Name: De Novo Somatik kök hücreleri tarafından YAP/TAZ nesil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Keşfedin YAP kullanarak farklılaşmış hücreleri progenitör hücrelere yeniden programlama yöntemini. Bu teknik meme bezi ve pankreas dokularından somatik kök hücre üretimi için rejeneratif tıpta uygulama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

F. Camargo tetO YAPS127A farelerhediye için teşekkür ederim; R26-rtTAM2 fareler (stok #006965) Jackson laboratuardan satın. Chiara Frasson ve Giuseppe Basso FACS yordamlar ile yardım için teşekkür. Bu eser AIRC özel Program moleküler klinik Onkoloji '' mille başına 5'' tarafından desteklenen ve bir AIRC PI-Grant S.P için ve epigenetik amiral gemisi projesi CNR-Miur tarafından S.P. için verir Bu proje Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı (hibe sözleşmesi DENOVOSTEM No 670126) altında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) üzerinden fon aldı.

<ol><li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li>
<li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+strategies%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281(2014).</li>
<li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li>
<li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li>
<li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li>
<li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+of+mutant+KRAS%2C+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42(2014).</li>
<li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+at+the+Roots+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li>
<li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li>
<li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li>
<li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li>
<li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li>
<li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li>
<li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Lentiviral production and infection. , 
 <a target="_blank" href="http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf">http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf</a> (2016).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Burada YAP, geçici ifade tarafından daha önce1bildirildiği gibi ölümcül ayrıştırılan ex vivo epitel hücreleri farklı dokuların onların karşılık gelen doku özgü progenitör hücreler (ya da ySCs) yeniden programlamak için protokolleri mevcut. Biz iki yordam ayrıntılı: bir lentiviral Vektörler ve viral enfeksiyon önler ve alan avantaj transgenik YAP ifade ikinci bir FACS saf hücrelerinin yeniden programlama sağlar. Her iletişim kuralı izole etmek için etkili bir strateji sunar ve farklı hücrelerde de novo somatik doku özgü Genişletilebilir kök hücreleri (bkz: üreten gen ekspresyonu YAP kültür birincil farklılaşmış hücreler ve eksojen zorlamak için bir strateji düzenleri rakamlar 1A ve 2A).
Burada etkin bir şekilde sunulan yalıtım stratejileri farklılaştırılmış hücrelerin saf bir nüfus ayrı bir şekilde negatif kontrol örnekleri (rakamlar 1 c ve 2 C) üzerinden herhangi bir çıkıntı hiç tespit ettik Aslında gösterdiği gibi gösterdi.
Bu çalışmada birincil meme LD hücrelerinin yeniden programlama için kullanılan lentiviral vektörleridir Doksisiklin transgene ifade sıkı bir kontrol imkanı sunan indüklenebilir; Bu açmak için izin verir ve eksojen YAP ifade eder. Bu verimlilik yeniden programlama açısından zararlı olabilir gibi özellikle dikkat aşırı bir viral titresi kullanımı kaçınarak yer almalıdır. Birincil acinar hücreleri söz konusu olduğunda, bir YAP-bağımlı ile en az manipülasyonlar yeniden programlama elde etmek için tam transgenik bir yaklaşım için açık. İzole acinar kümeleri pek müsait lentiviral enfeksiyon ve çok kırılgan olduğu gibi bu ikinci strateji de birincil pankreas acini için özellikle uygundur. İstihdam transgenik strateji Doksisiklin bağımlı lentiviral vektörler gen ekspresyonu sıkı kontrolü için aynı avantajı sunuyor. Ayrıca, birincil pankreas acini ile istismar transgenik strateji viral kaynaklı meme LD hücrelerinin yeniden programlama için göre bir çok daha yüksek programlama verimlilik avantajı taşımaktadır. Hücrelere farklı dokular elde ilişkili farklı iç plastisite pankreas yeniden programlama daha yüksek oranda daha yüksek verim ilişkili tüm üniforma ve özerk YAP ifade için ifade türetilen explanted hücreleri. Özellikle, eksojen YAP artık ySCs (yMaSC kolonileri ve yDucts), bir nesil sonra kendi kendini yenileme kapasitesi etkilemeden gerekli olduğunu göstermiştir. Bunun nedeni ySCs endojen YAP/TAZ yeniden etkinleştirin ve eksojen YAP1adet açık olduğunda onları öz-yenileme için kullanın.
YSCs gerçekten de ortaya farklılaştırılmış hücrelerden programlama deneylerimiz ile genetik soy izleme doğrulamaları1menşe hücre kontrol ederek kavramı geçerliliği.
Geniş karakterizasyonuySCs gösterir YAP kaynaklı yeniden programlama normal somatik SCs1 ben oluşturur) transcriptomic düzeyinde ySCs ile yerli SCs; büyük programların çakışmasını görüntülemek. II) ySCs farklılaşma potansiyeli görüntülemek ve her zaman onların doku kökenli kimlik için sınırlı bir multilineage döl oluşturabilir; III) sigara dönüştürülmüş ySCs ve tumorigenic zaman içinde vivonakledilmektedir.
Burada da korumak ve kültürde genişletmek için yordamlar açıklar yMaSCs ve yDucts organoids olarak % 100 membran matris hydrogels içinde gömülü. Bu koşullar için kendi kendine organizasyon olanak verir stemness özellikleri kültürde uzun vadeli bakım sağlamak üç boyutlu organoids içine ySCs nüfus aşağı akım analizleri ve uygulamalar için diledikleri kaynaklanıyor bunlar genişletmek için etkinleştirme. Bilinmeyen nedenlerden dolayı yMaSC alamadı yerleştirerek organoids enfekte LD hücreleri organoid kültür koşullarda doğrudan plastik doku kültürü plaka; Doksisiklin tedavi sonrası 7 gün başka bir deyişle, ara büyüme meme koloniyi koşulları temel adımdır. Bizim ellerde bile yerli MaSCs organoid kültür passaging önce meme koloniyi koşullar gerektirir. Ayrıca, biz birincil kolonileri tek hücrelere dissociating önlemek, ancak oldukça sağlam koloniler organoid kültür koşullar aktarmak en verimli organoid sonucu elde edilir.
Organoid kültür koşulları da şartıyla organoids hücre ayrılma dondurma azot banyo önce kaçınarak onların matrisler kurtarıldı ySCs, cryopreserve imkanı veren avantajı ayı.
Sunulan yordam yeniden programlama YAP farklı farklı hücre tipleri farklı yetişkin dokulardan (biz-si olmak sınav meme, pankreas ve nöronal hücre kullanarak) karşılık gelen doku özgü kök hücreler türetilmiş dönüştürebilirsiniz1. İPSCs veya diğer programlama çabaları farklılık, YAP/indüklenen SCs doku kökenli anıları koruyabilirsiniz. Dikkat, kök gibi özelliklerle donatılmış hücrelere somatik hücre de-farklılaşma hücre kader plastisite tek biçimidir ve yeniden programlama örneğin sonra doku hasarı ve5,17 şifa yara desteklemek için içinde vivo gözlenen , 18 , 19 , 20. bu önemli YAP ve TAZ için normal homeostazı büyük ölçüde gereksiz ama birden fazla doku11,21doku onarımı için çok önemli değil. Sürekli burada açıklanan programlama adımları fizyolojik fonksiyonu ile YAP/TAZ son zamanlarda gösterilmiştir bir dönüşüm yetişkin bağırsak hücrelerinin neden olarak bağırsak rejenerasyon Ülseratif Kolit hastalarının fare modellerinde gerekli için fetal gut19özelliklerini görüntüler tamir epitel. YAP yeniden programlama böylece geçerli indüklenen hücre plastisite stratejileri sağlayarak kuruluşlarınızdaki defa içinde vitroyakalamak için zorlu bir devlet, somatik kök hücre üretmek için genişler. Bu yaklaşım, aynı zamanda insan kaynaklı hücrelere genişletilmiş geniş ilgi somatik stemness devletin çalışma rejeneratif tıp uygulamalarından olan ve somatik genişlemesi için kök hücreleri vitro.

Doku özel somatik kök hücreleri (SCs) yaralanma sonra doku yenileme ve onarım için kritik öneme sahiptir. Kolayca ayırmak ve unlimitedly ex vivo somatik SCs temsil SC uygulamalarında temel araştırma ve hastalık modelleme yanı sıra potansiyel rejeneratif tedaviler için kritik bir sorunu genişletin imkanı. Bu yönde ilerleme ancak, çeşitli epitelyal organları içinde vitroSC durumunu yakalayan zorluk tarafından sınırlıdır. Gerçekten de, birçok yetişkin dokularda ikamet SCs var veya kullanıma hazır olur olmaz veya kendi numarası ve rejeneratif potansiyel ya da yaşlanma hastalığı koşullar tarafından aşınmış olabilir. Bu ifade, tek bir transkripsiyon coactivator bildirerek bu boşluğu doldurmak başladık 2016 yılında YAP (Evet ilişkili protein) veya onun yakından ilişkili protein TAZ (transkripsiyon harekete geçirmek PDZ motifi ile), ölümcül farklılaşmış hücreler verimli bir şekilde onların karşılık gelen doku özgü SCs1operasyonel ve tatlı ayırt edilemez işlev, genişletilebilir, Sigara tumorigenic, Otolog hücre popülasyonlarının oluşturur. Bir darbe YAP sürekli veya TAZ birkaç gündür somatik SCs kendini sürekli yenileyen görünümü ikna etmek yeterli bir faaliyettir. Bu gibi daha fazla ifade Ektopik YAP/TAZ1olmadan cep nesilden bulaşabilir artık sürekli transgene ifade üzerinde bağımlı değil istikrarlı bir durumdur. Protokol burada yordam de novo epitel kök/progenitor hücreler meme bezi ve pankreas, bu dokuların farklılaştırılmış hücrelerden başlangıç üretmek için kullanılan ayrıntıları sundu. Bu yordamı geçerli yeniden programlama/transdifferentiation arenada bir kara kutu doldurur. Bu yönde ana çabaları gerçekten defa bu embriyonik dönüşüm tarafından takip bir İndüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC) durumuna hücre geçiş merkezli ve pluripotent SCs içine daha hücreleri ayrıştırılan. Ancak, iPSCs bir kez onların tam ve verimli farklılaşması2protokollerde geliştirme ihtiyacı yükselterek yetişkin dokularda ortaya tumorigenic. Ancak, bu farklılaşma adımı bile mümkün olduğunda, uzun vadeli genişletilebilirlik, kendi kendine organizasyon ve organ repopulation potansiyelleri bedeli vardır. Aslında tipik sadece endojen doku özgü SCs ve şu anda açıklanan YAP kaynaklı SCs (ySCs) temel öznitelikleri organ rejenerasyon için bunlar. Benzer şekilde, doğrudan transdifferentiation bir hücre türü kokteyller ve çeşitli transkripsiyon faktörleri de oluşturmak kullanarak başka bir temel proliferatif stemness potansiyel ve3eksikliği hücreleri ayrıştırılan.
Burada açıklanan yordamı da endojen SCs genişletilebilir ve ex vivo4farklı son zamanlarda tanıtılan organoid teknoloji yararlanır. SCs YAP kaynaklı endojen SCs mevcut değildir bile deneysel, biyolojik ya da hastalık koşullarında organoid oluşturan SCs oluşturabilir. Diğer programlama yordamları ile farkı, reversion canlı dokularda oluşan bir SC benzeri durum için sadece formu YAP tarafından öğretilir hücre plastisite tür karşılık, notu istiyorum. Reacquisition SC gibi özelliklerin doku onarım veya oncogenic harekete geçirmek5ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Birkaç Yetişkin dokuların homeostazı için gereksiz olmasına rağmen YAP ve/veya TAZ kesinlikle yeniden oluşturma işlemi, tümör büyüme ve in vitro1,6,7,8 somatik SCs genişlemesi için gereklidir ,9,10,11,12

<table><tbody><tr><td>10 mL steril şırınga</td><td>Işınlar</td><td>10LC</td><td></td></tr><tr><td>100 mm&nbsp; hücre süzgeci</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 mL steril konik tüpler</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu ultra düşük bağlantı plakaları</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>40 mm hücre süzgeçleri</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>48 kuyulu çok kuyulu plakalar</td><td>Corning</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>50 mL steril konik tüpler</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu çok kuyulu plakalar</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, tip I</td><td>Sigma</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>1705-041</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık neşterler</td><td>Swann-Morton</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DnaseI</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>doksisiklin hyclate</td><td>Sigma</td><td>D9891&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Etanol %100</td> <td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüpleri (süzgeç kapaklı)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-fare CD326 (Ep-CAM)</td><td>BioLegend</td><td>118208</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Ekle</td><td>&nbsp;#19780&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Negatif kontrol olarak kullanılan</td> <td>FUW-tetO-EGFP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84041</td> FUW-tetO-MCS</tr><tr><td></td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84008</td><td>negatif kontrol olarak kullanılır</td></tr><tr><td>FUW-tetO-wtYAP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84009</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-YAPS94A</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84010</td><td>negatif kontrol olarak kullanılır (transkripsiyonel olarak ölü YAP mutantı)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>heparin sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tampon çözeltisi (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>insan R-Spondin1 (Etiketi)</td><td>Sığır testislerinden Sino Biological</td><td>11083-H08H-5</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidaz</td><td>Sigma</td><td>H3506&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>K-14 antikoru</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Ab7800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>K-8 antikoru</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Ab14053&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>25030081</tr><tr><td>Lin (allofikosiyanin [APC] fare soy antikoru kokteyli)</td><td>BD Biosciences</td><td>51-9003632</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&reg; Büyüme Faktörü Azaltılmış Bodrum Membran Matrisi, Fenol Kırmızı İçermeyen</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-Asetilsistein</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T.Baker</td><td>0402</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>hücre dışı yapıştırıcı 10 cm tabaklar (steril polisirol petri kabı &oslash; 94)</td><td>ROLL</td><td>18248</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Euroclone</td><td>ECM4004XL</td><td></td></tr><tr><td>PE Hamster Anti-Fare CD61</td><td>BD Biosciences</td><td>553347</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Sıçan Anti-İnsan CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>551129</td><td></td></tr><tr><td>PE / Cy7 anti-fare / sıçan CD29 Antikor</td><td>BioLegend</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>Kalem / Strep (10.000 U / mL)</td> <td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan Kuyruğu Kollajen I (kaplama)</td> <td>Sigma</td><td>122-20</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan Kuyruğu Kollajen I 3D kültür için</td><td>Cultrex</td><td>3447-020-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant insan FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant insan Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant murin EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant murin FGF temel (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>SBTI (Tripsin inhibitörü Glisin max)</td> <td>Sigma</td><td>T6522 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris TABAN&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA %0,05</td> <td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth orta boy</td><td>Gibco</td><td>31220023</td><td></td></tr></tbody></table>

de novo somatik kök hücreleri tarafından yap/taz nesil

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Burada birincil farklılaşmış hücreler ve çevirmek onları içine kök/progenitor hücreler (SCs) transkripsiyon faktörü geçici ifade tarafından aynı soydan YAP izole etmek için protokolleri mevcut. Bu yöntemle, moleküler ve fonksiyonel özelliklerini meme SCs. YAP sorun da tam ayrıştırılan döner pankreas ekzokrin hücrelere Pankreatik kanal benzeri oluşturan hücrelere luminal farklılaştırılmış (LD) hücreler fare meme bezinin dönüştürülür ataları. YSCs kalıtsal bir kendi kendini yenileyerek SC gibi devlet ile donatılmış olan gibi benzer şekilde, endojen, doğal SCs için YAP kaynaklı kök benzeri hücreler ("ySCs") sonunda organoid kültürler uzun vadeli in vitro Ektopik YAP/TAZ, daha fazla ihtiyacı olmadan olarak genişletilebilir.
Burada sunulan programlama yordamı oluşturmak ve vitro progenitör hücre farklılaştırılmış hücrelerden başlayarak çeşitli doku kaynaklarının genişletmek imkanı sunuyor. Somatik hücre ex vivo basit genişlemesi rejeneratif tıp, anlayış mekanizmaları tümör inisiyasyon ve daha fazlası için genel olarak, hücre ve gelişim biyolojisi çalışmaları için etkiler.

YMaSCs nesil Şekil 1A' deneysel strateji birincil meme LD hücreleri YAP geçici ifade tarafından yeniden programlamak için genel bir bakış sunulmaktadır. Birincil meme LD epitel hücreleri floresan aktif hücre tarafından13sıralama saf. Şekil 1B temsil eden üç ayrı altgrupları elde etmek için normal bir sıralama yordama: Bazal hücreler (EpCAMdüşükCD49fyüksekCD61-), Luminal Dede (LP) hücreleri (EpCAMyüksekCD49fdüşükCD61+ ) ve LD hücreleri (EpCAMyüksekCD49fdüşükCD61-). Dikkatli üç altgrupları çoğunluğuna LD hücrelerin saf bir hazırlık yalıtmak için önemlidir, bu tam olarak ayırt ve tamamen büyüme koşullara (bakınız şekil 1 cpanel yaptı,) oluşturan meme bezi kolonisinde seribaşı zaman tutuklandı. Tersine, zaman eksojen YAP ifade etmek için indüklenen, kolayca tanınabilir yoğun epitel koloniler halinde % 5 membran matris süspansiyon kültürler (şekil 1 c) oluşturmak üzere Proliferasyona LD hücreleri başlar. Yeniden programlama, verimliliği tespit için tipik bir yaklaşık % 3 deneme, kolonileri başlangıçta membran matris süspansiyon kültürlerde (şekil 1 d) numaralı seribaşı tek hücre sayısı üzerinden sayılması tarafından attı. Programlanmış luminal hücreleri (yMaSCs) o zaman geçit birden fazla Lümen geliştirmek karmaşık organoid benzeri yapılar kendi kendini düzenleme ( şekil 1Adüzeninde) % 100 membran matris organoid kültür koşullara bakınız, içine olabilir ve Doksisiklin (Yani transgenik YAP ifade yokluğunda) yokluğunda bile dikkate değer kendini yenileme yeteneği görüntülemek (şekil 1E). Histolojik olarak, yMaSC elde edilen organoids Bazal tabaka (K14 pozitif) ekran, membran matris karşı karşıya ECM ve Lümen benzeri boşluklar organoid (şekil 1F) içinde karşı karşıya luminal Katmanı (K8 pozitif), yeniden düzenlendi. Bu mimari bu yerel MaSCs (şekil 1F) tarafından kurulan organoids dan ayırt edilemez olduğunu.
YDucts nesil Deneysel strateji birincil pankreas acini YAP geçici ifade tarafından yeniden programlamak için genel bir bakış şekil 2Asunulur. Tüm acinar kümeleri pankreas dokusunun toplu bir arada hafif ayrılma ve boyutu dışlama filtrasyon yoluyla tarafından izole edilmiştir. Tipik bir hazırlık şekil 2Biçinde sunulur. Yalıtım sonra acinar hücre kümeleri yok kirlenme endokrin Langerhans adacıkları veya pankreas duktal ağaç ve tek hücrelere en az ayrılma parçaları ile homojen boyutta ekzokrin acinar birimlerinin bir süspansiyon olarak görünmelidir. Kirlenme endokrin adacıkları veya duktal parçaları eksik Seçici Filtrasyon (Adım 2.1.10), büyük olasılıkla sert işleme nedeniyle bir göstergesidir; Tek Kişilik hücrelere acinar kümelerinin istenmeyen ayrılma aşırı collagenase tedavi veya tamponsuz etkinliğini proteolitik enzimler tarafından ek SBTI tedavi sınırlama doku tarafından yayımlanan nedeniyle olabilir.
Tipik bir acinar programlama deney şekil 2Ciçinde sunulur; 3D kollajen kültüründe 5-7 gün içinde-hidrojel Doksisiklin huzurunda dayalı, pankreas acini R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A fareler kolayca elde açmak kanalı gibi kümeler halinde ( yDuctsadını verdik ki), oluşan ince bir monolayer epitel hücrelerinin genişleyen bir merkez kavite çoğalırlar. Tipik bir deneme için % 70 civarındadır, programlama verimliliği numaralı seribaşı acini (şekil 2B) toplam sayısı üzerinden kanal benzeri küme sayısı puanlama tarafından kolayca ölçülebilir. Negatif kontrol hücreleri, yani R26-rtTAM2 / + Doksisiklin, hücreleri veya R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A hücreleri sola kaçınılmaz kalır daha önce bildirilen bu koşullarda kültür,1 sonrası Mitotik acinar kümeleri ,14,15. Programlanmış yDucts sonra passaged tek hücre düzeyinde Matrigel tabanlı organoid kültür koşulları16 (bkz. şekil 2Adüzeninde) olağanüstü kendini yenileme yeteneği bile Doksisiklin (Yani yokluğunda görüntüleme transgenik YAP ifade yokluğunda) (şekil 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Şekil 1: Birincil meme LD izolasyon hücreler ve meme indüksiyon kök hücre. (A) deneysel işlemin şematik gösterimi kabul birincil meme LD hücreleri yeniden programlamak için. LD hücreleri arındırmak için (B) temsilcisi FACS-araziler tipik bir sıralama yordam gösteren. i) Disosiye hücreleri canlı hücreler (P1; mavi) için ileriye doğru ve yan dağılım göre geçişli II) nüfus P1 sonra daha fazla kapı onun Lin tercihe göre: Lineage pozitif hematopoetik hücrelerin; hariç subpopulation Lineage negatif hücre (P2; gri) seçilir III) nüfus P2 sonra içine bir EpCAMyüksek (P3; sarı + yeşil) ve bir EpCAMdüşük (P6; kırmızı) altgrupları ayrılmaktadır; IV) P3 ve P6 o zaman daha fazla kapı onların CD61/CD49f tercihe göre üç altgrupları: EpCAMdüşükCD49fyüksekCD61- Bazal hücreler (P7; kırmızı), EpCAMyüksekCD49fdüşükCD61+ LP hücreleri (P8; sarı) ve EpCAMyüksekCD49fdüşükCD61- LD hücreleri (P9; yeşil). (C) meme kolonileri meme koloniyi ortamda tohum sonra 15 gün oluşturmak için yetenek belirtilen yapıları ile enfekte LD hücrelerinin açıklayıcı görüntülerdir. Sadece YAP ifade hücreleri dönüşte koloni oluşturan hücreleri, (EGFP-enfekte) negatif kontrol hücreleri, ancak kalır tek hücreler olarak büyüme tutuklandı. Ölçek çubuğu 50 mikron =. (D) miktar yeteneği olduğu gibi (C) belirtilen hücre oluşturan Colony. Verileri ortalama + SD sunulmaktadır ve beş bağımsız deneyler, her altı teknik çoğaltır ile temsilcisi. (E) temsili resim YAP yeniden programlanan meme kök hücre benzeri hücre (yMaSCs) organoid kültür koşullarda taze üç boyutlu % 100 membran matris hidrojel yokluğunda Doksisiklin içine 12 gün sonra. Ölçek çubuğu 100 mikron =. (F) temsilcisi ayirt görüntüleri için Bazal işaretçiyi K14 (yeşil) ve luminal marker K8 (kırmızı) organoids organoid kültür koşullar içine 12 gün sonra belirtilen hücrelerden türetilmiş. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Bu rakam Panciera vd., 20161' den yeniden oluşturulur. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Resim 2 : Yalıtım birincil pankreas acinar hücreleri ve pankreas ataları indüksiyon. (A) deneysel işlemin şematik gösterimi kabul birincil pankreas ekzokrin acinar hücreleri yeniden programlamak için. (B) temsilcisi görüntü yalıtım yordamı (Adım 2.1.14) hemen sonra birincil pankreas acini. Acinar hazırlık tek hücreleri en az varlığı ile acinar kümeleri, homojen bir süspansiyon görünmesi gerekir. Ölçek çubuğu 400 mikron =. (C) birincil pankreas acini temsilcisi görüntüleri elde edilen R26-rtTAM2 (üst panelleri)veya R26-rtTAM2; tetO YAPS127A (alt paneller) fareler ve 3-b kolajen kültürlü-5 gün ile ya da ezelî hidrojel dayalı Doksisiklin (şırfıntı) belirtildiği gibi. Yalnızca birincil acini YAP ifade kist benzeri organoid Doksisiklin eklenmesinden sonra büyüyen hücreler için dönüştürün. Ölçek çubukları 70 mikron =. (D) miktar pankreas acini yeteneği transgenik YAP overexpression (C) olduğu gibi üzerine duktal organoids oluşturmak için. Verileri ortalama + SD sunulmaktadır ve dört teknik çoğaltır ile gerçekleştirilen beş bağımsız deneyler temsilcisi. (E) temsili resim YAP reprogramed duktal benzeri hücre (yDucts) üç pasajlar taze üç boyutlu % 100 membran matris hidrojel Doksisiklin yokluğunda sonra. Ölçek çubuğu 130 μm kalınlığında =. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Birincil meme hücre izolasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çözüm şelat Ca2 +</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>%0,02 w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollajen ben çözüm kaplama</td>
		</tr>
<tr>
<td>Asetik asit 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sıçan kuyruğu kollajen (kaplama)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase çözüm</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Ayrılma orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase hisse senedi çözüm</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hisse senedi çözüm collagenase ben</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemolitik çözüm</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl çözüm</td>
			<td>1 parçalar</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20.6 g/L</td>
			<td>9 parça</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.2 için ayarlamak</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase hisse senedi çözüm</td>
			<td>Filtre 0.2 µm, mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase sığır testisler (toz) üzerinden</td>
			<td>2.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodyum fosfat tampon 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl çözüm</td>
			<td>T. amb saklayın.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7.1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>7,65 pH ayarlama</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Çözüm sıralama</td>
			<td>Filtre 0.2 µm, mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>% 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Orta #1 yıkama</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Orta #2 yıkama</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meme 2D kültür orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">İndüksiyon ve yMaSCs Passaging</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Meme koloniyi orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (hemen önce tohum ekleyin)</td>
			<td>% 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Meme Organoid orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gelişmiş DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>İnsan kafa</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: yMaSCs nesil. Kompozisyon tüm farklı kültür medya ve yalıtım birincil meme LD hücre ve yMaSCs (Bölüm 1) indüksiyon için gerekli çözümleri
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Birincil pankreas acini yalıtım</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar kültür orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>% 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Deksametazon</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waymouth'ın orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar yıkama orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>% 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar kurtarma orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar kültür orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 30</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase ben çözüm A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar yıkama orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hisse senedi çözüm collagenase ben</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (fosfat tamponlu tuz)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hisse senedi çözüm collagenase ben</td>
			<td>Mağaza-20 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenase, türü ben (toz)</td>
			<td>6000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pankreas organoids passaging</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase ben çözüm B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hisse senedi çözüm collagenase ben</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pankreas Organoid orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gelişmiş DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrin</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>insan FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>İnsan kafa</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nikotinamid</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: yDucts nesil. Kompozisyon tüm farklı kültür medya ve yalıtım birincil acinar hücreleri ve indüksiyon ve yDucts (Bölüm 2.) passaging için gerekli çözümleri

Rejeneratif tıp için çok önemli olduğunu somatik SCs hastalığı modelleme ve SC özellikleri anlayış kazanmak için. Burada yeniden programlamak için deneysel stratejiler mevcut, içinde vitro, yetişkin hücreler karşılık gelen Genişletilebilir doku özgü kök/progenitor hücreler tek transkripsiyon co aktivatörü YAP geçici ifade tarafından ayrıştırılan.

De Novo Somatik kök hücreleri tarafından YAP/TAZ nesil

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Bu prosedürün genel amacı, transkripsiyon faktörü YAP'ın geçici ekspresyonu ile birincil farklılaşmış hücreleri aynı soyun progenitör hücrelerine dönüştürmektir. Bu yeniden programlama prosedürü, endojen kök hücrelerin nadir veya tanımlanması zor olduğu durumlarda bile, farklılaşmış muadillerinden başlayarak çeşitli dokuların in vitro progenitör benzeri veya kök benzeri hücreleri üretme imkanı sunar. Buradaki somatik hücreleri ex vivo olarak genişletme olasılığı, kanser ve hücre dokusu ile de ilgili olan hücre plastisitesi mekanizmalarını anlamak ve biyoloji çalışmalarının geliştirilmesi için rejeneratif tıp için çıkarımlara sahiptir.Bu prosedür, mevcut yeniden programlama alanında bir kara kutuyu dolduruyor, çünkü embriyonik kök hücrelerin farklılaşması yoluyla özel hücreler yapmayı değil, farklılaşmış hücrelerden dokuya özgü kök hücreler yapmayı hedefliyoruz. Metin protokolüne göre 10 dişi fareyi sakrifiye ettikten sonra, karın derisi boyunca y şeklinde bir kesi yaparak meme bezlerini inceleyin. Ardından, bezleri hafifçe çekerek peritondan dikkatlice ayırmak için dumont forseps kullanın.Diseke bezleri 10 mililitre buz gibi HBSS+PS ile hücre dışı yapışkan bir kaba yerleştirin. Bir doku kültürü başlığı altında, her bezi bir kez yıkamak için 10 mililitre taze HBSS + PS kullanın ve bunları boş bir hücre dışı yapışkan kaba yerleştirin. Ardından, bezleri bir milimetre küp parçalara ince bir şekilde doğramak için iki steril neşter kullanın.Verimli hücre izolasyonu için bezlerin uygun şekilde kıyılması şarttır. 20 bezi bir araya getirin ve optimum hücre canlılığı için bu adımı üç ila beş dakika içinde gerçekleştirmeye çalışın. 25 mililitrelik bir serolojik pipet ve 10 mililitrelik ayrışma ortamı kullanarak, kıyılmış dokuyu her bir tabaktan geri kazanın ve doku kümelerini ayırmak için süspansiyonu 50 mililitrelik bir konik tüp pipetleme alanına en az beş kez aktarın.Dokuyu 37 santigrat derecede bir saat boyunca sürekli kuvvetli çalkalama ile inkübe edin. Daha sonra sindirilmiş dokuyu oda sıcaklığında 400 kez g sıcaklıkta beş dakika boyunca döndürün. Süpernatanı attıktan sonra, dokuyu yeniden süspanse etmek ve üç dakika boyunca buz üzerinde inkübe etmek için üç mililitre hemolitik çözelti kullanın.Daha sonra, 10 mililitre yıkama ortamı bir numara ile hücreleri yıkayın. Sindirilmiş dokuyu döndürdükten ve süpernatanı attıktan sonra, doku peletini 10 mililitre iki numaralı yıkama ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri 10 santimetrelik doku kültürü kaplarında kaplayın. Daha sonra bulaşıkları bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik bir tüpe geri kazanın ve tüpü beş dakika boyunca 400 kez g'de döndürün. Ardından, peleti yeniden süspanse etmek için 10 mililitre kalsiyum şelatlama çözeltisi kullanın. Santrifüjlemeyi takiben ve yıkamayı tekrarladıktan sonra, peleti beş mililitre% 0.25 tripsin-EDTA içinde yeniden süspanse edin.Numuneyi inkübe ettikten sonra, tripsin çözeltisinin üzerine bir mililitre DNaz başına bir mikrogram ile desteklenmiş beş mililitre dispas çözeltisi ekleyin. Kümeleri ayırmak için, en az beş kez yukarı ve aşağı pipetlemek için bir mililitrelik bir pipet ucu kullanın ve numuneyi her üç dakikada bir sallayarak 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İki numaralı 10 mililitre yıkama ortamı ekleyin ve çözeltiyi 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe süzün.Ardından hücre süspansiyonunu aşağı doğru döndürün. FACS ile hücre saflaştırması yapmak için, her bir peleti yeniden süspanse etmek için 200 mikrolitre yıkama ortamı kullanın. Daha sonra 44,5 mikrolitre antikor karışımı ekleyin, iyice pipetleyin ve numuneyi karanlıkta buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.Hücre süspansiyonunu 10 mililitre bir numaralı yıkama ortamında seyreltin ve numuneyi aşağı doğru döndürün. Hücre peletini iki mililitre ayırma çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve hücre popülasyonlarının FACS ayrılmasına geçmeden önce bir kapak süzgeci FACS tüpünden süzün. FACS'tan geri kazanılan hücreleri yıkamak için bir numaralı yıkama solüsyonunu kullanın.Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletini yeniden süspanse etmek için meme 2D kültür ortamını kullanın ve kollajen ile muamele edilmiş bir plaka üzerinde oyuk başına 500 mikrolitre plaka kullanın. Lentiviral enfekte primer LD hücrelerinin doksisiklin indüksiyonundan yedi gün sonra, hücrelere %05 tripsin-EDTA oyuğu başına 150 mikrolitre ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler yıkandıktan ve sayıldıktan sonra, onları yeniden süspanse etmek için mililitre doksisiklin başına iki mikrogram ile takviye edilmiş hafıza kolonisi ortamı kullanın.Daha sonra, koloniler gibi YAP eksprese eden maskeyi kültürlemek için 24 kuyulu ultra düşük bağlantı plakasında kuyu başına 1.000 hücre tohumlayın. Y maskelerini alt kültürlemek için, her bir numuneyi toplayın ve 10 ila bir hacim buz gibi soğuk HBSS ekleyin, ardından bazal membran matrisini çözündürmek için numuneleri bir saat buz üzerinde inkübe edin. Kolonileri döndürdükten sonra, hücreleri üç kez yıkamak için buz gibi soğuk HBSS kullanın.Daha sonra kolonilere %05 tripsin-EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için kolonileri bir P1000 pipet ucundan 10 kez geçirin. Daha sonra, kuyu başına 1.000 hücrelik bir kolonojenik yoğunlukta 24 kuyulu ultra düşük bağlantı plakasında doksisiklin içermeyen meme koloni ortamındaki hücreleri sayın ve yeniden tohumlayın.Üçüncü geçişten önce, kolonileri meme kolonisi ortamından geri kazanarak organoid kültür koşullarında y maske kolonilerini aktarın ve bunları yeniden süspanse etmek için %100 büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi kullanın. İnkübasyonun ardından, bazal membran matrisi katılaştığında, jelleri 500 mikrolitre meme organoid ortamı ile kaplayın. Her bir organoid örneğini toplayarak ve bunları bir saat boyunca buz üzerinde fazla miktarda HBSS'de inkübe ederek kültürleri geçirin.Daha sonra organoidleri üç kez yıkamak için buz gibi HBSS kullanın. Bu videoda daha önce gösterildiği gibi organoidleri tripsinize edin ve tek hücreli süspansiyonları %100 büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi damlasında yeniden tohumlayın, ardından jelleri kaplamak için 500 mikrolitre meme organoid ortamı kullanın. Sindirilmiş fare pankreas dokusunu metin protokolüne göre yıkadıktan sonra, sindirilmiş dokuyu dikkatlice yeniden süspanse etmek ve altı kuyulu bir doku kültürü plakasının iki oyuğu arasında bölmek için altı mililitre asiner geri kazanım ortamı kullanın.Bir stereomikroskop altında, asiner izolasyonun kalitesini dikkatlice değerlendirin ve sonunda mevcut olan büyük doku kümelerini çıkarın. Birincil pankreas asinisini tohumlamak için, hücre geri kazanımı için kümeleri iki saat inkübe ettikten sonra, asiner hücre süspansiyonunu konik bir tüpte toplayın ve numuneleri beş dakika boyunca 100 kez g ve 18 santigrat derecede santrifüjleyin. Asini'yi asiner kültür ortamında yeniden süspanse ettikten sonra, süspansiyonu eşit hacimde nötralize sıçan kuyruğu kollajeni bir çözelti ile seyreltin ve tüpleri buz üzerinde tutun.Dikkatlice ve hızlı bir şekilde karıştırın ve hücre süspansiyonunu kollajen yastığının üzerine 16 oyukta tohumlayın. Pankreas asinisinin en iyi şekilde tohumlanması için, kaplamadan önce tüm tüpleri buzda tutmak ve hızlı bir şekilde ilerlemek çok önemlidir, ancak aynı zamanda homojen bir kolajen matrisi oluşturmak için hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkatli pipetleme şarttır. Bir hidrojelin oluşmasına izin vermek için hücreleri 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.Daha sonra pankreas organoidlerini indüklemek için, kollajen hidrojellerini doksisiklin ile takviye edilmiş 500 mikrolitre asiner kültür ortamı ile kaplayın. Organoidleri alt kültüre almak için, kültür ortamını atın, hidrojelleri dikkatlice çıkarın ve bunları dört mililitre kollajenaz I çözeltisi B içeren konik tüplere aktarın, ardından tüpleri 37 santigrat derecede inkübe edin ve hücreleri döndürmeden önce 30 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalayın ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri tripsinize ettikten ve PBS süpernatantını çıkardıktan sonra, hücre peletini yeniden süspanse etmek ve süspansiyonu ultra düşük bağlantı plakalarına tohumlamak için buz gibi soğuk bazal membran matrisi kullanın.Plakaları 37 santigrat derecede 40 dakika inkübe ederek bazal membran matris hidrojelinin katılaşmasına izin verin ve ardından pankreas organoid ortamı ile kaplayın. yDucts, yedi ila 10 gün içinde kist benzeri organoidler olarak büyüyecektir. Primer meme LD epitel hücrelerinin burada gösterilen üç alt popülasyona dikkatli bir şekilde geçirilmesi, meme bezi kolonisi oluşturma koşullarında tohumlandığında tamamen farklılaşmış ve tamamen büyümesi durdurulmuş LD hücrelerinin saf bir preparatını izole etmek için gereklidir.Tersine, eksojen YAP'ı eksprese etmek için indüklendiğinde, LD hücreleri% 5'lik bazal membran matris süspansiyon kültürlerinde kolayca tanınabilir yoğun epitel kolonileri oluşturmak için çoğalmaya başlar. Bazal membran matris organoid kültür koşulları altında, yeniden programlanmış luminal hücreler, birden fazla lümen etrafında gelişen ve doksisiklin yokluğunda bile kendi kendini yenileyen karmaşık organoid benzeri yapılar halinde kendi kendini organize eder. Doksisiklin varlığında 3D kollajen I bazlı hidrojelde kültürden beş ila yedi gün sonra, farklılaşmış panrkreatik asini, genişleyen bir merkezi boşluk etrafında çoğalan ince bir tek epitel hücresi tabakasından oluşan kanal benzeri kümelere veya yDuct'lara kolayca dönüşür.Yeniden programlama verimliliği, toplam tohumlanmış asini sayısı üzerinden kanal benzeri kümelerin sayısı puanlanarak kolayca ölçülebilir. Yeniden programlanmış yDuct'lar daha sonra tek hücre seviyesinde, endojen YAP ekspresyonunun yokluğunda bile dikkate değer bir kendini yenileme yeteneği sergileyen matrigel bazlı organoid kültür koşullarına geçirilebilir. Ayrıntılı iki prosedürümüz var.Bunlardan biri, FACS saflaştırılmış hücrelerin lentiviral vektörler yoluyla yeniden programlanmasına izin verdi ve ikincisi, viral enfeksiyonu önleyen ve transgenik YAP ekspresyonundan yararlanan bir ikincisi. Meme hücrelerinin yeniden programlanmasını denerken, aşırı viral titre kullanımından kaçınmak önemlidir, çünkü bu, yeniden programlama verimliliği için zararlı olabilir. Tamamen transgenik strateji, primer pankreatik asini için uygundur, çünkü bunlar lentiviral enfeksiyona neredeyse hiç uygun değildir.Aynı zamanda, gen ekspresyonunun tip kontrolü için doksisikline bağımlı lentiviral vektörlerin aynı avantajını sunar. Burada gösterilen örneklere ek olarak, bu YAP yeniden programlama protokolünün, farklılaşmış nöronları çoğalan nöronlara dönüştürmek için başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, farklı yetişkin dokularından farklılaşmış hücre tiplerini karşılık gelen dokuya özgü kök hücrelere dönüştürmek için YAP'a bağlı bir yeniden programlamanın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.Bu prosedür, somatik kök salgı çalışması ve somatik kök hücrelerin in vitro olarak genişletilmesi için rejeneratif tıpla ilgili olabilecek somatik kök hücreler üretmek için bir araç sağlayarak mevcut yeniden programlama stratejilerini genişletir. Lütfen lentiviral preparatın işlenmesinin son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken güvenlik seviyesi olarak her zaman iki önlemin alınması gerektiğini göz önünde bulundurun.

de-novo-generation-of-somatic-stem-cells-by-yaptaz

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

OCT4 bir retrovirüs-aracılı ektopik ifadesi ile insan kaynaklı hücreler pluripotent kök (iPSCs) üretmek için bir yöntem olup, SOX2, KLF4 ve MYC tarif edilmektedir. GFP dayanarak insan iPSC koloniler tespit etmek pratik bir yolu da tartışılmaktadır.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Bu çalışma, somatik hücrelerin in vivo olarak teratom oluşumu olmadan pluripotentliğe doğru yeniden programlandığını göstermektedir. Yetişkin hepatositlerin artmış pluripotentliğe sahip hücrelere in vivo yeniden programlanmasını indüklemek için Yamanka faktörlerini kodlayan plazmid DNA'nın hidrodinamik kuyruk veni enjeksiyonunu kullandık.

İn vivo Yamanaka Faktörlerinin Aşırı İfadesi ile Yetişkin Somatik Hücrelerin Pluripotentliğe Yeniden Programlanması

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Primordial germ hücreleri (PGCs) ortak öncüleri sperm ve yumurta vardır. İnsan embriyonik PGCs pluripotent epiblast hücreleri sitokinler etkileşimleri aracılığıyla belirtilir. Burada, biz insan hücreleri transcriptomally embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotency indüklenen pluripotent kök hücreler, PGCs benzeyen inducing bir 13 günlük iletişim kuralı tanımlamak.

Pluripotent kök hücre üretimi insan ilkel Germ hücreli benzeri hücre Embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotent adlı indüklenen

Bu protokol, beyin hücresi tiplerinin çeşitliliğini ve hücresel organizasyonun birçok özelliğini korurken, dışsal büyüme faktörleri veya bazal membran matrisi olmadan basitleştirilmiş, düşük maliyetli bir şekilde beyin organoidleri üretmek için bir araç olarak oluşturulmuştur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Bu makale, bir lentiviral vektör ve bir 2D biyoreaktör aracılığıyla tek eksenli germe kullanarak Skleraxis'in kombine aşırı ekspresyonu ile iPSC'den türetilmiş mezenkimal stromal hücreler üreterek iTenositler üretme prosedürünü açıklamaktadır.

Kombine skleraksi aşırı ekspresyonu ve 2D tek eksenli gerilim yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı iTenositlerin üretilmesi

Keşfedin YAP kullanarak farklılaşmış hücreleri progenitör hücrelere yeniden programlama yöntemini. Bu teknik meme bezi ve pankreas dokularından somatik kök hücre üretimi için rejeneratif tıpta uygulama sağlar.

De Novo Somatik kök hücreleri tarafından YAP/TAZ nesil

Daha fazla video keşfet