Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları
15 Mart 2018
Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.
Bu prosedürün genel amacı, gelişim sırasındaki bağlantı modelleri hakkında bilgi edinmek ve nihayetinde nöral devrelerin nasıl oluştuğunu ve işlev gördüğünü anlamak için kurbağa yavrusu optik tektumunun nöronlarından tüm hücre elektrofizyolojik kayıtlarını elde etmektir. Bu yöntem, nöronların gelişim süreci boyunca nasıl değiştiği ve devrelerin davranışa yol açmak için nasıl işlev gördüğü gibi sinirsel gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu preparatların temel avantajı, gelişmekte olan nöral devrelerin işlevi hakkında fikir vermek için optik tektum nöronlarının elektrofizyolojik kaydına izin vermeleridir.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Zhenyu Lui olacak. Bir atık transfer pipeti kullanarak, anestezi uygulanmış kurbağa yavrusunu harici kayıt solüsyonu içeren bir diseksiyon kayıt kabına taşıyın. Anestezi uygulanmış kurbağa yavrusunu, diseksiyon kayıt kabının zeminindeki batık bir silikon bloğa sabitleyin.
Beynin net bir şekilde görülebilmesi için, steril 25 gauge bir iğne kullanarak orta hat boyunca yüzeysel bir kesi yaparak beynin üzerindeki cildi çıkarın. İğneyi nöral tüpe sokarak ve taban plakasını sağlam bırakırken tüpün dorsal kısmı temiz bir şekilde kesilecek şekilde hafifçe yukarı doğru çekerek beyni aynı orta hat ekseni boyunca fileto haline getirin. Beyni izole etmek için önce arka beyni kesmek için 25 gauge bir iğne kullanın.
Ardından, tüm lateral ve ventral bağ dokusunu ve sinir liflerini koparmak için iğneyi beynin altından kaudal-rostral yönde nazikçe geçirin. Daha sonra, koku alma ampullerinden birine bir pim ve arka beyinden başka bir pim yerleştirerek beyni bir silikon elastomer bloğuna sabitleyin. Bu, tektal nöronlardan kayıt için en uygun konfigürasyondur.
Ardından, sabitlenmiş tüm beyin preparatını içeren çanağı diseksiyon dürbününden elektrofizyoloji teçhizatına taşıyın. Kırık bir cam pipet kullanarak ventriküler membranı çıkarın. RGC aksonlarını doğrudan aktive etmek için, dokuda küçük bir çukur oluşacak şekilde bipolar uyarıcı bir elektrotu optik kiazma üzerine nazikçe indirin.
Bipolar uyarıcı elektrot rostral olmalı ve optik kiazmanın bulunduğu büyük orta ventriküle hemen hemen bitişik olmalıdır. Bipolar elektrot, stimülasyon gücünün hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlayan bir nabız stimülatörü tarafından tahrik edilir. Yatay beyin dilimini hazırlamak için, tüm beyin hazırlığı ile başlayın.
Ardından, bir optik tektumun bir tarafının en yanal dörtte birini çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Bu kesim rostral kaudal düzleme paralel olarak yapılır. Daha sonra, beyni, dilimlenmiş tarafı yukarı bakacak şekilde silikon elastomerin yan tarafına yeniden sabitleyin, böylece somata ve nöropil'e kayıt için doğrudan erişilebilir ve beynin ventriküler yüzeyi silikon elastomer bloktan uzağa bakar, böylece bir bipolar elektrot optik kiazma üzerine yerleştirilebilir.
Ardından tüm hücre yama kelepçesini veya yerel alan potansiyeli kaydını gerçekleştirin. İşte yatay bir beyin dilimi hazırlığının konfigürasyonunu gösteren şema. Uyarıcı elektrot optik kiazmada kalmasına rağmen, kayıt pipetinin artık yatay beyin dilimi hazırlığı tarafından açığa çıkan tüm tektal katmanlardaki hücrelere erişecek şekilde konumlandırıldığını unutmayın.
Bu, tektumun yüzeysel tabakasında bulunan bir nörondan RGC ile uyarılmış bir yanıttır. Bu şekilde, nöropil boyunca kaydedilen alan potansiyelleri ve dönüştürülen akım kaynağı yoğunlukları görüntü grafiği ile gösterilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 10 dakika içinde yapılabilir ve tipik olarak üç veya dört saate kadar sürer.
Bu videoyu izledikten sonra, tektal nöronların elektriksel özelliklerini ve bağlantılarını ölçmek için tüm hücre kayıtları için tüm beyin ve yatay beyin dilimi hazırlığının nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, Xenopus laevis iribaşlarında retinotektal devreyi incelemek için tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) kayıt tekniklerini araştırmaktadır. Farklı beyin preparatları kullanarak araştırma, iribaş optik tektumundaki nöronların gelişim sırasındaki bağlantı modellerini ve sinir devrelerinin genel işlevini anlamayı amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
- Nöral Devreler
Arka Plan
- Gelişmekte olan organizmalarda nöral devrelerin nasıl oluştuğunun ve işlediğinin araştırılması.
- Retinotektal devre, amfibilerde görsel işleme için kritik öneme sahiptir.
- Xenopus laevis iribaşları, nöral bağlantısallığın incelenmesi için değerli bir model teşkil eder.
- Tüm hücre kayıtları, nöronal aktivite hakkında ayrıntılı bilgiler sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Optik tectumdaki nöronlar arasındaki bağlantı modellerini anlamak.
- Nöronların gelişim boyunca nasıl değiştiğini analiz etmek.
- Sinir devrelerinin davranışa nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Elektrofizyolojik kayıtlar için tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) yöntemleri kullanılmıştır.
- Biyolojik model, optik tectum nöronlarını incelemek için diseke edilmiş iribaş beyinlerini içermektedir.
- Herhangi bir multiomik iş akışından bahsedilmemiştir.
- Belirli adımlar arasında iribaşın immobilize edilmesi, beynin izole edilmesi ve hedefli kayıtların gerçekleştirilmesi yer almaktadır.
- Yöntemler, genellikle birkaç saat süren, 10 dakikalık kritik bir zaman dilimi içinde kayıt yapılmasına olanak tanımaktadır.
Ana Sonuçlar
- Hazırlıklar, tectumdaki nöron aktivitesinin kaydedilmesini başarıyla kolaylaştırmıştır.
- Sinirsel bağlantıya işaret eden elektrofizyolojik değişiklikler gözlemlenmiştir.
- Sonuçlar, retinotektal devrenin fonksiyonel etkileri üzerine tartışmaları tetiklemiştir.
- Bulgular, gelişimsel sinir devrelerinin anlaşılmasına katkı sağlamaktadır.
Sonuçlar
- Bu araştırma, gelişmekte olan iribaş beyinlerinde nöral bağlantıların incelenmesi için etkili yöntemler sunmaktadır.
- Çalışma, gelişim sırasındaki nöral devre fonksiyonlarının anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Sonuçlar, amfibilerdeki nörolojik süreçlerin ve davranışların incelenmesi için daha geniş kapsamlı çıkarımlar sunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Xenopus laevis irbaçlarında uygulanan tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) kaydı, nöral devre oluşumu ve fonksiyonunun yüksek çözünürlükle sorgulanmasına olanak tanıyarak, gelişim sırasındaki sinaptik bağlantısallık ve nöronal uyarılabilirlik hakkında mekanistik içgörüler sağlar. Bu yaklaşım, optik tectum'da retinal ganglion hücrelerinin tetiklediği aktivite gibi tanımlanmış uyarılara verilen nöronal yanıtların doğrudan ölçülmesine izin vererek, sinirbilimdeki hedef doğrulamayı destekler. Yöntemin in vivo, tüm beyin ve yatay kesit preparasyonları arasındaki uyarlanabilirliği, nörogelişimsel hedeflerin preklinik risk azaltma süreçleri için tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği artırır.
Biyofarmasötik Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Duyusal girdilere verilen nöronal yanıtları nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar ve gelişmekte olan devrelerdeki fonksiyonel bağlantısallığı netleştirir.
- Operasyonel Değer: Nöronal aktivitenin doğrudan elektrofizyolojik okumaları aracılığıyla biyolojik risk azaltmayı destekler ve hedef etkileşimindeki belirsizliği giderir.
- Öngörücü Değer: Genetik veya farmakolojik perturbasyonları, tektal nöron eksitabilitesi ve sinaptik entegrasyondaki ölçülebilir değişikliklerle ilişkilendirerek portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Belirli stimülasyon-yanıt özelliklerine sahip, stabil ve kaydedilebilir nöronal preparatlar oluşturarak, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki bileşik taramalarına hazırlar.
- Kantitatif Çıktılar: Postsinaptik akımlar ve alan potansiyelleri gibi elektrofizyolojik ölçümler oluşturarak, doz-yanıt analizine ve bileşik etkisinin miktar tayinine olanak tanır.
- Platformun Yeniden Kullanımı: Horizontal beyin slice preparasyonu, tüm tektal tabakalardan kayıt yapılmasına izin vererek tekrarlanan deneysel oturumlar için verimliliği ve tutarlılığı artırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Devre yanlış bağlantılarını içeren bozukluklarla ilgili nörogelişimsel süreçleri modeller ve translasyonel biyobelirteç araştırmalarını destekler.
- Preklinik Süreklilik: Gelişimsel zaman noktaları boyunca nöronal fonksiyonun tutarlı bir şekilde kaydedilmesini sağlayarak keşif ve doğrulama aşıları arasında köprü kurar.
- Riski Ayarlanmış Kararlar: Elektrofizyolojik fenotiplere dayalı "devam/dur" kriterlerini destekleyerek, nörogelişimsel programlarda geç evre başarısızlık riskini azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, öncü bileşik optimizasyonu öncesinde nöronal hedeflerin fonksiyonel doğrulamasını sağlayarak erken keşif iş akışlarına entegre olur ve elde edilen sonuçlar hem hedef seçimini hem de mekanistik anlamayı bilgilendirir.
- Keşif Biyolojisi: Retinal ganglion hücresi akson stimülasyonu sonrası tektal nöronlardan uyarılmış yanıtları kaydederek hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: Yeniden üretilebilir tüm beyin ve kesit preparasyonları aracılığıyla analiz standardizasyonuna olanak tanır ve bileşik taraması için ölçülebilir elektrofizyolojik çıktılar sağlar.
- Analitikler: Akım genlikleri ve latans gibi kantitatif bağımlı değişken ölçümleri sunarak deneysel koşullar arası karşılaştırmayı kolaylaştırır.
- Translasyonel Araştırma: Preparasyonlar boyunca hastalıkla ilişkili devre özelliklerini koruyarak preklinik geçerlilikle bağlantı kurar ve biyobelirteç uyumunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla deneysel bağlama uyarlanabilen, yeniden kullanılabilir bir elektrofizyolojik platform oluşturarak gereksiz yöntem geliştirme süreçlerini azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Doğrudan nöronal kayıt yoluyla mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: in vivo, tüm beyin ve dilim yöntemleri için tanımlanmış hazırlık protokolleri aracılığıyla laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Etkisiz bileşiklerin erken tespitini sağlayarak sermaye verimliliğini artırır ve uygulanabilir olmayan hedeflere yapılan yatırımı azaltır.
- Portföy Etkisi: Elektrofizyolojik sonuçları devre düzeyindeki fonksiyonla ilişkilendirerek riskten arındırılmış ilerleme kararlarına veri sağlar.
Uygulama Hususları
- Tutarlı beyin preparasyonu için elektrofizyoloji ve mikrocerrahi diseksiyon tekniklerinde uzmanlık gereklidir.
- Güvenilir uyarılmış yanıtlar için stabil hücre dışı kayıt çözeltilerine ve fonksiyonel stimülasyon ekipmanlarına bağımlıdır.
- Veri karşılaştırılabilirliğini sağlamak için stimülasyon parametrelerinin ve kayıt ayarlarının ekipler arası standartlaştırılması gereklidir.
- Model sistemler arası adaptasyon, beyin boyutuna ve erişilebilirliğine bağlı olarak diseksiyon ve plaka yöntemlerinde düzenlemeler gerektirebilir.
- Pratik kısıtlamalar arasında operatöre bağlı başarı oranları ve uzun kayıt seansları boyunca preparasyon stabilitesi yer almaktadır.
