Görüntü güdümlü rezeksiyon Glioblastoma ve kafa içi tedavi kök hücre numaralı seribaşı iskele implantasyonu

Bu prosedürün genel amacı, farelerde beyin kanserini cerrahi olarak rezeke etmek ve postoperatif rezeksiyon boşluğuna tümör güdümlü terapötik kök hücrelerle tohumlanmış bir iskele implante etmektir. Bu yöntem, cerrahi rezeksiyonun cerrahi boşluğa hücre implantasyonunu nasıl etkilediği, yeni terapötik ajanların cerrahi sonrası beyin kanseri üzerinde ne kadar etkili olduğu ve iskele tabanlı uygulama sistemlerinin terapötik sonuçları nasıl etkilediği gibi hücre tedavisi ve nöro-onkoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, beyin kanseri müdahalelerinin, insan hastalarda klinik bakım standardını yakından taklit edecek şekilde farelerde incelenebilmesidir.

Bu yöntem, iskele üzerinde verilen kök hücre tedavisi hakkında bilgi sağlayabilse de, nanopartiküller, küçük moleküller, onkolitik virüsler veya diğer ortaya çıkan tedaviler gibi diğer müdahalelere de uygulanabilir. Farelerde implantasyondan 48 saat önce, önce PLA iskelelerini yaklaşık iki x iki milimetrelik rezeksiyon boşluğu büyüklüğünde parçalar halinde keserek iskeleleri hazırlayın. İskeleleri 15 dakika boyunca %70 etanole batırarak sterilize edin.

15 dakika sonra iskeleleri PBS'ye daldırın. Ardından, hücreleri tohumlama için hazırlarken Dulbecco'nun %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin içeren modifiye edilmiş Eagle ortamına iskeleler yerleştirin. Hücreleri hazırlamak için önce %0.05 tripsin kullanarak kültürlenmiş MSC'leri kaldırın.

37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından hücrelerin kalktığından emin olun. Daha sonra tripsini etkisiz hale getirmek için şişeye DMEM ekleyin.

Ardından, şişe içeriğini 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, beş dakika boyunca 100 kez g'de santrifüjleme yoluyla her iskele için beş kez 10 ila beşinci MSC'leri peletleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı aspire edin ve MSC'leri beş kere 10 ila beşinci hücrelerde beş mikrolitre DMEM'de yeniden süspanse edin. Daha sonra forseps ile DMEM daldırmadan bir iskele çıkarın ve altı kuyulu plakanın kapağına yerleştirin. İskeleyi kapaktan kaldırın ve geride bir damla fazla DMEM bırakın.

İskeleyi yeni ve kuru bir yerde tekrar kapağın üzerine yerleştirin. Üç ila beş kez tekrarlayın. Daha sonra kısmen kurutulmuş iskeleyi tohumlama için altı oyuklu yeni bir plakaya yerleştirin.

Kısmen kurutulmuş bir iskele, optimum hücre tohumlama sonuçları sağlar. İskele çok ıslaksa, hücreler iskeleden kayacak ve aşağıdaki plakaya yapışacaktır. İskele çok kuruysa, damlacık tüm iskeleye yayılmaz ve bu da zayıf ilk hücre dağılımına neden olur.

Bir pipet kullanarak, süspansiyonu homojenize etmek için MSC tüpünü hafifçe karıştırın, çünkü bazı hücreler dibe çökmüş olabilir. 2,5 mikrolitre taze karıştırılmış MSC süspansiyonunu doğrudan iskelenin üzerine yavaşça pipetleyin ve iskelenin üstünde küçük bir damlacık oluşturun. Hücre damlacığının hızlı buharlaşmasını önlemek için her kuyucuğun kenarlarına 300 mikrolitre DMEM ekleyin.

37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin ve hücrelerin iskeleye yapışmasına izin verin. Kuluçkayı takiben, iskeleleri kuyu plakasında nazikçe ters çevirmek için forseps kullanın. 2.5 mikrolitre taze karıştırılmış MSC süspansiyonunu tohumlayın, böylece iskele başına ekilen beşinci hücrelere toplam beş kez 10 verin.

Hücrelerin iskeleye yapışmasına izin vermek için 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna iki mililitre ekleyerek iskeleleri DMEM'de örtün. Ortamın altlarından akmasına izin vermek için iskeleleri yavaşça kaldırın. İmplantasyon ameliyatından önce 48 saat boyunca bu durumda 37 santigrat derecede inkübe edin.

Stereotaksik çerçeveyi bir floresan diseksiyon stereomikroskobunun sahnesine yerleştirerek başlayın. Daha sonra anestezi uygulanmış fareyi, bir izofluran burun konisi adaptörü aracılığıyla sürekli inhale anestezi beslemesi ile stereotaksik çerçeveye sabitleyin. Bir ısıtma yastığı ile vücut ısısını koruyun.

Korneanın kurumasını önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün. Daha sonra kafa derisinin kesi bölgesini bir dizi üç alkol ve üç Betadine mendil ile sterilize edin. Her uzuvda ayak parmağı kıstırma refleks testini yapın ve uygun anesteziyi sağlamak için negatif yanıtı onaylayın.

Forseps kullanarak kafa derisini sıkıştırın ve nazikçe kaldırın. Cerrahi makasla orta hat lineer rostral-kaudal insizyon yaptıktan sonra, insizyon bölgesini PBS ile yıkayın ve dairesel fırçalama hareketiyle pamuk uçlu aplikatör ile deri altı yağını alın. Cildi, önceden kurulmuş olan kraniyal pencere tamamen görünür olacak şekilde düzenleyin.

Dura'yı kafatası penceresinin sınırlarının hemen iç kısmında nazikçe delmek için 18 gauge bir iğne kullanın. Kesi pencerenin içini tamamen izleyene kadar tekrarlayın. Durayı, altta yatan parankimi ve tümörü ortaya çıkaran ince forseps kullanarak soyarak çıkarın.

Ardından, oda ışıklarını kısın ve stereomikroskop floresan modunu açın. U87 mCherry ve ateşböceği lusiferaz eksprese eden tümörü bulun. Bir vakum pompasının hortumunun ucuna 200 mikrolitrelik bir pipet ucu yükleyin.

Ardından vakum pompasını açın. Hiçbir sinyal kalmayana kadar floresan dokuyu nazikçe aspire ederek tümörü rezeke edin. Kanamayı kontrol etmek için soğuk PBS ile sulama yapın ve pamuk uçlu bir aplikatör ile sabit basınç uygulayın.

İskeleyi implante etmeden önce kanamayı durdurmak için tuzlu su, pamuk uçlu aplikatör ile sabit basınç ve/veya SURGICEL gibi hemostatik bir ajan kombinasyonu kullanın. Uygun şekilde kontrol edilmezse, potansiyel olarak tehlikeli bir hematom oluşabilir. Rezeksiyondan sonra vakum pompasını kapatın ve pipet ucunu atın.

Floresansı kapatın ve oda tekrar yanar. İmplantasyondan hemen önce, istenmeyen ortamları ve ilgili bileşenleri çıkarmak için MSC tohumlu bir PLA iskelesini PBS'ye yavaşça daldırın. İskeleyi rezeksiyon boşluğuna implante edin.

Gerekirse, iskeleyi yerine sabitlemek için bir mikrolitre fibrinojen ve ardından bir mikrolitre trombin ekleyin. Dura çıkarılmış ve kraniyal pencereden kemik flebi atılmış durumdayken, cildi kapatarak ve cerrahi yapıştırıcı uygulayarak yarayı kapatın. Hayvanı solunan anestezikten çıkarın ve ısıtılmış bir yüzeyde iyileşmesine izin verin.

Bu faz kontrastı, floresan ve birleşik görüntüler, mCherry ve ateşböceği lusiferaz belirteçlerini ifade etmek için lentiviral yapılarla tasarlanmış U87 kanser hücrelerini göstermektedir. Bu faz kontrastı, floresan ve birleşik görüntüler, PLA iskele malzemesine ekilen tanısal GFP-Renilla lusiferaz veya terapötik GFP-TRAIL'i eksprese etmek için tasarlanmış kök hücrelerin karşılık gelen görüntülerini gösterir. Bu parlak alan ve floresan kaplama görüntüsü, tümörün yerini gösterir.

Burada, kalıntı tümör odakları ile cerrahi sonrası rezeksiyon boşluğu görülür. Bu görüntü, MSC-TRAIL ile tohumlanmış implante edilmiş PLA iskelesini göstermektedir. Burada, postmortem beyin dokusu, iskele üstü örtülmüş olarak görülür.

Bu floresan kaplama, GFP-TRAIL hücrelerini vurgular. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, her fare için 30 dakikadan daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kliniklerde görülenlere benzer şekilde, fareden fareye elde edilen rezeksiyon derecesinde içsel değişkenlik olacağını hatırlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir beyin tümörünün cerrahi rezeksiyonunun nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalı ve bunun iskele bazlı kök hücre tedavisini içeren terapötik müdahaleler üzerindeki etkisini değerlendirmelisiniz.