Name: Canlı, insan direnç arterler tarafından etiket içermeyen Floresans mikroskobu kolajen ve Elastin basınç bağımlı Microarchitectures değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Öğrenin, canlı insan direnç arterlerinde etiketsiz floresan mikroskobu ile kollajen ve elastin mikromimarisini basınç bağımlı olarak değerlendirmeyi. Bu yöntem, damar duvarı mekaniği ve ekstraselüler matris ilişkisini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Danimarka moleküler Biyomedikal görüntüleme Merkezi, Doğa Bilimleri Fakültesi, Güney Danimarka Üniversitesi laboratuvarları ve mikroskoplar kullanımı için teşekkür ederiz. Kristoffer Rosenstand ve Ulla Melchior basınç ile mükemmel teknik destek için myography ve görüntüleme kabul vardır.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu eser bir standart, kombine görüntüleme ve basınç myography bir yaklaşım için eşzamanlı direnç arterler ve basınç ile ilgili değişiklikler arter yapısı mekanik özelliklerinin değerlendirilmesi için önemli bir yer bizim öneri temsil eder. bir baskı Aralık 0 için 100 mmHg duvardan. Sunulan yaklaşım özel yapılı ekipman kullanılarak geliştirilen, görüntüleme Arteryel duvardaki her iki aletleri tasarımı sağlar ancak, İki fotonlu uyarma floresan mikroskop üzerinde uygun herhangi bir basınç myograph, kullanılabilir. Şekil, ge...

Patojenik katkı ve direnç arter remodeling etkilerini temel hipertansiyon, şeker hastalığı ve metabolik sendrom1,2,3,4,5belgelenmiştir. Mikrovasküler duvar mekanik ve mikro mimari özellikleri arasındaki ilişki deşifre bu ilişkinin matematiksel modeller geliştirmek için önemlidir. Modelleri gibi remodeling işlemini anlama artıracak ve geliştirilmesi için test farmakolojik stratejileri atardamar duvarı yeniden hedefleme hastalığı ile ilgili yararlı silis modellerinde destekleyecektir.
Önceki çalışmalar nasıl mikro mimarisi Arteryel duvardaki Arteryel duvar mekaniği için mekanik önlemler içeren ile ilgilidir ve hücre dışı Matriks (ECM) mikro mimarisi neredeyse sadece büyük üzerinde gerçekleştirilir anlamakta odaklı , elastik conduit arterler fareler veya domuz6,7,8,9,10,11. Duvardaki microstructures görüntüleme genellikle tarafından kollajen, elastin ve ikinci harmonik üretimi autofluorescence yararlanarak doğrusal olmayan optik teknikleri kullanılarak gerçekleştirilir. Bu iki önemli bileşeni hücre dışı Matriks, elastin ve kolajen, boyama için ihtiyaç olmadan kronolojik zamanmekansal görüntüleme sağlar. Arteryel duvardaki tam kalınlıkta görüntüleme dağılım kalın tunica medya ışık nedeniyle büyük boru arterler bir mücadeledir. Ancak, nasıl mikro mimarisi Arteryel duvardaki yapısal bileşenlerinin ilgili gözlenen mekanik özellikleri belirlemek için üç boyutlu bilgi mekanik test sırasında alınması gerekir. İnsan aort gibi büyük arterler için bu biaxial montaj, mekanik test ve 1-2 cm2 adet atardamar duvarı7,9,10, ilgi bölgelerin Imaging gerektirir 12. yansıma ve mekanik test sadece duvar parçası.
Daha küçük arterlerin eden her türü için (örneğin, insan Perikardiyal13, pulmoner14 ve subkutan15 arterler, sıçan Mezenterik arterler16,17,18, 19 , 20, fare cremaster, Mezenterik, beyin, femur ve Karotid arter21,22,23,24,25,26, tüm duvar kalınlığı 27) görüntüleme mümkündür ve mekanik test ile birleştirilebilir. Bu mekanik özellikleri ve duvar içinde yapısal düzenlemeler aynı anda kayıt sağlar. Ancak, doğrudan bir matematiksel modelleme ECM üç boyutlu yapısını gözlenen değişiklikler ve direnç Arteryel duvardaki, değiştirilen mekanik özelliklerinin arasındaki ilişkinin sadece bizim bilgi en iyi şekilde bildirilmiştir üzerine Son zamanlarda insan direnç arterler13,15' te.
Bu çalışmada, pasif mekanik test ve mikro mimarisi izole insan direnç arter arter duvarındaki kollajen ve elastin aynı anda üç boyutlu görüntüleme için bir ex vivo yöntemi açıklanmıştır. Görüntüleme Protokolü ilgi herhangi bir tür direniş arterler için uygulanabilir. Görüntü analizleri iç elastik lamina dallanma açıları ve adventitial kollajen doğruluk13 Fiji28kullanarak elde etmek için açıklanmıştır. Kollajen ve elastin birim yoğunlukları Ilastik yazılım29 kullanarak belirlenir ve son olarak, atardamar duvarı mekaniğinin matematiksel modeller mekanik ve görüntüleme verilerde dahil tartışılmaktadır.
Görüntüleme ve görüntü analizi teknikleri matematiksel modelleme ile birlikte olan müfettişler anlamak ve açıklamak için sistematik bir yaklaşım sağlamak için açıklayan amacı direnç arterler ECM indüklenen basınç değişiklikleri görülmektedir. Açıklanan yöntemi bir gemi ECM değişimler basınçlandırma sırasında 20, 40 ve 100 mmHg, ECM yapısını karşılaştırarak miktarının içinde odaklanmıştır. Bu baskılar sırasıyla daha uyumlu (20 mmHg), sert (100 mmHg) ve ara (40 mmHg) durumu, Arteryel duvar yapısını belirlemek için seçilmiştir. Ancak, herhangi bir işlem indüklenen vazoaktif bileşenleri, histeresis ve akış, değişiklikler de dahil olmak üzere canlı damar damar duvarında, araştırmacı tarafından söz konusu araştırma hipotezi bağlı olarak sayısal.
İki fotonlu uyarma Floresans mikroskobu (TPEM) canlı arter basıncı myograph basınç (veya diğer) indüklenen eğitim değişikliklere ECM ile birlikte kullanımı olduğunu vurguladı. Bu yüksek kaliteli üç boyutlu etiket içermeyen edinimi ile birlikte Arteryel duvardaki (çap ve duvar kalınlığı) genel olarak üç boyutlu yapısının aynı anda satın alma izin verdiğinden, ilk olarak, kolajen ve elastin görüntülerini ayrıntılı microarchitectures autofluorescence elastin ve kolajen ikinci harmonik üretimi sinyal (SHG)30yararlanan tarafından açıklanan13 olarak. İkinci olarak, TPEM düşük enerjili yakın kızılötesi uyarma ışık, doku ve böylece, vasküler duvar içinde tam olarak aynı konumda tekrarlanan görüntüleme duyarlilik en aza indirerek, izin tekrarlanan ölçüler analizlerini gözlenen izin verilir sağlar değiştirir.
TPEM erişimi olmayan kullanıcılar açıklanan yöntemi de kullanmak bir fırsat sağlamak için alternatif bir yaklaşım arter sabit basınç confocal Imaging'i kullanma kullanımı açıklanmıştır. Bilgi ECM yapısı ve birim yoğunluğunu da dokuların seri,31,32tarafından açıklanan olarak örneğin kesitli iki boyutlu analizler alınabilir. Ancak, arter yanı sıra bu yöntemi kullanarak koşulları değiştirme sırasında uzunluğu ölçekler üzerinde üç boyutlu yapısal bilgi almak imkanı olmaması nedeniyle öyle bir baskı araştırmalar için bu yaklaşım kullanmanızı öneririz değil ve tedavi ECM üç boyutlu değişiklikler indüklenen.
Burada açıklanan yöntemi uygulamak için dedektif için en düşük gereksinimi cannulation ve basınçlandırma arter confocal veya İki fotonlu uyarma floresan mikroskop ile birlikte bir kurulum için erişimdir. Aşağıdaki iletişim kuralında tanımlanan bir ölçüye göre baskı myograph özel yapılı ters İki fotonlu uyarma floresan mikroskop üzerinde sığdırmak için inşa bir boyuna güç çevirici ile kurulumudur.

<table><tbody><tr><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15401-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>Diseksiyon amaçlı</td><td></td> <td>761028</td></tr><tr><td>Vitrex Medical A/S, Herlev, Danimarka</td><td>1.63, 2.13, 210mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smiths Medical Intl, İngiltere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Ethilon</td><td>11-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Özel yapım</td><td></td><td>DK patent numarası 201200167, Güney Danimarka Üniversitesi, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt</td><td></td></tr><tr><td>Mettler toledo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>B3259</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>A7030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>C5670</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ve nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>G7021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>E3889</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merck Millipore, Hellerup, Danimarka</td><td>1.00496.9010</td><td>Fosfat tamponlu (pH 6.9) %4 formaldehit çözeltisi&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>H3784</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ve nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>P9666</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>P5655</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>M2643</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>S2002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>S5886</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>S5761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>1.06462</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco, ThermoFisher Bilimsel</td><td>10010015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>PHR1423</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Br&oslash; ndby, Danimarka.</td><td>Z370525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tocris Bioscience, Bristol, Birleşik Krallık</td><td>538944</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>Özel yapım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra Fizik, Dağ Manzarası, CA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Fluor 20XMI (çoklu daldırma) NA 0.75</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu, Ballerup, Danimarka</td><td>H7422P-40</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; bingen, Almanya).</td><td>ChromaET 460 nm uzun geçişli dikroik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; bingen, Almanya).</td><td>Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filtre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; bingen, Almanya).</td><td>Renk ET402/15X&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scotch TM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>lamel kalınlığı, mikroskopta (# 1 veya # 1.5) kullanılan objektifle eşleşmelidir, alternatif olarak, ayar bileziğini lamel</td><td></td><td></td> ile eşleşecek şekilde ayarlayın</tr></tbody></table>

canlı, insan direnç arterler tarafından etiket içermeyen floresans mikroskobu kolajen ve elastin basınç bağımlı microarchitectures değerlendirilmesi

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Direnç arter yeniden patojenik katkı temel hipertansiyon, şeker hastalığı ve metabolik sendrom belgelenmiştir. Araştırma ve Geliştirme Sağlık ve hastalık insan direnç arterlerde mekanik özelliklerini anlamak için microstructurally motive matematiksel modellerin anlama yardım potansiyeli var nasıl hastalık ve tıbbi tedaviler insan mikro etkiler. Bu matematiksel modeller geliştirmek için mikrovasküler duvar mekanik ve mikro mimari özellikleri arasındaki ilişkiyi çözmeye esastır. Bu çalışmada, pasif mekanik test ve mikro mimarisi izole insan direnç arter arter duvarındaki kollajen ve elastin eşzamanlı etiket içermeyen üç boyutlu görüntüleme için bir ex vivo yöntemi açıklanmaktadır. Görüntüleme Protokolü ilgi herhangi bir tür direniş arterler için uygulanabilir. Görüntü analizleri i) basınç kaynaklı değişimler iç elastik lamina dallanma açıları ve Fiji ve Ilastik yazılım kullanarak kararlı II) kolajen ve elastin birim yoğunlukları kullanarak adventitial kollajen doğruluk miktarının için açıklanmıştır. Tercihen canlı, derin arterler üzerinde tüm mekanik ve görüntüleme ölçümler gerçekleştirilir, ancak, alternatif bir yaklaşım standart video mikroskobu basınç birlikte myography ile yeniden basınçlı kapların sonrası fiksasyon Imaging'i kullanma tartışıldı. Bu alternatif yöntem kullanıcılara çözümleme yaklaşımlar için farklı seçenekler sağlar. Atardamar duvarı mekaniğinin matematiksel modeller mekanik ve görüntüleme verilerde dahil anlatılan ve gelecekteki gelişimi ve protokol eklemeler önerildi.

Bu çalışmada kullanılan görüntüleme için özel olarak oluşturulmuş basınç myograph şekil 1' de gösterilen. Myograph tasarım için özel dikkat i) odası küçük hacimli (2 mL) ve II) olasılığı için Kapat ve cam alt (şekil 1B) ile paralel Kanüller konumlandırma için ödenmiştir. Alt odasının bir 50 × 24 mm #1.5 cam coverslip (değiştirilebilir) uyuyor. Basınç denetleyicisi standart 1 L cam şişe ve bir tansiyon aleti (kaldırıldı kol) inşa ...

Biz aynı anda mekanik test tarif ve insan direnç arterler ve elastin ve kolajen mekansal organizasyon ve birim yoğunlukları miktar için Fiji ve Ilastik görüntü analizleri 3D görüntüleme izole, atardamar duvarı yaşıyor. Atardamar duvarı mekaniğinin matematiksel modellerinde bu veri kullanımını tartışın.

Canlı, insan direnç arterler tarafından etiket içermeyen Floresans mikroskobu kolajen ve Elastin basınç bağımlı Microarchitectures değerlendirilmesi

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Bu metodolojinin genel amacı, hücre dışı matrisin mikro mimarisi ile arter duvarının mekaniği arasındaki ilişkinin analizi için canlı insan direnç arterlerinin görüntülerini elde etmek için standartlaştırılmış bir prosedür sağlamaktır. Bu yöntem, basıncın genel geometride ve vasküler duvarın mikro mimarisinde nasıl değişikliklere neden olduğu gibi vasküler biyoloji ve mekanikteki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tekniğin ana avantajı, görüntüleme için numunenizi etiketlemeniz gerekmemesidir.Bu yöntem dirençli arter mekaniği hakkında bilgi sağlayabilse de, protokolün değiştirilmiş bir versiyonu bronşlar gibi diğer tüp benzeri organlara veya insan mesanesinden veya bağırsak duvarından şeritlere uygulanabilir. Başlamak için, ameliyat sırasında eksizyonlarından hemen sonra ilgilenilen doku örneklerini toplayın ve damarları ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Kanüllü bir arteri beş milimetre cıvaya kadar basınçlandırın.Ardından, iki fotonlu lazeri etkinleştirerek ve uyarma dalga boyunu 820 nanometreye ayarlayarak görüntüleme için optik yolu ayarlayın. Emisyon ışığını fotoğraf çarpanları arasında bölmek ve emisyonu aynı anda iki kanalda toplamak için 4

assessing-collagen-elastin-pressure-dependent-microarchitectures-live

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Raman spektroskopisi temassız için uygun bir tekniktir, canlı hücreler, doku mühendisliği yapıları ve doğal dokuların etiket ücretsiz analizidir. Kaynak özgü spektral parmak izi oluşturulur ve çok değişkenli analiz kullanılarak analiz edilebilir.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Bu makalede, floresan daha düzeltme ve 3D-hücre kültürleri canlı görüntüleme için kullanılabilir kollajen etiketlemek için bir yöntem sunar. Ayrıca 3D ortamlarda kültür hücrelerinin endojen iskelet proteinleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir protokol sağlar.

3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

48 saatlik bir süre boyunca çevre kontrollü bir biyoreaktörde fibroblast aracılı jel sıkıştırma ve fibrin fiber yeniden hizalamayı gözlemlemek ve analiz etmek için zaman atlamalı mikroskopi ve görüntü işleme teknikleri kullanılmıştır.

Fibroblast aracılı Fibrin Jel Sıkıştırmayı Gözlemleme ve Ölçme

Dupuytren hastalığı (GG) avucunun bir fibroproliferatif hastalıktır. Burada, biz üç-boyutlu (3D) kültür sistemi DD kültür rezeksiyon örneklerinde bir protokol mevcut. Bu tür kısa vadeli kültür sistemi 3D yapı korunması ve fibrotik doku moleküler özelliklerini tanır.

İnsan Dupuytren en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Miyofibroblastların Çalışması ve Ekstrasellüler Matriks Etkileşimleri Kültür

Vasküler hücre fonksiyonu, hücre içi habercilerin aktivitesine bağlıdır.  Burada tarif edilen, izole bir aortun bireysel endotel ve düz kas hücrelerinde fizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum ve nitrik oksit seviyelerinin ölçülmesine izin veren bir ex vivo iki foton görüntüleme yöntemidir.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Burada, septal arter kanüle edildiği ve basınçlandırıldığı için kılcal yataklar ve perisitler de dahil olmak üzere damar ağacı bileşenlerinin yanı sıra basıncı koruyan arteriyel perfüzyon basıncının ve akışının eks vivo izlenmesi ile canlı murine kalp dokusundaki koroner mikrositülasyonu incelemek için bir protokol sunulmaktadır.

Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Heterojen yapısal ve mekanik aterosklerotik plak özelliklerini incelemek için bir mekano-görüntüleme boru hattı geliştirdik. Bu boru hattı, lokal baskın açının korelasyonunu ve kollajen lifi oryantasyonunun dağılımını, kopma davranışını ve fibröz plak dokusunun gerinim parmak izlerini sağlar.

Aterosklerotik Plak Fibröz Dokusunun Lokal Kollajen Yapısı ve Mekanik Özellikleri Arasındaki Korelasyonu İncelemek İçin Bir Yöntem

Burada, moleküler veya histopatolojik analiz için kesit almadan önce doku stabilize edici jeli damar lümenine infüze ederek insan arteriyel mimarisini korumak için bir protokol sunuyoruz.

In Vitro İntraluminal Jel İnfüzyonu: İnsan Dirençli Arterlerin Mikroskobik Analizi İçin İleri Bir Yaklaşım

Bu çalışmanın amacı arteryel duvarın yerli üç katmanlı mimarisi taklit edildi. Bunu başarmak için, elektrospinning 3-1 (girdi-çıktı) meme kullanımı ile istihdam edilen ve polycaprolactone, elastin ve kolajen karışımları oldu.

Yerli Arter Mimarlık polycaprolactone, Elastin ve Kollajen kullanarak Mimik Üç katmanlı elektrospinning: Bir Ön Çalışma

Öğrenin, canlı insan direnç arterlerinde etiketsiz floresan mikroskobu ile kollajen ve elastin mikromimarisini basınç bağımlı olarak değerlendirmeyi. Bu yöntem, damar duvarı mekaniği ve ekstraselüler matris ilişkisini incelemek için kullanılır.

Canlı, insan direnç arterler tarafından etiket içermeyen Floresans mikroskobu kolajen ve Elastin basınç bağımlı Microarchitectures değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Canlı, insan direnç arterler tarafından etiket içermeyen Floresans mikroskobu kolajen ve Elastin basınç bağımlı Microarchitectures değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet