Name: Derleme ve prototip köpüklü virüs Intasomes arıtma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Öğrenin prototip köpüklü virüs intasomlarının derlenmesi ve arıtılması yöntemini. Bu teknik, retroviral integrasyon mekaniğini ve dinamiklerini incelemek için biyokimyasal ve yapısal çalışmalarda kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NIH AI099854 ve AI126742 için anahtar tarafından desteklenmiştir.

1. tavlama, vDNA
<ol><li>Birleştirme 1 X on tampon (10 X 10 hisse senedi: 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 µM Oligo 1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM hisse senedi) ve 10 µM Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM hisse senedi) son hacmi 1.5 mL ' . Aliquot 25 µL altmış 0,2 mL Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpler içine. Not: fluorophores veya Etiketler sonunda 5'-Oligo 2 veya bir iç amino-T 5'-sonundan itibaren Oligo 1 temel 13 olarak reaksiyonlar uygulamaya bağlı olarak değiştirilebilir. Değiştirilmiş reaksiyonlar tarafından yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) tavlama önce saf. Biz 5' uç Cy3 veya Cy5 fluorophore Oligo 2 / etiketleme intasome montaj verimliliği 10 kat azaltır bulduk. İç fluorophore etiketleme derleme etkinliğini azaltmaz.</li>
	<li>Bir thermocycler kullanarak aşağıdaki saatlerde ve sıcaklıklar ile TAV: 1 döngüsü 94.0 ˚C 3 dk, 99 döngüsü sırasında (94.0 ˚C 1 dk, 93.6 ˚C 1dk) devir başına 0.8 ˚C tarafından her iki sıcaklık azalan (14,8 ˚C 1 dk, 14.4 ˚C son döngüdür 1 dk) ve mağaza 4.0 ˚C.</li>
	<li>Tüm altmış tüpler tavlama reaksiyonlardan birleştirin. İki 0.5 mL 3 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) ultracentrifugal filtre konsantrasyon cihazları için 500 µL yükleyin. Tavlanmış vDNA tarafından Santrifüjü 14.000 x g (RT) oda sıcaklığında 10 dakika için de bir microcentrifuge içinde konsantre ol. Not: Retentate birim ~ 50 µL her konsantrasyon biriminde olması gerekir.</li>
	<li>Aracılığıyla akış atmak. Kalan tavlanmış vDNA 250 µL her filtre birimine çalışan ekleyin. Spin yineleyin ve aracılığıyla akış atın. TE arabellek (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) Exchange'e 450 µL TE ile üç kez yıkayarak tampon.</li>
	<li>Filtre ünitesi ve 1000 x g RT. 2 min için spin ters çevir Her filtre ünitesi için son retentate ses ~ 50 µL. birleştirin retentates ve 1,5 mL vidalı kapak tüp aktarmak olmalıdır.</li>
	<li>VDNA 260 nm ultraviyole (UV) Absorbans ölçmek. Son molar DNA toplama hesaplamak için bu değeri kullanın. Bu vDNA yok olma katsayısı (ε260) 622,803 cm-1 M-1 ve Moleküler ağırlığı-20 ˚C 23,972 da dükkanda.</li>
</ol>2. Intasome derleme
<ol><li>Mümkünse, intasome derleme küçük bir odada bir değişken termostat ile gerçekleştirin. Termostat yaklaşık 18-22 ˚C için ayarlayın. Not: deneyim, intasome Meclis 4 ˚C de verimli değildir.</li>
	<li>Bir 2 L ölçek bir heyecan plaka üzerinde bir heyecan çizgiyle diyaliz arabelleği (20 mM Bis-tris propan, pH 7.5, 200 mM NaCl, 2 mM dithiothreitol (DTT), 25 µM ZnCl2) 1 L hazırlayın. Arabellek en az 6 h 18-22 ˚C Oda equilibrate.</li>
	<li>İntasomes bir araya getirmek için 50 mM Bis-tris propan, pH 7.5, 500 mM NaCl, 120 µM PFV inç ve 50 µM vDNA 150 µL toplam hacmi içinde birleştirir. Not: PFV inç nükleaz etkinlik7,8kirletici ücretsiz olmalıdır. PFV inç konsantrasyonu ise 200 µL için son hacim artırmak mümkün o zaman da 120 µM inç 150 µL birimindeki karşılamak için sulandırmak. Bu adımın kritik faktörler inç molar oranını vDNA (2.4:1) için korumak için ve Kromatografi sırasında görselleştirmek için yeterli kompleksi için vardır.</li>
	<li>~ 10 cm uzun bir parçası 10 mm 6-8 kDa MWCO diyaliz boru ve klipleri Çift Kişilik distile su (GKD2O) veya en yüksek saflık su ile temizleyin. Tüp bir ucunu küçük. Not: Diyaliz boru laboratuvar uzaydan gelen herhangi bir olası kontaminasyonu önlemek için itina ile ele alınmalıdır.</li>
	<li>Diyaliz boru durulama arabellek (50 mM Bis-tris propan, pH 7.5, 500 mM NaCl) 15 mL olun. Üç kez 1-2 mL durulama arabelleği ile diyaliz boru içine durulayın. Durulama arabelleğin bir pipet ve ince jeli ipucu yükleme mümkün olduğunca çoğunu olmaktan çıkarın.</li>
	<li>Gerekirse, bir temiz jilet veya neşter ince jel yükleme bahşiş hortumunun sonuna ulaşmak böylece diyaliz boru kesmek için kullanın.</li>
	<li>İntasome derleme bir pipet ve ince bir jeli ipucu yükleme diyaliz boru 2.3 adımından aktarın. Açık uçlu boru içinde tanıtılan hava miktarını en aza indirerek diyaliz hortumunun küçük. Boru diyaliz arabellek içine yerleştirin.</li>
	<li>Diyaliz tüp döner ama bir girdap içinde değil böylece nazik karıştırma ile bir gecede (16-20 h). Diyaliz boru batık ve mobil olduğundan emin olun. Yaklaşık bir saat sonra görünür bir çökelti tüp içinde gözlemlemek. Not: Cy3 veya vDNA fluorescently etiketli Cy5 ile çökelti daha açıktır. Bu son etiketli ve dahili olarak etiketli floresan vDNA için geçerlidir.</li>
</ol>3. Intasome Solubilization
<ol><li>İki hazırlamak geniş delik pipet ipuçları 2-4 mm 200 µL bahşiş sonundan itibaren yeni bir jilet ya da neşter bıçak temiz bir yüzey üzerinde kaldırarak. Not: İpuçları adım 3.3 ve 3.5 kullanılacaktır.</li>
	<li>Diyaliz boru diyaliz arabelleğinden kaldırın. Seyreltme klibi yakınındaki hortumunun sonuna kalabilir diyaliz arabelleği ile intasome örneğinin önlemek için bir micropipette bir küçük pipet ucu ile herhangi bir aşırı diyaliz arabellek kaldırmak için kullanın. Küçük resmi diyaliz hortumunun bir ucundan kaldır.</li>
	<li>Kullanım geniş bir adım çökelti diyaliz boru 1,5 mL tüp buz içinde de dahil olmak üzere örnek aktarmak için 3.1 pipet ucu delik. Not kurtarılan malzemenin toplam hacmi; Toplam genellikle ~ 140 µL birimdir.</li>
	<li>200 mM NaCl ile çökelti örneğidir; son konsantrasyonu 320 mm NaCl tuzu bir hisse senedi 5 M NaCl çözüm uygun hacmi ekleyerek artırmak. Örneğin, 150 µL örneği için 3,9 µL 5 M ekleyin NaCl ve 1.1 µL GKD2O 155 µL. Transfer buz kovası ile son bir birim için örnek bir 4 ˚C soğuk odaya.</li>
	<li>Kullanım geniş bir adım resuspend ve pipetting tarafından çökelti solubilize 3.1 pipet ucu delik. Her 20 dakikada en az 1 h. çökelti çoğunu çözüm gitmeli gözlemlemek için yineleyin. Not: çökelti zaman puan arasında artık belirgin bir şekilde azalır belli olduğunda çökelti resuspend için Pipetting durdurulabilir. VDNA değil etiketlenir veya dahili olarak etiketlenir, çökelti görsel inceleme üzerine dayalı ~ 90 oranında azalır. VDNA etiketli Cy5 son söz konusu olduğunda, çökelti sadece ~ 20 oranında azalır; vDNA etiketli fluorophore ucuyla çökelti çoğunu solubilize değil. Etkili çözündürüldükten çökelti değişkendir ve ampirik olarak kararlı olmalıdır.</li>
</ol>4. Intasome arıtma
<ol><li>250 mL boyutu dışlama Kromatografi (sn) arabellek (20 mM Bis-tris propan, pH 7.5, 320 mM NaCl, % 10 gliserol) çalıştıran hazırlayın. Steril filtre 0.2 µm ile tampon filtre ünitesi ve 4 ˚C saklayın. Not: Tüm arıtma adımlar 4 ˚C soğuk odada gerçekleştirilir.</li>
	<li>Bir çapraz bağlı özel sn sütun equilibrate (çapı = 10 mm; uzunluğu 300 mm =; yatak birim 24 mL =; örnek hacmi = 25-500 µL; maksimum basınç = 1,5 MPa; dışlama sınırı = 4 x 107 Da; moleküler ağırlık ayıran Mat tablo 5 ve 5000 kDa arasında görmek erials) sn 0.4 mL/dk akış hızında çalışan arabelleği ile. Not: etkin bir şekilde Superose 12 10/300 GL veya Superose 6 artırmak gibi 44 kDa 300 kDa ayırmak mümkün olup olmadığını bu arıtma farklı boyut dışlama sütunlar için adapte. Superose 12 10/300 GL daha düşük çözünürlük, zirveleri daha fazla çakışma için lider vardır. Tersine, Superose 6 artış daha yüksek çözünürlüğe sahip ve daha iyi renk ayrımı sunmaktadır.</li>
	<li>14.000 x g 4 ˚C kalan herhangi bir çökelti cips, 10 min için de bir microfuge intasome örnekte santrifüj kapasitesi. Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın. Süpernatant 200 µL enjeksiyon döngü (~ 200 μL tutabilir boru) yükleyin. Örnek sn sütun için geçerlidir. Not: Daha küçük yük birimler sn tarafından daha fazla çözünürlük sağlar.</li>
	<li>25 sn çalıştıran tampon ve 270 µL. 95 kesirler toplamak mL ile elute sn Kromatografik üç A280/A260 tepeler (şekil 1) görüntüler gözlemlemek. Not: İlk toplama (~9.0 - 11,5 mL elüsyon), ardından PFV tetramer intasome tepe (~12.0 - 14.75 mL elüsyon) ve PFV inç monomer ücretsiz vDNA tepe (~15.0 - 18,0 mL) ile olmalıdır.</li>
</ol>5. entegrasyon Strand Transfer tahlil, kesir seçimi ve depolama
<ol><li>Her intasome tepe kesir ve 50 2 µL birleştirmek ng 3 kb supercoiled plazmid DNA (hisse senedi toplama olduğunu 50 ng/µL) 15 µL son tepki hacmine tepki arabelleği (10 mM Bis-tris propan, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 µM ZnCl2, 10 mM DTT). 5 min için 37 ˚C, kuluçkaya.</li>
	<li>Eklenen hiçbir PFV intasome ile bir negatif kontrol içerir. Reaksiyon (20 mg/mL stok çözelti) 0,75 µL İndinavir K ile ve 0,75 µL SDS durdurmak (% 10 hisse senedi çözüm). -20 ˚C daha sonraki analizler için gerektiği gibi 1 h. mağaza örnekleri için 55 ˚C, kuluçkaya. Not: Bu tahlil Tümleştirme faaliyet nitel bir değerlendirme olduğunu. Her kesir intasome molar konsantrasyon bu tahlil önce belirlenir değildir. Entegrasyon strand transfer tahlil dahil kesirler saklanabilir kadar entegrasyon (gece depolama da dahil olmak üzere) buzda etkinliğini doğruladı ve seçili kesirler bölünmemeli. Burada pMP2, bir pUC19 türev9kullanırız. Biz de başarıyla 5.4 kb plazmid pcDNA 3.1 kullandık. İçin çözülmüş olabilir herhangi bir plazmid daire, doğrusal, rahat ve supercoiled formları tümleştirme için bir hedef olarak kullanılabilir.</li>
	<li>120 mL % 1 kilo başına 1 X TAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) önbellekle 0,1 μg/mL arasında etidyum bromür (EtBr, 10 mg/mL stok solüsyon)10birim (w/v) özel jel hazırlayın. Özel çözüm eritmek ve 15 cm x 10 cm jel döküm tepsiye dökün. 15-iyi tarak 5 mm genişliğinde, 0,75 mm kalın kuyu ile ekleyin. Not: 1.5 mm kalınlığında wells için karşılaştırıldığında daha iyi grup çözünürlük daha dar kuyu verim.</li>
	<li>Ortam sıcaklığında katılaşmaya jel izin. 1 X TAE ile 0,1 μg/mL EtBr jel bırakın.</li>
	<li>3 µL % 50 gliserol her Tümleştirme tepki adım 5.2 ekleyin. Jel tüm reaksiyon birime yükleyin. 10 kb DNA boyutu işaretleyici (150 ng/µL hisse senedi toplama) örnekleri her iki tarafında kulvar için 1 µL yük; başka bir deyişle, DNA boyutu marker örnek şerit yan.</li>
	<li>Dış bir şeritte 6 µL Orange G boya (%0.25 portakal G, % 30 gliserol) yükleyin. Jel sabit voltaj, 10 V/cm (100 V), ortam sıcaklığında veya 1 h için Orange G boya açık jel sonuna ulaşana kadar çalıştırın.</li>
	<li>Hemen özel jel EtBr (532 nm uyarma, 610 nm emisyon filtre) tespit etmek için ayarla floresan bir tarayıcı ile resim. VDNAs etiketli fluorophore kullandıysanız, aynı zamanda uygun fluorophore ayarları ile görüntü. Not: Örneğin, Cy5 tespit etmek için DNA, 633 nm uyarma ve 670 nm emisyon filtreleri kullanarak görüntü etiketli. Uyumlu entegrasyon ürünleri (CI, doğrusal DNA) ~ 3 kb boyutu sadık çalıştırmalısınız, unreacted supercoiled plazmid (SC) daha hızlı (~ 2 kb) çalıştırmalısınız ve yarı-site entegrasyon ürünleri (HSI, rahat daire DNA) yavaş (~3.5 kb) çalıştırmalısınız. Unreacted vDNA ~ 40, gerçek boyutu çalıştırmak gerekir kan basıncı.</li>
	<li>Her yol, görüntüleme yazılım7bantlarında ölçmek. DNA kesir CI, HSI veya SC her şeritte hesaplamak; vDNA bu hesaba dahil değil. Not: Entegrasyon verimliliği veya doğrusal bir ürün, dönüştürülmüş SC kısmını uyumlu entegrasyon ürünleri (CI) piksel hacmi üç grup (HSI + CI + SC) toplam piksel Hacmen bölerek hesaplanmıştır. İntasomes etiketli fluorophore iseniz, HSI ve CI ürünleri de floresan tarafından quantitated.</li>
	<li>En uyumlu entegrasyon etkinliğine sahip kesirler seçin. Not: deneyim, tetrameric PFV intasomes tanımlanan protein en yüksek ile en yüksek uyumlu entegrasyon etkinlik denk geliyor. Her birinin bu kesirler A280 ölçmek ve son intasome konsantrasyonu hesaplayın. PFV inç vahşi türünde iki vDNAs burada anlatılan bir tetramer ε280 908,339 cm-1M-1 ve molekül ağırlığı 225.5 kDa. Konsantrasyonları aynı model olarak sn Kromatografik tepe ve strand transfer tahlil takip etmelidir.</li>
	<li>5 µL aliquots her kesir dağıtmak ve erken sıvı azot içinde dondurmak. Aliquots,-80 ˚C saklayın. Depolama birimi için seçilen kesirler genellikle 200-600 nM arasında bulunmaktadır.</li>
</ol>

<ol><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li>
<li>Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasome+assembly+and+inhibition+of+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer.</a> Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).</li>
<li>Li, M., Lin, S., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+domains+of+integrase+within+retroviral+intasomes+are+dispensible+for+catalysis+of+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration.</a> Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).</li>
<li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+conformations+of+prototype+foamy+virus+integrase+and+its+stable+synaptic+complex+with+U5+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA.</a> Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409(2016).</li>
<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li>
<li>Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+access+to+DNA+target+sites+in+folded+chromatin+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers.</a> J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+a+novel+octameric+integrase+structure+for+betaretroviral+intasome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function.</a> Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).</li>
<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+supramolecular+assembly+mediates+lentiviral+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration.</a> Science. 355 (6320), 93-95 (2017).</li>
<li>Passos, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+and+atomic+model+of+the+HIV-1+strand+transfer+complex+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome.</a> Science. 355 (6320), 89-92 (2017).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+Rous+sarcoma+virus+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome.</a> Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).</li>
<li>Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+retroviral+integration+from+X-ray+structures+of+its+key+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates.</a> Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Retroviral Ins entegrasyonu gerçekleştirmek için ve viral ömrünün devam viral genomik DNA ile karmaşık bir multimeric oluştururlar. Monomer intasome başına sayısı tetramers, octamers ya da muhtemelen daha yüksek sipariş multimers11,12,13,14olabilir. PFV intasomes3. bir tetramer rekombinant viral genomik DNA taklit çift iplikçikli DNA reaksiyonlar ile biter vardı...

Ana bilgisayar genom viral genom entegrasyonu döngüsündeki tüm Retrovirüsler1zorunlu bir adımdır. Viral enzim integrase (IN) viral DNA genom DNA ağırlamaktan her iki ucuna kovalent katılmadan tromboksan. Hücresel bir enfeksiyon sırasında Tümleştirme aracılık eder öncesi entegrasyonu karmaşık bir parçasıdır. Rekombinant inç viral DNA uçları taklit çift iplikçikli DNA reaksiyonlar ile complexed da bir hedef DNA vitro2entegrasyon gerçekleştirebilirsiniz. Bir ortak Tümleştirme tahlil vitro supercoiled plazmid DNA hedef kullanır. Her iki viral DNA reaksiyonlar (vDNA) için plazmid bütünleştirilmesi doğrusal bir üründe sonuçları ve uyumlu entegrasyon (şekil 2A) olarak adlandırılır. Entegrasyon tahlil vitro da tek bir vDNA kovalent rahat bir daire içinde sonuçlanan hedef plazmid katıldı ile ürün verim. Bu yarı-site Tümleştirme ürün tahlil içinde in vitrobir eşya gibi görünüyor.
Rekombinant inç ve vDNA entegrasyonu vitrogerçekleştirebilir, ama monomeric inç ilgili görselleştirme karanlık onlar Tümleştirme kompleksleri yapısını veya çalışması dinamikleri ile ideal Kimyasalları değil. Arıtılmış Tümleştirme kompleksleri veya "intasomes," dinamik tek molekül analiz veya yapısal çalışmalar için gereklidir. PFV inç ve vDNAs diyaliz tarafından bir daha düşük tuz konsantrasyonu3,4' e bir nispeten yüksek tuz konsantrasyonu arabelleğinden monte. Diyaliz, bir çökelti sırasında formları. Bu çökelti diyaliz kaldırılır ve tuz konsantrasyonu artar. Yüksek tuz konsantrasyonu acele içeren PFV intasomes solubilizes. İntasomes o zaman boyutu dışlama Kromatografi (sn) tarafından saf. Rekombinant prototip köpüklü virüs (PFV) inç 225 µM5konsantrasyonlarda çözümde bir monomer olarak bulunmaya gösterilmiştir. SN ayırma etkili bir tetramer PFV inç ve iki vDNAs içeren PFV intasomes (225.5 kDa), monomeric PFV (44,4 kDa) ve ücretsiz vDNA (24.0 kDa) ayırır. PFV intasomes dondurulmuş olabilirler ve en az altı ay-80 ˚C, Muhafazası için Tümleştirme etkinliğini korumak.
Rekombinant PFV intasomes de amino asit oyuncu değişikliği veya kesilme mutasyonlar veya fluorophores veya biotin4,6ile etiketli vDNAs içerecek şekilde değiştirilmiş. Saf PFV intasomes kolayca supercoiled plazmid hedef DNA vitroentegrasyonu gerçekleştirmek. Toplu biyokimyasal Tümleştirme deneyleri ile intasomes etkilerini mutasyonların inhibitörleri veya diğer maddeleri, kimyevî test. Biotinylated intasomes nükleik asit veya proteinler ile ilgi soruşturma için kullanılabilir. PFV intasomes iki vDNA ucu veya intasome arama hedef görselleştirmek için toplam iç yansıma Floresans katılmadan arasında geçen zamanı ölçmek için manyetik cımbız tarafından tek molekül mikroskobu analiz için izin ortam sıcaklığında işlevsel olduğundan DNA6. Ayrıca, PFV intasomes ilk yapısal olarak olacak önemli ölçüde etkileyen retroviral entegrasyon3alan ile karakterize edildi.

<table><tbody><tr><td>DNA Oligomerleri</td><td>IDT N</td><td>/A</td><td>Özel DNA Oligos</td></tr><tr><td>Tris Ultra Saf</td><td>Gojira İnce Kimyasallar</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL santrifüj filtreler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z677094-24EA</td><td>3 kDa MWCO</td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS propan, >=%99,0 (titrasyon)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Jel yükleme uçları, 1 - 200 &mu; L</td><td>Corning</td><td>CLS4853-400EA</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı; Tek kenarlı; 100/Pk.; 100'lük</td><td>Paket Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>PES Membranlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri > 250mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz tüp klipsleri</td><td>Spectrum Labs</td><td>132734</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa 10 mm Diyaliz Tüpü</td><td>Spectrum Medical</td><td>132645</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Çözünürlüklü Standart</td><td>Agatar AGTC Biyoürünler</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Turuncu G</td><td>Fisher Scientific</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>Hyladder 10kb, 500 şerit</td><td>Denville Scientific</td><td>CB4225-4</td><td></td></tr></tbody></table>

derleme ve prototip köpüklü virüs intasomes arıtma

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A özelliği ve gerekli adım retrovirüsü yaşam döngüsünün tanimlar viral genom entegrasyon ana bilgisayar genom. Tüm Retrovirüsler kovalent ana bilgisayara strand transfer olarak bilinen DNA viral birleştirilmesi tromboksan integrase (IN) enzim kodlamak. Entegrasyon modellenmiş vitro rekombinant retroviral inç ile olmak ve viral genom uçları taklit eden DNA reaksiyonlar olabilir. Daha yakından vivo içindeentegrasyon oluşur Tümleştirme tepki özetlemek için kompleksleri rekombinant inç ve sentetik reaksiyonlar diyaliz azaltılmış tuz konsantrasyonu arabellekte tarafından monte edilir. Entegrasyonu karmaşık, bir intasome olarak adlandırılan boyut dışlama Kromatografi tarafından saf. Prototip köpüklü virüs (PFV), söz konusu olduğunda intasome inç bir tetramer ve iki DNA reaksiyonlar ve kolayca monomeric inç ve ücretsiz oligomer DNA ayrılır. PFV intasomes entegrasyon verimliliği daha iyi dinamiklerini anlamak için deneysel koşullar çeşitli ve mekanik retroviral entegrasyon altında denetlesinler.

PFV intasomes rekombinant inç vDNA toplanır. Derleme sonra intasomes (şekil 1) SEC tarafından saf. Entegrasyon etkinliği her kesir bir supercoiled DNA hedef ve özel Jel Elektroforez ile (Şekil 2) denetlesinler. Bu jel EtBr (ve fluorophore, fluorophore etiketli vDNA kullanılırsa) algılamak için ayarla floresan tarayıcıyla görüntüsü. Görüntü analiz yazılımı kullanarak, grup piksel birimleri entegrasyon verimliliği (<strong class="x...

Rekombinant retroviral integrase ve DNA reaksiyonlar viral DNA uçları taklit eden bir intasome bilinen bir enzimatik etkin kompleks oluşabilir. Intasomes biyokimyasal, yapısal ve Kinetik çalışmalar için kullanılır. Bu protokolü nasıl bir araya getiren ve prototip köpüklü virüs intasomes arındırmak ayrıntılı.

Derleme ve prototip köpüklü virüs Intasomes arıtma

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Bu prosedürün genel amacı, daha sonra biyokimyasal, yapısal ve kinetik çalışmalar için kullanılabilecek prototip köpüklü virüs intazomlarının bir araya getirilmesi ve saflaştırılmasıdır. Bu yöntem, entegrasyonun mekaniği ve dinamikleri gibi retroviroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, türlerin heterojen bir karışımından ziyade entegrasyon komplekslerinin izolasyonuna izin vermesidir.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, entegrasyon komplekslerinin geri kazanımı ve çözündürülmesi, optimum intasome verimini sağlamak için kritik öneme sahip olduğundan faydalıdır. Başlamak için, 1XTEN tamponu, 10 mikromolar oligo-1 ve 10 mikromolar oligo-2'yi 1.5 mililitrelik bir son hacimde birleştirin. Daha sonra, karışımın 25 mikrolitresini 60 0.2 mililitrelik polimeraz değişim reaksiyon tüplerine alın.Metin protokolünde listelenen süreler ve sıcaklıklarla bir termodöngüleyici kullanarak DNA'yı tavlayın. Reaksiyonu takiben, 60 tüpün tümünden gelen tavlama reaksiyonlarını birleştirin. Daha sonra 500 mikrolitre iki adet 0.5 mililitre üç kilodalton moleküler ağırlık kesme ultrasantrifüj filtre konsantrasyon birimi yükleyin.Tavlanmış viral DNA'yı, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 14.000 kez g değerinde bir mikrosantrifüjde santrifüjleme yoluyla konsantre edin. Akışı attıktan sonra, her bir filtre ünitesine kalan tavlanmış viral DNA'dan 250 mikrolitre ekleyin. Yaklaşık 50 mikrolitre kalana kadar sıkma işlemini tekrarlayın ve akışı atın.Daha sonra, bugger 450 mikrolitre TE ile üç kez yıkayarak numuneyi TE tamponuna değiştirin. Tampon değişimini takiben, filtre ünitesini ters çevirin ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca 1000 kez g'de döndürün. Her bir filtreleme ünitesi için son tutulan hacim yaklaşık 50 mikrolitre olmalıdır. Kalıntıları birleştirin ve 1,5 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın.Son olarak, DNA konsantrasyonunu hesaplamak için viral DNA'nın 260 nanometre ultraviyole absorbansını ölçün. İntazomları birleştirmek için, 50 milimolar bis-tris propan pH 7.5, 500 milimolar sodyum klorür, 120 mikromolar PFV integraz ve 50 mikromolar viral DNA'yı toplam 150 mikrolitre hacimde birleştirin. 10 santimetre uzunluğunda, 10 milimetre çapında, altı ila sekiz kilodalton moleküler ağırlıklı kesme diyaliz tüpünü ve ilgili klipsleri çift damıtılmış su veya mevcut en yüksek saflıkta su ile temizleyin.Borunun bir ucunu klipsleyin, diyaliz borusunun içini bir ila iki milimetre durulama tamponu ile üç kez durulayın. Pipet ve ince jel yükleme ucu ile durulama tamponunun mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Ardından, intasome tertibatını pipet ve ince bir jel yükleme ucu ile diyaliz tüpüne aktarın.Düzeneğin doğrudan diyaliz tüpünün altına atıldığından emin olun. Diyaliz tüpünün açık ucunu klipsleyin, tüp içine giren hava miktarını en aza indirin. Ardından hortumu diyaliz tamponuna yerleştirin.Gece boyunca hafif karıştırmalarla diyalize edin, böylece boru döner, ancak bir girdap içinde olmaz. Diyaliz tüpünün suya daldırılmış ve hareketli olduğundan emin olun. Yaklaşık bir saat sonra, çökelti borunun içinde görünür olmalıdır.Temiz bir yüzeyde yeni bir tıraş bıçağı veya neşter bıçağı ile 200 mikrolitrelik bir ucun ucundan iki ila dört mililitre çıkararak iki geniş delikli pipet ucu hazırlayın. Diyaliz tüpünü diyaliz tamponundan çıkarın. İntazom numunesinin, tüpün ucunda klipsin yakınında kalabilecek diyaliz tamponu ile seyreltilmesini önlemek için, fazla diyaliz tamponunu çıkarmak için küçük bir pipet ucuna sahip bir mikropipet kullanın.Diyaliz tüpünün bu ucundan klipsi çıkarın. Düzeneği geri kazanırken, mümkün olduğunca fazla çözelti toplamak ve çökeltmek önemlidir. Diyaliz tüpünün içindeki çökelti de dahil olmak üzere numuneyi buz üzerindeki 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için geniş delikli propette ucunu kullanın.Geri kazanılan malzemenin toplam hacmini not edin. Toplam hacim tipik olarak yaklaşık 140 mikrolitredir. Çökelti içeren numune 200 milimolar sodyum klorürdedir.Uygun hacimde bir stok beş molar sodyum klorür çözeltisi ekleyerek tuzu 320 milimolar sodyum klorür nihai konsantrasyonuna yükseltin. Numuneyle birlikte buz kovasını dört santigrat derece soğuk odaya aktarın. Pipetleme yoluyla çökeltiyi yeniden askıya almak ve çözündürmek için geniş delikli pipet ucunu kullanın.En az bir saat boyunca her 20 dakikada bir tekrarlayın. Çökeltinin çoğu çözeltiye girmelidir. İntazomu saflaştırmak için, çapraz bağlı, agaroz boyut dışlama kromatografisini veya SEC kolonunu, dakikada 0.4 mililitrelik bir akış hızında SEC çalışma tamponu ile dengeleyin.Kalan çökeltiyi peletlemek için intasome örneğini 14.000 kez g'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede bir mikrofüje santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkardıktan sonra, 200 mikrolitrelik bir enjeksiyon döngüsüne yükleyin. Örneği SEC sütununa uygulayın.25 mililitre SEC çalışma tamponu ile elute edin ve 270 mikrolitrelik 95 fraksiyon toplayın. SEC kromatogramının üç A280 ve A260 tepe noktası gösterdiğini gözlemleyin. Her bir intasome tepe fraksiyonunun iki mikrolitresini, 15 mikrolitrelik bir son reaksiyon hacminde reaksiyon tamponunda 50 nanogram üç kilobaz süper sarmal plazma DNA'sında birleştirin.Ayrıca, PFV içeriği eklenmemiş bir negatif kontrol ekleyin. 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. 0.75 mikrolitre proteinaz K ve 0.75 mikrolitre SDS ile reaksiyonu durdurun.Daha sonra numuneyi bir saat boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, her entegrasyon reaksiyonuna üç mikrolitre yüzde 50 gliserol ekleyin. Tüm reaksiyon hacmini, hacim başına yüzde bir ağırlığa agaroz jeline yükleyin.Ayrıca, numunelerin her iki tarafındaki şeritlere bir mikrolitre 10 kilobaz DNA boyutu işaretleyicisi yükleyin. Bir dış şeride altı mikrolitre turuncu G boyası yükleyin. Jeli sabit voltajda, santimetre başına 10 voltta, ortam sıcaklığında bir saat boyunca veya turuncu G boya cephesi jelin sonuna ulaşana kadar çalıştırın.Etidyum bromürü algılamak için ayarlanmış bir floresan tarayıcı ile agaroz jeli hemen görüntüleyin. Bu görüntü, üç kilobazda boyuta sadık çalışan bir bant olarak uyumlu entegrasyonu göstermelidir. Görüntüleme yazılımıyla her şeritteki bantları belirledikten sonra, en uyumlu entegrasyon etkinliğine sahip kesirleri seçin.Her fraksiyonu beş mikrolitrelik alikotlara dağıtın. Son olarak, alikotları eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce sıvı nitrojen içinde dondurun. Bir PFV intasome montaj saflaştırmasının temsili bir kromatogramı gösterilmiştir.Üç tepe görülebilir. Merkez tepe, doğru şekilde monte edilmiş intazomlarla ilişkilidir. Entegrasyon verimliliği merkez kromatografi tepe noktasından bir kesir olarak gösterilmiştir.İntazomlar, donma ve çözülme olmadan ve çözülme ile aktivite açısından test edildi. Dondurma ve çözme, entegrasyon reaksiyonu ürünlerinin etidyum bromür lekeli agraoz jelinde hiçbir fark göstermedi. Burada, süper sarmal plasbid, uyumlu entegrasyon ürünleri, yarım görüş entegrasyon ürünleri ve reaksiyona girmemiş viral DNA belirtilmiştir.Etidyum bromür görüntüsünden entegrasyon verimliliğinin kantitasyonu, donma ve çözülme sonrasında entegrasyon aktivitesinde herhangi bir kayıp olmadığını da doğrular. Bu, uzun süreli depolamaya izin verir. Etiket molekülü ve konumu, PFV intasome düzeneğinin verimliliğini etkiler.Etiketsiz iç kısımlar ve dahili bir Cy5 etiketi, eşdeğer montaj verimliliğini gösterir. Bununla birlikte, son etiket Cy5 veya biyotin montaj verimliliğini azaltır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir.Bu prosedürü takiben, entegrasyon, kinetik ve dinamiklerle ilgili ek soruları yanıtlamak için biyokimyasal ve tek molekül tahlilleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, PFV intasomelarının nasıl monte edileceğini, saflaştırılacağını ve işlevsel olarak değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

assembly-and-purification-of-prototype-foamy-virus-intasomes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Ile bitki hücreleri için birden fazla viral bileşenlerinin teslim senkronize etmek için basit, verimli ve sağlam bir...

Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro</emVirüs Meclisi Öğrenmenin> Yaklaşım

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Virionların yüzeye bağlanması, Süper çözünürlüklü floresan görüntüleme veya atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile tek virion görüntüleme için bir gerekliliktir. Burada, VIRIONların AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntülemede kullanıma uygun cam yüzeylere kontrollü yapışıklık için örnek bir hazırlama yöntemi gösteriyoruz.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Virüsün konak hücrelere girişi sırasında influenza A virüs çekirdeklerinin sökülmesi çok adımlı bir işlemdir. Viral kaplamanın erken aşamalarını analiz etmek için bir in vitro yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşımda, tanımlanmış koşullar altında kaplamayı başlatan adımları biyokimyasal olarak incelemek için hız gradyan santrifüjlemesi kullanılır.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Rekombinant prototip köpüklü virüs integrase protein genellikle arıtma sırasında bakteriyel nükleaz ile kirlenmiş. Bu yöntem nükleaz kirlenme belirler ve enzim son hazırlık kaldırır.

Algılama ve kaldırma nükleaz kirlenme rekombinant prototip köpüklü virüs Integrase saflaştırılması sırasında

Biyolojik membran füzyon özel füzyon proteinleri tarafından katalizlenmiş. Proteinlerin fusogenik özelliklerinin ölçülmesi lipid karıştırma özellikleri ile elde edilebilir. Biz rekombinant Drosophila atlastin arındırılması için bir yöntem sunuyoruz, ER homotypic füzyon aracılık bir protein, önceden biçimlendirilmiş lipozomlar için reconstituting, ve füzyon kapasitesi için test.

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Burada, enfekte amiplerin ayrılması için tek bir hücreli mikro-aspirasyon yöntemini tanımlıyoruz. Faustovirüsler ve bilinmeyen dev virüsler tarafından enfekte Vermamoeba vermiformis viral alt popülasyonları ayırmak için, aşağıda ayrıntılı protokolü geliştirdi ve iki düşük bolluk yeni dev virüs ayırma yeteneğini gösterdi.

Dev Virüs Karışım Ayırma için Floresan-Aktive Hücre Sıralama alternatif bir strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon

Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.

Elastin benzeri Proteinlerin tanımlanmış Supramoleküler Yapılara Yönlendirilmiş Montajı ve Tüp Bebek Tespülasyonu

Solunum sinsitial virüsünün (RSV) RNA sentezinin derinlemesine mekanistik analizi için, virüse özgü nükleokapsidlerin (NC) sonraki in vitro montajı için RNA içermeyen nükleoproteinin (N0)birlikte ifade edilmesi için refakatçi fosfoprotein (P) kullanma protokolünü rapor ediyoruz.

Solunum Sinsitial Virüsünün Virüse Özgü Nükleopapsidlerinin Üretimi ve Montajı

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Öğrenin prototip köpüklü virüs intasomlarının derlenmesi ve arıtılması yöntemini. Bu teknik, retroviral integrasyon mekaniğini ve dinamiklerini incelemek için biyokimyasal ve yapısal çalışmalarda kullanılabilir.

Derleme ve prototip köpüklü virüs Intasomes arıtma

Daha fazla video keşfet