelemek için non-invaziv bir yaklaşım sunar.
- Bu teknik, çeşitli biyolojik dokulara uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Direnç arterlerindeki basınç kaynaklı mikro mimari değişikliklerin anlaşılması, ekstraselüler matriks yeniden şekillenmesini hemodinamik stresle ilişkilendirerek kardiyovasküler ilaç keşfinde hedef doğrulamasını destekler. Bu etiketsiz görüntüleme yaklaşımı, fizyolojik olarak ilgili basınçlar altında kolajen ve elastin reorganizasyonunun kantitatif değerlendirmesi yoluyla vasküler hedeflerin mekanistik risklerinin azaltılmasını sağlar. Yöntem, arteriyel mekaniğin matematiksel modellerine temel oluşturabilecek tekrarlanabilir, etiketten bağımsız yapısal veriler sunarak preklinik modeller için öngörücü güvenilirlik sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Vasküler duvar yeniden şekillenmesinin doğrudan çıktıları olarak elastin fiber dallanma açılarındaki ve kolajen düzlüğündeki basınca bağlı değişimleri nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Ekzojen belirteçlerden kaçınan, etiketsiz, canlı doku görüntüleme sağlayarak mekanistik değerlendirmenin doğru yapılması için doğal mikroarkitektürü korur.
- Öngörücü Değer: Mekanik sertlik ve hastalık ilerlemesi ile korelasyon gösteren kantitatif mikroarkitektürel parametreler (örneğin kolajen düzlüğü, elastin hizalanması) oluşturarak preklinik model doğrulamasını destekler.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Bileşik tarama kampanyaları için bazal vasküler fenotipler oluşturmak amacıyla kullanılabilecek, elastin ve kollajen mikroarkitektürünün standardize edilmiş, tekrarlanabilir 3D görüntü yığınları üretir.
- Kantitatif Çıktı: Yüksek içerikli analiz ve doz-yanıt modellemesine uygun olan internal elastik lamina dallanma açıları ve kollajen lif düzlüğü (L0/Lf) gibi ölçülebilir son noktalar sağlar.
- Platformun Yeniden Kullanımı: Protokolün diğer tüp benzeri organlara (örneğin bronşlar, bağırsak duvarı) uyarlanabilirliği, dokuplar arası hedef doğrulamasını ve keşif programları genelinde analiz taşınabilirliğini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: Direnç arteri yeniden şekillenmesinin bilinen bir katkıda bulunduğu hipertansiyon, diyabet ve metabolik sendromdaki patojenik mekanizmaları doğrudan ele alır.
- Translasyonel Süreklilik: Farmakolojik müdahalelere verilen in vivo yanıtları öngörmek için hesaplamalı modellere entegre edilebilen insan kaynaklı mikro mimari veriler sağlayarak, keşif ve preklinik aşamalar arasında köprü kurar.
- Riske Göre Ayarlanmış İlerleme: Test edilen bileşiklerin basınç kaynaklı mikro mimari değişiklikleri normalize edip etmediğine dayalı olarak "devam/dur" kararları alınmasını sağlar ve beklenmedik vasküler toksisite nedeniyle geç aşamada meydana gelen başarısızlıkları azaltır.
İş Akışı ve Süreç Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürecine uyum sağlayarak, aday bileşiklerin fizyolojik basınç koşulları altında vasküler ekstraselüler matris dinamiklerini nasıl etkilediğini değerlendirmek için insanla ilişkili bir platform sunar.
- Keşif Biyolojisi: Basıncın elastin ve kollajen mikromimarisini nasıl değiştirdiğinin doğrudan gözlemlenmesini sağlayarak hipotez testlerini destekler, vasküler sertleşme ve yeniden şekillenme mekanizmalarına açıklık getirir.
- Tarama: Tarama kaskadlarında otomasyona ve çok parametreli analize uygun, standartlaştırılmış, kantitatif görüntü tabanlı çıktılar (örneğin, fiber düzlüğü, dallanma açıları) üretir.
- Analitikler: Arter duvar mekaniğinin matematiksel modellerini besleyen yapısal metrikler sunarak, ekiplerin mikro-mimari değişiklikleri artımlı elastik modül gibi fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirmesine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Bulgular klinik vasküler yanıtlara uyarlandığında hastalıkla ilgiyi sağlamak ve öngörü gücünü artırmak için canlı insan direnç arterlerini kullanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Vasküler yeniden şekillenmeyi inceleyen kardiyovasküler, metabolik ve fibrotik hastalık programları genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir görüntüleme ve analiz iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kardiyovasküler patogenezde temel bir faktör olan vasküler ekstrasellüler matriksin hemodinamik strese nasıl yanıt verdiğine dair belirsizliği azaltarak hedef güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış basınç basamakları, görüntüleme parametreleri ve Fiji ile Ilastik kullanılarak doğrulanmış analiz hatları aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Vasküler risklerin erken tespitine olanak tanıyarak sermaye verimliliğini artırır ve böylece daha sonraki preklinik veya klinik aşamalardaki kayıpları azaltır.
- Portföy Etkisi: Bileşiklerin, insan direnç arterlerinde basınçla tetiklenen maladaptif yeniden şekillenmeyi hafifletme yeteneklerine göre riskten arındırılmış önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- Basınçlandırma aşamaları sırasında arter canlılığını ve görüntü kalitesini korumak için vasküler doku işleme, iki fotonlu mikroskopi ve basınç miyografisi konularında uzmanlık gereklidir.
- Elastin ve kollajen sinyallerinin eş zamanlı tespiti için ayarlanabilir iki fotonlu lazer, yüksek-NA objektifler (60X, NA ≥1.0), dikroik aynalar ve bant geçiren filtreler dahil olmak üzere özel enstrümantasyona bağlıdır.
- Tutarlı Z-yığını alımı, ilgi bölgesi seçimi ve fiber izleme ile açı ölçümü için Neuron J ve Fiji araçlarının uygulanmasını sağlamak amacıyla biyoloji, görüntüleme ve analiz ekipleri arasında ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- İnsan dışı veya hastalıklı dokulara uyarlama; özellikle elastin otofloresansı için fotobağlamayı önlemek amacıyla eksitasyon gücünün optimizasyonunu ve türler veya patoloji durumları genelinde yapısal metriklerin doğrulanmasını gerektirebilir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, uzun süreli görüntüleme oturumları sırasında canlı arter perfüzyonunu sürdürmenin teknik zorluğu ve mekanik hasarı önlemek için dikkatli basınç basamağı sıralaması ihtiyacı yer alır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
1:02
Imaging of the Artery Using TPEM
2:47
Diameter and Wall Thickness Measurement
3:33
Imaging the Collagen and Elastin Microarchitecture
5:10
Image Analysis Internal Elastic Lamina Branching Angles
5:51
Image Analysis - Collagen Fiber Straightness
7:46
Results: Measurement of the Microstructural Changes in Adventitial Collagen and the Internal Elastic Lamina in Response to Vessel Pressure
8:48
Conclusion
