Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Bu protokolün genel hedefleri, floresan mikroskobu ile tek hücre düzeyinde inflamatuar aktivasyonu incelemek ve bir laktat dehidrojenaz veya LDH salınım testi ile piroptoz sırasında lizizi ölçmektir. Bu yöntem, Kaspaz-1 aktivasyonunun nasıl düzenlendiği gibi inflamatuar alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajı, kullanıcının inflamatuar aktivasyon ve piroptoz yollarının birden fazla basamağını incelemesine izin vermesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma bilimcisi olan Andreas den Hartigh olacak. Ortamı, cam lameller üzerine ekilen LPS astarlı kemik iliği türevi makrofajlardan, kuyu başına beş mikromolar nigerisin ve beş milimolar glisin ile desteklenmiş 290 mikrolitre DMEM 5 ortamı ile değiştirerek başlayın. 24 oyuklu plakayı, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 60 dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun ve ilk 15 dakikadan sonra 10 mikrolitre 30X FAM-YVAD-FMK ekleyin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri kuyu başına bir mililitre soğuk PBS ile, yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve hücreleri 30 dakika boyunca oyuk başına 250 mikrolitre% 2 paraformaldehit ile ışıktan korunan buz üzerinde sabitleyin, hücreleri son beş dakika boyunca uygun bir floresan nükleer boya ile etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri gösterildiği gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın ve her slaytı yedi mikrolitre solma önleyici montaj ortamı ile yükleyin. Her slaytın üzerine bir lamel yerleştirin ve lamelleri oje ile kapatmadan önce montaj ortamının gece boyunca sertleşmesine izin verin.

Hücreleri floresan konfokal mikroskopi ile görüntülemek için, işlenmemiş kontrol slaytını mikroskop tablasına yerleştirin ve hücrelere manuel olarak odaklanın. Mikroskop arama tablosu ayarlarını kullanarak, tedavi edilmemiş hücrelerde pozitif prob lekelenmesi gözlenmeyene kadar ofseti ayarlayın. Daha sonra, nigerisin ile muamele edilmiş bir numune kullanarak, prob boyaması için hem pozitif hem de negatif olan hücreleri içeren bir alanı bulun ve prob kanalının görüntüleme düzlemini en yüksek pozitif boyama yoğunluğuna sahip düzleme ayarlayın.

Ardından, yoğunlaştırılmış çekirdeğe sahip hücrelerde odaklar görünene kadar kazancı ayarlayın ve toplam 100X büyütmede slayt başına rastgele seçilen beş alanın görüntülerini elde edin. Nijerya ile muamele edilen hücrelerin immünoflorokimyasal analizi için, prop etiketli hücreleri az önce gösterildiği gibi yıkayın ve hücreleri, ışıktan korunarak buz üzerinde 30 dakika boyunca oyuk başına 250 mikrolitre fiksasyon ve geçirgenlik çözeltisi içinde inkübe edin. Makrofajları taze yıkama tamponu ile üç kez daha yıkayın ve hücreleri, bir saat boyunca buz üzerinde bir saat boyunca bir C-terminal kaspaz alım alanı veya ASC içeren pitozis ile ilişkili leke benzeri bir proteine karşı 250 mikrolitre birincil antikor ile etiketleyin.

İnkübasyonun sonunda hücreleri yıkayın ve numuneleri 250 mikrolitre uygun floresan boya konjuge ikincil antikor ile buz üzerinde bir saat daha etiketleyin ve son beş dakika boyunca dört mikrolitre uygun bir floresan nükleer boyama boyası ekleyin. Hücreleri soğuk yıkama tamponunda üç kez yıkadıktan sonra, gösterildiği gibi yedi mikrolitre solma önleyici montaj ortamı ile lamellerin üzerine lameller monte edin ve makrofajları floresan konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. Bir LDH salınım testi yapmak için, her deney kuyucuğuna 10 mikromolar nigerisin ile takviye edilmiş 50 mikrolitre DMEM 5 ortamı ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 60 dakika boyunca spontan ve% 100 lizis kontrol kuyularına 50 mikrolitre DMEM 5 ekleyin.

30 dakika sonra,% 100 lizis kontrol kuyucuklarına 10 mikrolitre 10X lizis tamponu ekleyin ve diğer kuyucuklara 10 mikrolitre orta ekleyin. İnkübasyonun sonunda, plakayı santrifüjleyin ve her bir oyuktan 50 mikrolitre süpernatanı şeffaf, düz tabanlı plakaya aktarın. Daha sonra, karanlıkta 30 dakikalık bir inkübasyon için her bir oyuğa 50 mikrolitre taze çözülmüş ve hazırlanmış substrat ekleyin, sinyalin plaka okuyucunun algılama sınırını aşmayacağını doğrulamak için 15 dakika sonra plakayı kontrol edin.

İnkübasyonun sonunda, her bir oyuklu kuyucuğa 50 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin ve oyuk başına hücre lizis yüzdesinin hesaplanmasına izin vermek için OD490'ı uygun bir plaka okuyucuda ölçün. Nigerisine maruz kalan tip makrofajlar, perinükleer bölgede aktif Kaspaz-1 içeren bir ASC odağının oluşumunu gösterirken, bu hücrelerin piroptoz geçirdiğini gösterir. Kaspaz-111 eksikliği olan farelerden gelen makrofajlar da bir ASC odağı oluştururken, bu hücrelerin, FAM-YVAD-FMK boyamanın yokluğu ile gösterildiği gibi, bu odakla ilişkili herhangi bir aktif Kaspaz-1'i yoktur.

Bu hücrelerin çekirdekleri de yoğunlaşmamıştır, bu da piroptotik hücre ölümünün olmadığını gösterir. Ayrıca, yabani tip makrofajların büyük bir yüzdesi, kültür süpernatantlarının LDH salınım analizi ile ölçüldüğü gibi, nigerisine maruz kaldıktan sonra hücre ölümüne uğrarken, Kaspaz-1'de eksik olan makrofajlar LDH'yi süpernatana salmaz, bu da hücrelerin hala sağlam olduğunu gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan mikroskobu ile iltihap oluşumunu nasıl görselleştireceğinizi ve LDH salınımını ölçerek hücre lizis seviyesini nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedür, diğer inflamatuar uyaranların veya inflamamazom aktivasyonunu veya piroptozu değiştiren müdahalelerin kullanımı için değiştirilebilir.