Canlı, insan direnç arterler tarafından etiket içermeyen Floresans mikroskobu kolajen ve Elastin basınç bağımlı Microarchitectures değerlendirilmesi
April 9th, 2018
Biz aynı anda mekanik test tarif ve insan direnç arterler ve elastin ve kolajen mekansal organizasyon ve birim yoğunlukları miktar için Fiji ve Ilastik görüntü analizleri 3D görüntüleme izole, atardamar duvarı yaşıyor. Atardamar duvarı mekaniğinin matematiksel modellerinde bu veri kullanımını tartışın.
Bu metodolojinin genel amacı, hücre dışı matrisin mikro mimarisi ile arter duvarının mekaniği arasındaki ilişkinin analizi için canlı insan direnç arterlerinin görüntülerini elde etmek için standartlaştırılmış bir prosedür sağlamaktır. Bu yöntem, basıncın genel geometride ve vasküler duvarın mikro mimarisinde nasıl değişikliklere neden olduğu gibi vasküler biyoloji ve mekanikteki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tekniğin ana avantajı, görüntüleme için numunenizi etiketlemeniz gerekmemesidir.
Bu yöntem dirençli arter mekaniği hakkında bilgi sağlayabilse de, protokolün değiştirilmiş bir versiyonu bronşlar gibi diğer tüp benzeri organlara veya insan mesanesinden veya bağırsak duvarından şeritlere uygulanabilir. Başlamak için, ameliyat sırasında eksizyonlarından hemen sonra ilgilenilen doku örneklerini toplayın ve damarları ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Kanüllü bir arteri beş milimetre cıvaya kadar basınçlandırın.
Ardından, iki fotonlu lazeri etkinleştirerek ve uyarma dalga boyunu 820 nanometreye ayarlayarak görüntüleme için optik yolu ayarlayın. Emisyon ışığını fotoğraf çarpanları arasında bölmek ve emisyonu aynı anda iki kanalda toplamak için 460 nanometre uzunluğunda geçişli bir dikroik ayna yerleştirin. Elastin otofloresansını toplamak için 520 nanometrede ortalanmış 30 ila 60 nanometre genişliğinde bant geçiren filtreler ve kollajen ikinci harmonik üretim sinyalini toplamak için 410 nanometrede ortalanmış başka bir bant geçiren filtre kullanın.
Şimdi lazer bekleme süresini ve pikseli 10 mikrosaniyeye ayarlayın. %100 görüş alanı için çözünürlüğü 512 x 512 piksel olarak ayarlayın. Fotoğrafın canlı artere zarar vermesini önlemek için sürekli taramayı etkinleştirin ve mümkün olduğunca düşük uyarma ışık gücü ve piksel bekleme süresi kullanın.
Ardından, maksimum çapa sahip düzlemi bulmak için arteri manuel olarak tarayın. Ardından, arterin en geniş çapını kaplayan dikdörtgen bir dilim seçin ve piksel başına 300 nanometre veya daha küçük piksel boyutuna sahip tek bir kareyi tarayın. Bu görüntüyü daha sonra analiz etmek üzere kaydedin.
Arterin maksimum çapında lümen çapını ve duvar kalınlığını belirlemek için önce görüntüyü Fiji'ye yükleyin. Ana menüye tıklayarak ölçeği ayarlayın ve ardından analize gidin ve ardından ölçeği ayarlayın. Buraya piksel başına mikrometre ve piksel oranını girin.
Ardından, Fiji çizgi aracını seçin ve arteriyel lümenin her iki yanındaki iki iç elastik lamina arasına bir çizgi çizin. Ardından, sonuç tablosundaki uzunluğu raporlamak için Kontrol M'ye tıklayın. Her duvarın kalınlığını ölçmek için daha fazla çizgi çizmeye devam edin ve son ölçümü kaydedin.
Bir veya daha büyük sayısal diyafram açıklığına sahip 60X objektife geçin. Arteriyel duvarın tüm kalınlığını tarayarak kollajen ve elastin mikro mimarisini beş milimetre cıvada görüntüleyin. Ardından, Z yığını başlangıç ve bitiş derinliğini ve Z adım aralığını ve piksel yoğunluğunu tanımlayın.
Z yığınlarınızı tasarlarken, sonraki analizlerinizde herhangi bir eğrilik çıkarımını önlemek için ilgi alanınızın yeterince küçük olduğundan emin olun. Tamamlandığında, her kanalı ayrı ayrı kaydedilecek şekilde ayarlayın. Son olarak, bir ila üç farklı ilgi alanı bulun ve iyi kalitede 3D görüntü yığınları elde edin.
Elastin otofloresanınız ağartılıyorsa, çok yüksek uyarma ışık gücü kullanıyorsunuz demektir. Bundan kaçınılmalıdır. Devam eden deneyinizi bitirmek için, elastin otofloresansını arttırmak için seyreltik bir eozin konsantrasyonu ekleyebilirsiniz.
Bittiğinde, tüm işlemi 100 milimetre cıvaya kadar değişen basınçlarda tekrarlayın ve her basınç adımından sonra miyograf odasındaki tamponu yeni 37 santigrat derece HBS ile değiştirin. Görüntü analizine başlamak için Fiji'de elastin görüntü yığınını açın. Ardından görüntüye gidin, yığınlara tıklayın ve çalışılacak görüntüleri seçmek için Z projesini seçin ve projeksiyon türü için maksimum yoğunluğu seçin.
Maksimum yoğunluk projeksiyonunu bir TIFF görüntüsü olarak kaydedin. Ardından mümkün olduğu kadar çok iç elastik lamina fiber dallanma noktası seçin ve bunları açı aracını kullanarak ölçün. Her görüntü üzerinde sistematik olarak çalışın ve işiniz bittiğinde Fiji sonuç sayfasını kaydedin.
Adventitial kollajenin dalgalılığını ölçmek için Fiji'deki kollajen görüntü yığınını açın. Ardından, görüntü yığınlarına kadar aşağı gidin ve çalışılacak görüntüleri seçmek ve maksimum yoğunluk projeksiyonunu ayarlamak için Z projesini seçin. Şimdi görüntüyü, türü ve ardından sekiz biti tıklatarak görüntü türünü sekiz bitlik bir TIFF görüntüsüne değiştirin.
Maksimum yoğunluk projeksiyonunu bir TIFF görüntüsü olarak kaydedin. Fiji'ye tıklayarak ve eklentiler altında Neuron J'yi seçerek Neuron J eklentisini açın. Ardından sekiz bitlik TIFF dosyasını Neuron J'de açın. Açıldıktan sonra, izleme ekle'ye tıklayın ve her bir fiberin başına ve sonuna tıklayarak analiz etmek için fiberleri seçin.
Ardından, izlemeleri ölçmeye gidin ve iletişim kutusunda ekran izleme ve köşe ölçümlerini seçin. Kolaj lifi düzlüğünü hesaplamak için önce Fiji izlemeleri penceresindeki değerleri Excel'e kopyalayın. İzleme penceresindeki uzunluk değerleri, analiz edilen kollajen liflerinin tam uzunluklarının ölçüleridir Lf.İkincisi, Fiji köşeleri penceresinin ilk ve son XY koordinatlarını analiz edilen her kollajen lif demeti için kopya Excel'e analiz edilir.
Ardından, Pisagor Teoremini kullanarak analiz edilen kollajen lifi L0'ın her iki ucunu birleştiren düz çizginin uzunluğunu hesaplayın. Kollajen lifi düzlüğü son olarak L0/Lf olarak hesaplanır. Az önce gösterilen protokolü takiben, arterin en geniş kısmı tespit edildi ve bu noktada arter, maksimum damar çapını ve damar duvar kalınlığını ölçmek için etiketsiz floresan mikroskobu kullanılarak tarandı.
Yüksek sayısal açıklık objektifine daha yüksek bir büyütme kullanarak, sadece damar çapı ve duvar kalınlığı değil, aynı zamanda kollajen ve elastinin mikro mimarileri de ölçülebilir. Elastin lifi dallanma açılarının ve kollajen düzlüğünün mikro mimarileri, uygun görüntü analiz yazılımı kullanılarak ardışık görüntü bölümlerinde belirlenebilir. Bu, kollajen ve elastin'in mikro mimarilerindeki basınca bağlı değişiklikler ile farklı basınçlarda artımlı elastik modül arasındaki ilişkinin doğrudan analizine izin verir.
Bu prosedürü takiben, görüntülerden başka bilgiler de çıkarılabilir. Bu, damar longitudinal ekseni boyunca adventisyel kollajenin oryantasyon melekleri olabilir veya tunika ortamındaki ekstraselüler matriksin mikro mimarisi olabilir. Bu yöntem kullanılarak görüntülerden çıkarılan nicel ölçümler, sağlıklı ve ölmüş insan dolaşımının farklı koşullara nasıl tepki verdiğini aydınlatmak için matematiksel modellere beslenebilir.
Bu videoyu izledikten sonra, basıncın dirençli arter duvarının mikro mimarisinde değişikliklere neden olduğu hakkında bilgi elde etmek için görüntüleme deneylerinizi ve müteakip görüntü analizinizi nasıl tasarlayacağınız konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. İki foton uyarmalı floresan mikroskobu ile çalışırken görünür ve görünmez ışığa maruz kalmaktan kaçınmanız gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, canlı insan dirençli arterlerini görselleştirmek için standart bir metodoloji sunmakta ve hücre dışı matrisin mikro yapısı ile arter duvarı mekaniği arasındaki ilişkiyi analiz etmektedir. Bu teknik, numune etiketleme gerektirmeden, basıncın vasküler duvarın geometrisini ve mikro yapısını nasıl etkilediğini değerlendirmeye olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Vasküler Biyoloji
- Biyomekanik
- Hücre Dışı Matris Analizi
Arka Plan
- Arter duvarı mekaniğini anlamak, vasküler sağlık için kritik öneme sahiptir.
- Hücre dışı matris, vasküler yapı ve fonksiyonda önemli bir rol oynar.
- Canlı görüntüleme teknikleri, dinamik biyolojik süreçler hakkında bilgi sağlayabilir.
- Vasküler geometrideki basınçla indüklenen değişiklikler, kardiyovasküler hastalıkları anlamak için önemlidir.
Çalışmanın Amacı
- Numune etiketlemeden dirençli arterlerin görüntülenmesi için bir yöntem geliştirmek.
- Arter duvarının mikro yapısı ve mekaniği arasındaki ilişkiyi araştırmak.
- Diğer tüp benzeri organlar için uygulanabilir bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Cerrahi eksizyondan hemen sonra doku örneklerinin toplanması.
- Detaylı protokol uygun olarak damarların hazırlanması.
- Kanüle edilmiş arterlerin beş milimetre cıva ile basınçlandırılması.
- Elastin ve kollajen görüntü analizi için Fiji ve Ilastik'in kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Canlı insan dirençli arterlerinin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi sağlandı.
- Elastin ve kollajenin uzamsal organizasyonunun kantitatif analizi yapıldı.
- Elde edilen veriler, arter mekaniği matematiksel modellerinde entegre edilebilir.
- Bu yöntem, diğer organ sistemlerinde uygulama potansiyelini göstermektedir.
Sonuçlar
- Geliştirilen metodoloji, vasküler mekaniğin anlaşılmasını artırmaktadır.
- Arter duvarı özelliklerini incelemek için non-invaziv bir yaklaşım sağlamaktadır.
- Bu teknik, çeşitli biyolojik dokular için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding pressure-induced microarchitectural changes in resistance arteries supports target validation in cardiovascular drug discovery by linking extracellular matrix remodeling to hemodynamic stress. This label-free imaging approach enables mechanistic de-risking of vascular targets through quantitative assessment of collagen and elastin reorganization under physiologically relevant pressures. The method provides predictive confidence for preclinical models by delivering reproducible, label-independent structural data that can inform mathematical models of arterial mechanics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying pressure-dependent changes in elastin fiber branching angles and collagen straightness as direct readouts of vascular wall remodeling.
- Operational Value: Provides label-free, live-tissue imaging that avoids exogenous markers, preserving native microarchitecture for accurate mechanistic assessment.
- Predictive Value: Supports preclinical model validation by generating quantitative microarchitectural parameters (e.g., collagen straightness, elastin alignment) that correlate with mechanical stiffness and disease progression.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible 3D image stacks of elastin and collagen microarchitecture that can be used to establish baseline vascular phenotypes for compound screening campaigns.
- Quantitative Output: Delivers measurable endpoints such as internal elastic lamina branching angles and collagen fiber straightness (L0/Lf) suitable for high-content analysis and dose-response modeling.
- Platform Reuse: The protocol’s adaptability to other tube-like organs (e.g., bronchi, intestinal wall) supports cross-tissue target validation and assay portability across discovery programs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly addresses pathogenic mechanisms in hypertension, diabetes, and metabolic syndrome where resistance artery remodeling is a known contributor.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by providing human-derived microarchitectural data that can be integrated into computational models to predict in vivo responses to pharmacological interventions.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on whether test compounds normalize pressure-induced microarchitectratic changes, reducing late-stage failure due to unanticipated vascular toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, offering a human-relevant platform to evaluate how candidate compounds affect vascular extracellular matrix dynamics under physiological pressure conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct observation of how pressure alters elastin and collagen microarchitecture, clarifying mechanisms of vascular stiffening and remodeling.
- Screening: Generates standardized, quantitative image-based readouts (e.g., fiber straightness, branching angles) that are amenable to automation and multi-parametric analysis in screening cascades.
- Analytics: Outputs structural metrics that feed into mathematical models of arterial wall mechanics, allowing teams to correlate microarchitectural changes with functional outcomes like incremental elastic modulus.
- Translational Research: Uses live human resistance arteries to ensure disease relevance and improve predictive power when extrapolating findings to clinical vascular responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis workflow applicable across cardiovascular, metabolic, and fibrotic disease programs studying vascular remodeling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing ambiguity in how vascular extracellular matrix responds to hemodynamic stress, a key factor in cardiovascular pathogenesis.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized pressure steps, imaging parameters, and validated analysis pipelines using Fiji and Ilastik.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular liabilities, thereby reducing attrition in later preclinical or clinical stages.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to mitigate pressure-induced maladaptive remodeling in human resistance arteries.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vascular tissue handling, two-photon microscopy, and pressure myography to maintain artery viability and image quality during pressurization steps.
- Dependent on specialized instrumentation including tunable two-photon laser, high-NA objectives (60X, NA ≥1.0), dichroic mirrors, and bandpass filters for simultaneous elastin and collagen signal detection.
- Necessitates cross-team standardization between biology, imaging, and analysis teams to ensure consistent Z-stack acquisition, region-of-interest selection, and application of Neuron J and Fiji tools for fiber tracing and angle measurement.
- Adaptation to non-human or diseased tissues may require optimization of excitation power to prevent photobleaching, particularly for elastin autofluorescence, and validation of structural metrics across species or pathology states.
- Practical limitations include the technical challenge of maintaining live artery perfusion during extended imaging sessions and the need for careful pressure-step sequencing to avoid mechanical damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:02
Imaging of the Artery Using TPEM
2:47
Diameter and Wall Thickness Measurement
3:33
Imaging the Collagen and Elastin Microarchitecture
5:10
Image Analysis Internal Elastic Lamina Branching Angles
5:51
Image Analysis - Collagen Fiber Straightness
7:46
Results: Measurement of the Microstructural Changes in Adventitial Collagen and the Internal Elastic Lamina in Response to Vessel Pressure
8:48
Conclusion
