Name: Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Öğrenin, Xenopus laevis kurbaga yavrularında optik tektum nöronlarından bütün hücre yama kelepçe kaydı yaparak sinir devrelerinin gelişimdeki bağlantı kalıplarını incelemeyi. Bu yöntem, gelişimsel nörobilimde nöron aktivitesini ve devre işlevini anlamak için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SBC COBRE 1P20GM121310-01 NIH grant tarafından desteklenen.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Wyoming Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Elektrofizyolojik kayıtlar da dahil olmak üzere tüm yordamları oda sıcaklığında yaklaşık 23 ° c yapılmaktadır Tüm yöntem tanımlamak burada tectal Kurbağa yavrularını gelişimsel sahne 42 ve (Neiuwkoop ve Faber15göre sahnelenen) 49 arasında neurons kaydetmek için optimize edilmiştir.
1. Vivo içinde hazırlık
<ol><li>İribaş anestezi.<ol>
<li>İribaş % 0,01 ile Steinberg'ın solüsyon içeren küçük bir Petri kabına yerleştirin MS-222 yaklaşık 5 min için. Not: Ortak bir balık ve amfibi anestezik MS-222 aka "Tricaine" dır. Kurbağa yavrularını mM Steinberg'ın çözümde yetiştirilir: 0.067 KCl, 0,034 Ca (NO3)2•4H2O, 0,083 MgSO4•7H2O, 5.8 NaCl, 4.9 HEPES.</li>
		<li>Adım 2 için devam etmeden önce derin anaesthetized (non-yanıt veren ve artık yüzme) iribaş olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anatomi/kayıt çanak yere batık silikon bloğu için imzalat iribaş güvenli.<ol>
<li>Harici kayıt solüsyon içeren bir diseksiyon/kayıt yemek anaesthetized kurbağa taşımak için tek kullanımlık transfer pipet kullanın (115 mM NaCl, KCl, 2 mM CaCl23 mM, 3 mM MgCl2, HEPES, glikoz; 1 mM 5 mM ayarlamak 7,25 kullanarak pH 10 N NaOH, Osmolarite 255 mOsm).<ol>
<li>Spontan kas en aza indirmek için twitches, asetilkolin reseptör engelleyici, tubocurarine (100 µM) harici çözüm için ekleyin. (Genellikle, bu bir 10 mM tubocurarine stokunun 100 µL harici çözüm 10 mL için eklemek için 200 µL pipet kullanarak yapılır).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Böcek iğne kullanarak, kurbağa, dorsal tarafta, silikon elastomer batık bir blok için güvenli (Sylgard 184 gibi Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız), hangi-var yapıştırılmış diseksiyon çanak yere. Not: Pimleri yerleşimini önemlidir: Proje göz beyin, afferent RGC akson impaling önlemek için yeterince Kaudal her iki tarafında yer onları ve optik tectum (şekil 1A) anterior beyin girin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Orta çizgi boyunca beyin fileto.<ol>
<li>Beyin net görebilmek için steril 25-G iğne kullanarak orta çizgi boyunca yüzeysel bir kesi yaparak beyni örten cilt kaldırın.</li>
		<li>İğne Nöral tüp içine yerleştirip hafifçe yukarı doğru (dorsally) öyle ki tüp dorsal kısmı temiz bir şekilde yere plaka sağlam (şekil 1B) bırakarak (parçalanmış) kesilir çekerek aynı orta çizgi ekseni boyunca beyin fileto. Not: Afferent duyusal girdiler tectum kat plaka girin çünkü Nöral tüp zemin plakası olduğu gibi bırakılması önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tectal nöronlar kapakları şeffaf ventrikül membran kaldırın.<ol>
<li>Kayıt çanak Elektrofizyoloji teçhizat taşımak ve bir kırık cam pipet ucu tectal nöron hücre organları örten ventrikül membran kaldırmak için kullanın. Ucunu hafifçe narin görev silecek arasında sürükleyerek kır.</li>
		<li>Pipet pipet yuvasına vida ve optik tectum micromanipulator üzerinden aşağı indir.</li>
		<li>Tectum uzak ventrikül membran soyma için kırık pipet kullanın. Not: Membran tüm tectum kaldırmak için gerekli değildir. küçük bir pencere yeterli ve nöronlar bol erişim sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde etmek. Not: Bu aşamadan itibaren Segev, et al. açıklandığı gibi fare beyin dilimleri tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları taşımaya benzer bir yaklaşımdır 16 (Şekil 1C).</li>
	<li>Retina yansıtılan ışık tüm alanı parıltısı tectal nöron yanıtlarını kaydetmek.<ol>
<li>Tüm alan flaş ışık retina proje için bir optik fiber kurbağa'nın göz bitişik yerleştirin. Optik fiber diğer ucunda bir LED ışık parlaklığı denetlenmesini sağlar bir değişken direnç doğrultusunda olduğunu. Tetikleyici LED Dijital çıkış ile amplifikatör. Bu şekilde, tüm alanı değişen şiddetlerde ışık yanıp söner olabilir (şekil 4A) kaydedildi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tüm beyin hazırlık
<ol><li>1.1-1,3 adımları gerçekleştirin. Not: Bu hazırlık için dış çözümde tubocurarine gereği yok.</li>
	<li>Beyin izole et.<ol>
<li>25-G iğne (Şekil 2A) arka beyin sever için kullanın.</li>
		<li>İribaş bütün beyninden izole etmek için hafifçe beyinde tüm yanal ve ventral bag doku ve sinir lifleri koparmaya Kaudal-için-rostral bir yön altında iğne çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beyin silikon elastomer bloğu için güvenli.<ol>
<li>Tamamen serbest geldiğinde, silikon elastomer bloğu için beyin yanında duvar ilanı olfaktör ampuller biri aracılığıyla bir PIN ve arka beyin (Şekil 2B) aracılığıyla başka bir PIN güvenli. Bu kayıt tectal nöronlar için en uygun yapılandırmadır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diseksiyon kapsamdan sabitlenmiş tüm beyin hazırlık Elektrofizyoloji teçhizat için içeren yemek taşımak. 1.4. adımda açıklandığı gibi bir kırık cam pipet kullanarak ventrikül membran kaldırın.</li>
	<li>İki kutuplu bir uyarıcı elektrot optik hemisferlerine (nerede her Eye'dan axon yolları orta çapraz) doğrudan RGC akson etkinleştirmek için yerleştirin.<ol>
<li>İki kutuplu uyarıcı elektrot rostral ve hemen hemen bitişiğinde, büyük orta ventrikül yerleştirin. Optik hemisferlerine hemen rostral büyük orta ventrikül (Şekil 2B) için yer alır.<ol>
<li>Böyle küçük bir göçük dokusunda oluşan yavaşça uyarıcı elektrot optik hemisferlerine indirin. İki kutuplu elektrot stimülasyon tam olarak kontrol edilebilir gücünü sağlayan bir darbe uyarıcı tarafından tahrik edilmektedir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segev, et al. tarafından açıklandığı gibi bütün hücre yama kelepçe kayıt (Şekil 2C) gerçekleştirmek 16
</li>
</ol>3. yatay beyin dilim hazırlık
<ol><li>2.1-2,3 adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>(Hangi vivo içinde karşılık gelen en dorsal dördüncü) en yanal dördüncü bir yüzünün bir optik tectum tüketim için jilet kullanın. # Bu parçayı şekil 3' teAgösterilen Kaudal rostral uçağa paralel yapılmıştır.</li>
	<li>Silikon elastomer ile dilimlenmiş tarafına beyin yeniden pin yukarı bakacak şekilde (somata ve neuropil doğrudan kayıt için erişilebilir böylece) ve silikon elastomer blok (şekil 3 uzak bakan beyin ventrikül yüzeyine yan B) böylece (İki kutuplu bir elektrot optik hemisferlerine üzerinde yerleştirilebilir).</li>
	<li>Segev, et al. açıklandığı gibi tüm cep telefonu yama kelepçe veya yerel dosyalanmış potansiyel kayıt (şekil 3C) yerine getirmek 16
</li>
</ol>

<ol><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).</li>
<li>Pratt, K. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s40139-015-0075-1">Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole.</a> Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).</li>
<li>Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+function+of+the+Xenopus+tadpole+retinotectal+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).</li>
<li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+regulation+of+voltage-gated+intrinsic+currents+in+the+developing+optic+tectum+of+the+Xenopus+tadpole%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole.</a> J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).</li>
<li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+transmission+in+a+developing+visual+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit.</a> J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).</li>
<li>Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+analysis+of+electrophysiological+diversity+of+Xenopus+visual+neurons+during+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity.</a> Elife. 4, 11351(2015).</li>
<li>Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+driven+regulation+of+intrinsic+neuronal+excitability+improves+stimulus+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo.</a> Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).</li>
<li>Wu, G., Malinow, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8875937">Cline H.T. of a central glutamatergic synapse.</a> Science. , 972-976 (1996).</li>
<li>Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory-evoked+spiking+behavior+emerges+via+an+experience-dependent+plasticity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism.</a> Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).</li>
<li>Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+transcription+of+BDNF+enhances+visual+acuity+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development.</a> Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).</li>
<li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705(2008).</li>
<li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+avoidance+in+Xenopus+tadpoles+is+correlated+with+the+maturation+of+visual+responses+in+the+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum.</a> J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li>
<li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+horizontal+brain+slice+preparation%3A+a+novel+approach+for+visualizing+and+recording+from+all+layers+of+the+tadpole+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum.</a> J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland. New York. (1994).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).</li>
<li>Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Relationships+Impact+Neuronal+Tuning+within+a+Phylogenetically+Ancient+Vertebrate+Brain+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure.</a> Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).</li>
<li>Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+and+inhibition+in+recurrent+networks+mediate+collision+avoidance+in+Xenopus+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles.</a> Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).</li>
<li>Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+to+see%3A+patterned+visual+activity+and+the+development+of+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function.</a> Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).</li>
<li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+integration+in+mesencephalic+trigeminal+neurons+in+Xenopus+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles.</a> J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada açıklanan tüm yöntemleri tectal Kurbağa yavrularını gelişimsel sahne 42 ve (Neiuwkoop ve Faber15göre sahnelenen) 49 arasında neurons kaydetmek için optimize edilmiştir. Sahne 42 ile Kurbağa yavrularını yeterince büyük ve yeterince gelişmiş böylece böcek pimleri beyin vivo kayıtları için ve tüm beyin diseksiyon taşımak için her iki tarafında yerleştirilebilir. Daha önceki aşamalarında, Kurbağa yavrularını aslında iki boyutlu olduğunda (Yani, düz), burada açıklanan yak...

Retinotectal devre amfibi görsel sisteminin önemli bileşenidir. Hangi onların aksonlar optik tectum nerede postsinaptik tectal nöronlar ile sinaptik bağlantıları oluşturmak için proje RGCs gözünde, oluşur. Xenopus iribaş retinotectal devre nöral devre oluşumu ve işlev eğitim için popüler bir gelişim modelidir. Bu kurbağa'nın retinotectal devrenin bir güçlü deneysel model1,2,3render birçok özniteliği vardır. Bir büyük öznitelik ve odağı bu makalenin tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar, içinde VIVO veya tüm beyin hazırlık kullanarak yürütmek için yeteneği var. Gerilim ve akım kayıt modları kelepçe destekler bir amplifikatör ile donatılmış bir Elektrofizyoloji sondaj platformu ile tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları bir nöron'ın Elektrofizyoloji yüksek çözünürlükte karakterize edilebilir izin verir. Sonuç olarak, tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar retinotectal devre oluşumu temel aşamaları boyunca geliştirme detaylı ve kapsamlı bir anlayış ve plastisite içsel4,5 hazırladık , 6 , 7 ve sinaptik8,9,10,11 özellikleri. Tüm cep telefonu yama kelepçe tectal nöron kayıtları birleştirerek, genlerin veya morpholinos bu nöronların12ve kurulan görsel kaçınma testi13 ile görsel destekli davranışını değerlendirmek için bir yöntem ilgi ifade yeteneği teşvik molekülleri, devre fonksiyon ve davranışı arasındaki bağlantıları tanımlaması.
Tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde veri çünkü genetik kalsiyum göstergesi GCaMP6, gibi daha yeni görüntüleme yaklaşımları kullanarak mümkün değildir yüksek çözümleme türü bulunmakla birlikte kalsiyum göstergeler kullanarak görüntüleme verir unutmamak gerekir Kalsiyum dynamics büyük popülasyonlarda nöronların arasında aynı anda, orada hayır doğrudan veya özel elektrik parametreleri somata delta Floresans ölçerek elde edilebilir ve gerilim bir yolu yoktur belirgin şekilde kelepçe ölçmek için nöron akım-gerilim ilişkileri. Açıkça bu ayrı iki yaklaşım, Elektrofizyolojik kayıtlar ve kalsiyum görüntüleme, üst üste güçlü sahip ve farklı veri oluşturmak. Bu nedenle, en iyi yaklaşım belirli deneysel soru ele alınmaktadır bağlıdır.
Burada, biz tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları bir vivo içinde hazırlık, tüm beyin hazırlık, kullanarak iribaş optik tectum nöronlar edinme için bizim yöntem tanımlamak ve daha yeni bir14 bizim laboratuarımızda geliştirildi tüm beyin hazırlık modifiye . Temsilcisi sonuçları bölümünde her hazırlık ve elde edilebilir veri farklı türde deneysel avantajları göstermektedir. Sınırları ve güçlü ipuçları sorun giderme, yanı sıra farklı ürünleri bir tartışma bölümünde dahil edilir.

<table><tbody><tr><td>Stemi Stereo 508</td><td>Zeiss</td><td>495009-0006-000&nbsp;</td><td>Diseksiyon mikroskobu</td></tr><tr><td>MS-222 "Tricane"</td><td>Finquel</td><td>ARF5G</td><td>Amfibi genel anestezik</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Stienberg çözeltisini ve harici çözeltiyi hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Stienberg çözeltisini ve harici çözeltiyi hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-1KG</td><td>Stienberg'in çözeltisini ve harici çözeltisini hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Kalsiyum nitrat tetrahidrat (Ca(NO3) ve boğa; 4H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124-500G</td><td>Stienberg'in çözeltisini hazırlamak için kullanılır&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat (MgSO4)</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Steinberg çözeltisini hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür (CaCl2)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>Harici kayıt çözeltisi hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür (MgCl2)</td><td>JT Baker</td><td>2444-01</td><td>Harici kayıt çözümü hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>D-glikoz Susuz</td><td>Mallinckrodt Kimyasalları</td><td>6066-04</td><td>Harici kayıt çözeltisi hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Tubokurarin hidroklorür pentahidrat</td><td>Sigma</td><td>T2379</td><td>Nikotinik asetilkolin reseptör antagonisti</td></tr><tr><td>Böcek Pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-10</td><td>0.1mm çaplı paslanmaz çelik pimler</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning</td><td>761028</td><td>Önceden tartılmış monomer ve kürleme maddesi kiti</td></tr><tr><td>Steril Polistiren Petri Kabı - 60x15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS4052</td><td>Küçük petri kapları</td></tr><tr><td>PrecisionGlide İğne 25Gx5 / 8 (.0.5mm X 16mm)</td> <td>BD</td><td>305122</td><td>Şırınga iğneleri</td></tr><tr><td>1mL Kayma Ucu Tüberkülin Şırıngası&nbsp;</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Tek kullanımlık, steril şırıngalar</td></tr><tr><td>Borosilikat pipet camı</td><td>Sutter Aleti</td><td>BF150-86-10HP</td><td>Pipet çekme makinesi kullanılarak istenen özelliklere çekildi</td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aletleri</td><td>P-97</td><td>Elektrofizyolojik kayıt için mikropipetler üretir</td></tr><tr><td>Kimwipes Kimtech mendil</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>Hassas Görev Tüy bırakmayan silecekler</td></tr><tr><td>Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>1-CV-7B</td><td>Akım kelepçesi ve gerilim kelepçesi headstage</td></tr><tr><td>MP-285 Masaüstü Kontrolörlü Motorlu Manipülatör</td><td>Sutter Aleti</td><td>MP-285/T</td><td>Elektrofizyoloji teçhizatında headstage kontrolü</td></tr><tr><td>Fiber Bağlantılı LED (Yeşil)</td><td>Thorlabs</td><td>M530F2</td><td>Yeşil LED ile eşleştirilmiş fiber optik kablo</td></tr><tr><td>Küme Bipolar Elektrot (25 & mikro; m çapı)</td> <td>FHC</td><td>30207</td><td>Bipolar uyarıcı elektrot</td></tr><tr><td>ISO-Flex Stimülatör</td><td>AMPI (İsrail) &nbsp;</td><td>Üreticiyle iletişime geçin</td><td>Esnek uyaran izolatörü</td></tr><tr><td>Axon Instruments 700B Multipatch Amplifikatör</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>2500-0157</td><td>Voltaj ve akım kelepçesi kaydı için amplifikatör&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1322A sayısallaştırıcı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>2500-135</td><td>Elektrofizyoloji kaydı için veri toplama sistemi</td></tr><tr><td>Axio Examiner.A1</td><td>Zeiss</td><td>491404-0001-000&nbsp;</td><td>Elektrofizyoloji için mikroskop</td></tr><tr><td>Micro-g Lab Masası</td><td>TMC</td><td>63-533</td><td>Elektrofizyoloji mikroskobu için hava masası</td></tr><tr><td>Inspiron 620 Windows 7 64-bit Dell D06D001 Bilgisayarlı Kişisel Masaüstü</td><td></td><td></td><td>Bilgisayar Elektrofizyoloji yazılımı</td></tr><tr><td>c2400 CCD kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>70826-5</td><td>Elektrofizyolojik görüntüleme için şarj bağlantılı cihaz kamerası</td></tr><tr><td>Saat 7 O'Clock Süper Platin Paslanmaz Tıraş Bıçağı</td><td>Gillette</td><td>CMM01049</td><td>Platin kaplı paslanmaz tıraş bıçakları</td></tr><tr><td>Transfer Pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Tek Kullanımlık Polietilen transfer pipetleri</td></tr></tbody></table>

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt xenopus laevis tectal nöronlar için iletişim kuralları

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Hangi formu synapses doğrudan üzerine nöronlarda optik tectum göz retina ganglion hücrelerinin (RGCs) oluşan Xenopus iribaş retinotectal devre nasıl sinir devreleri çalışma popüler modelidir kendini topla. Bütün taşıma yeteneği yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar ve RGC uyarılmış yanıt, ya da içinde vivo hücre veya tüm beyin hazırlık kullanarak büyük bir vücut, normal yatan mekanizmaları yüksek çözünürlüklü verilerin üretti ve anormal, devre oluşumu ve işlev. Burada nasıl vivo içinde hazırlık, özgün tüm beyin hazırlık gerçekleştirileceğini açıklar ve daha yakın zamanda yatay beyin dilim hazırlık tectal neurons tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde etmek için geliştirilmiştir. Her hazırlık benzersiz deneysel avantajları vardır. Vivo hazırlık tectal nöronlar doğrudan yanıt göz yansıtılan görsel uyaranlara karşı kayıt sağlayan. Tüm beyin hazırlık için son derece kontrollü bir şekilde var olmak harekete geçirmek RGC akson, ve yatay beyin dilim hazırlık kaydından tectum tüm katmanları arasında sağlar.

Tüm alan flaş ışık ışık uyarılmış yanıt-e doğru kaydetmek için elde edilen yanıt bireysel tectal neurons (şekil 4A) kaydedilir iken retina tahmin edilmektedir. Bu belirli iletişim kuralı her iki nöron (yanıt "On") açma ve 15 off dönüm ışığa tepki ölçmek için tasarlanmıştır daha sonra "Off yanıt." ölçmek için s Tectal nöronlar genellikle sağlam ve yanıt kapalı sergi (nöron gösterilen burada içinde kaydedilen gerilim kelepçe moduyla klempe 60mV...

Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Bu prosedürün genel amacı, gelişim sırasındaki bağlantı modelleri hakkında bilgi edinmek ve nihayetinde nöral devrelerin nasıl oluştuğunu ve işlev gördüğünü anlamak için kurbağa yavrusu optik tektumunun nöronlarından tüm hücre elektrofizyolojik kayıtlarını elde etmektir. Bu yöntem, nöronların gelişim süreci boyunca nasıl değiştiği ve devrelerin davranışa yol açmak için nasıl işlev gördüğü gibi sinirsel gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu preparatların temel avantajı, gelişmekte olan nöral devrelerin işlevi hakkında fikir vermek için optik tektum nöronlarının elektrofizyolojik kaydına izin vermeleridir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Zhenyu Lui olacak. Bir atık transfer pipeti kullanarak, anestezi uygulanmış kurbağa yavrusunu harici kayıt solüsyonu içeren bir diseksiyon kayıt kabına taşıyın. Anestezi uygulanmış kurbağa yavrusunu, diseksiyon kayıt kabının zeminindeki batık bir silikon bloğa sabitleyin.Beynin net bir şekilde görülebilmesi için, steril 25 gauge bir iğne kullanarak orta hat boyunca yüzeysel bir kesi yaparak beynin üzerindeki cildi çıkarın. İğneyi nöral tüpe sokarak ve taban plakasını sağlam bırakırken tüpün dorsal kısmı temiz bir şekilde kesilecek şekilde hafifçe yukarı doğru çekerek beyni aynı orta hat ekseni boyunca fileto haline getirin. Beyni izole etmek için önce arka beyni kesmek için 25 gauge bir iğne kullanın.Ardından, tüm lateral ve ventral bağ dokusunu ve sinir liflerini koparmak için iğneyi beynin altından kaudal-rostral yönde nazikçe geçirin. Daha sonra, koku alma ampullerinden birine bir pim ve arka beyinden başka bir pim yerleştirerek beyni bir silikon elastomer bloğuna sabitleyin. Bu, tektal nöronlardan kayıt için en uygun konfigürasyondur.Ardından, sabitlenmiş tüm beyin preparatını içeren çanağı diseksiyon dürbününden elektrofizyoloji teçhizatına taşıyın. Kırık bir cam pipet kullanarak ventriküler membranı çıkarın. RGC aksonlarını doğrudan aktive etmek için, dokuda küçük bir çukur oluşacak şekilde bipolar uyarıcı bir elektrotu optik kiazma üzerine nazikçe indirin.Bipolar uyarıcı elektrot rostral olmalı ve optik kiazmanın bulunduğu büyük orta ventriküle hemen hemen bitişik olmalıdır. Bipolar elektrot, stimülasyon gücünün hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlayan bir nabız stimülatörü tarafından tahrik edilir. Yatay beyin dilimini hazırlamak için, tüm beyin hazırlığı ile başlayın.Ardından, bir optik tektumun bir tarafının en yanal dörtte birini çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Bu kesim rostral kaudal düzleme paralel olarak yapılır. Daha sonra, beyni, dilimlenmiş tarafı yukarı bakacak şekilde silikon elastomerin yan tarafına yeniden sabitleyin, böylece somata ve nöropil'e kayıt için doğrudan erişilebilir ve beynin ventriküler yüzeyi silikon elastomer bloktan uzağa bakar, böylece bir bipolar elektrot optik kiazma üzerine yerleştirilebilir.Ardından tüm hücre yama kelepçesini veya yerel alan potansiyeli kaydını gerçekleştirin. İşte yatay bir beyin dilimi hazırlığının konfigürasyonunu gösteren şema. Uyarıcı elektrot optik kiazmada kalmasına rağmen, kayıt pipetinin artık yatay beyin dilimi hazırlığı tarafından açığa çıkan tüm tektal katmanlardaki hücrelere erişecek şekilde konumlandırıldığını unutmayın.Bu, tektumun yüzeysel tabakasında bulunan bir nörondan RGC ile uyarılmış bir yanıttır. Bu şekilde, nöropil boyunca kaydedilen alan potansiyelleri ve dönüştürülen akım kaynağı yoğunlukları görüntü grafiği ile gösterilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 10 dakika içinde yapılabilir ve tipik olarak üç veya dört saate kadar sürer.Bu videoyu izledikten sonra, tektal nöronların elektriksel özelliklerini ve bağlantılarını ölçmek için tüm hücre kayıtları için tüm beyin ve yatay beyin dilimi hazırlığının nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

preparations-protocols-for-whole-cell-patch-clamp-recording-xenopus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu Xenopus laevis oosit kelepçe kayıt yama için bir giriş olarak tasarlanmıştır. Vitellin membran, bir gigaohm mühür (gigaseal) oluşumu ve dış topoloji yama isteğe bağlı dönüşüm kapsar.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu video, düz montajlı bir fare retinasından elektrofizyolojik kayıt için tam hücre yama kelepçesi tekniğini göstermektedir. Retina içindeki yıldız patlaması amakrin hücrelerine (SAC'ler) yaklaşmak için elektrotlu ince bir cam pipet kullanılır. Bir conta oluşturduktan sonra, zarı yırtmak ve tüm hücre yama-kelepçe konfigürasyonunu oluşturmak için emme uygulanır. Son olarak, iyonların SAC sinaptik reseptörlerinden akışı konfigürasyon kullanılarak ölçülür.

Düz Montajlı Bir Fare Retinasından Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturma

Video, bir tam hücre yama akım kelepçesi kullanarak floresan proteini eksprese eden nöronal hücrelerin uyarılabilirliğini incelemek için bir yöntemi göstermektedir. Akım kelepçesi modunda, nöronal uyarılabilirliği gösteren aksiyon potansiyelleri üretilir.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kullanarak Floresan Nöronların Uyarılabilirliğinin İncelenmesi

Bu video, nöron ateşleme modellerini analiz etmek için tam hücre yama-klemp tekniklerini kullanarak omurilik dilimlerinin substantia gelatinosa (SG) nöronlarında elektrofizyolojik kayıtlar gerçekleştirme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, omuriliğin SG nöronlarındaki uyaranlara verilen sinirsel tepkilerin incelenmesine izin verir.

Bir omurilik diliminin substantia jelatinosa nöronunda tam hücre yama kelepçesi kaydı

Bu video, reobaz ve membran potansiyelini ölçmek için yama kelepçesi tekniği kullanılarak dorsal kök gangliyonlarındaki duyusal nöron uyarılabilirliğinin incelenmesini ve nöronların artımlı akım enjeksiyonlarına tepkilerini analiz etmeyi göstermektedir.

Sağlam Sıçan Dorsal Kök Gangliyonlarında Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kayıtları

Zebra balığı embriyolarının Mauthner nöronlar ve diğer reticulospinal hücrelerden yama kelepçe kayıt yoluyla elektriksel aktivitesini kaydetmek ve izlemek için sağlam bir beyin-omurilik hazırlık geliştirdik. Böylece, gelişmekte olan embriyo anahtar nöronlardan eksitatör ve inhibitör sinaptik akımları, voltaj-kapılı kanal aktivitesini ve aksiyon potansiyelleri kayıt edebiliyoruz.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Bu yazının tek hücre düzeyinde ve floresan etiketli nöronların eksitabilite nöronların yapısal bağlantı tanımlamak için utero elektroporasyon (İEÜ) kullanmak protokolleri sağlar. Histoloji dendritik ve aksonal projeksiyonlar karakterize etmek için kullanılır. Akut dilim tam hücreli kayıt eksitabilitesini araştırmak için kullanılır.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

Sıçan kauda epididimidlerinden primer dissosiye epitel hücrelerinin elektriksel özelliklerini ölçmek için hücre izolasyonunu ve tam hücreli yama klemp kayıtlarını birleştiren bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, primer epididimal epitel hücrelerinin işlevsel özelliklerinin araştırılmasına ve epididimin fizyolojik rolünün aydınlatılmasına izin verir.

Epididimden İzole Edilmiş Primer Epitelyal Hücrelerin Tüm Hücreli Yama-Kelepçesi Kayıtları

Öğrenin, Xenopus laevis kurbaga yavrularında optik tektum nöronlarından bütün hücre yama kelepçe kaydı yaparak sinir devrelerinin gelişimdeki bağlantı kalıplarını incelemeyi. Bu yöntem, gelişimsel nörobilimde nöron aktivitesini ve devre işlevini anlamak için değerli bilgiler sunar.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

Daha fazla video keşfet