Name: Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Öğrenin fare doku ekstrelerinde proteaz özgüllüğünü MALDI-TOF kitle spektrometresi ile belirleme yöntemini. Bu teknik çoklu örneklerin eş zamanlı analizini sağlayarak proteaz aktivitesi araştırmalarını hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser kısmen Nihon ilaç Üniversitesi Araştırma Bursu Nihon ilaç Üniversitesi (2016) ve MEXT KAKENHI Grant numarası JP17854179 tarafından desteklenmiştir.

Hayvan deneysel protokoller Nihon ilaç Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Nihon ilaç Üniversitesi kılavuzlarınıza uygun olarak yürüttü. Protokol doku özleri ICR fareler türetilmiş için ayarlandı. ICR fareler Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japonya) satın alınan
1. Iminobiotin etiketli substrat hazırlanması
9-fluorenylmethyloxycarbonyl grubu (Fmoc) kullanarak katı fazlı sentez substrat uğrar-11açıklandığı gibi amino asitler korumalı. Tablo 2 , istenen amino asit ve sentez aşamasına bağlı olarak kullanılan Fmoc bileşik belirlemek için kullanın.
<ol><li>Fmoc-NH-SAL reçine 0.2 g N, N-dimethylformamide (DMF) bir sentez sütunda 10 mL ile açgözlü.</li>
	<li>5 mL % 30 Piperodin DMF içinde ekleyin. Fmoc-grup ayırmak için 10 dakika için çözüm rock.</li>
	<li>
Kontrol Fmoc bölünme trinitrobenzenesulfonic asit (TNBS) ile test12: TNBS DMF ve diisopropylethylamine (DIPEA) 10 x 75 mm2 cam tüp sonra cam reçine az miktarda aktarmak için 10 µL eklemek 10 µL % 1'lik tüp. Fmoc i ciddi reçine turuncu renk geliştirmeniz gerekir.
	<ol>
<li>Bu sonuç olumsuz ise 1.2-1.3 adımları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reçine üç kez DMF 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>
5 mL Fmoc bahçedeki 0,3 mmol içeren DMF de tablo 2'de (Etap 1 kullanılan bileşik ile başlayan), O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), 1-0,3 mmol 0,3 mmol listelenen Ekle Hidroksi-1H-benzotriazol, monohidrat (HOBt) ve diisopropylethylamine (DIPEA) 0.6 mmol. Reçine ile çift 30 dk için çözüm rock.
	<ol>
<li>Bu adım TNBS testi ile kontrol edin. Sonuç pozitif çıkarsa, bu tepki değil yeterince ilerlemiştir ve bu adımı tekrarlanması gerekir anlamına gelir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reçine üç kez DMF 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Uzama tepki adımları yineleyerek 1.2-1.6, değiştirme Tablo 2göre 1.5 adımda kullandığınız Fmoc bileşik yineleyin.</li>
	<li>% 2.5 su, 1 mL ekleyin %1 triisopropylsilane (TIS) ve % 2.5 ethanedithiol (EDT) trifluoroacetic asit peptidlerin reçine ve koruma grupları ayırmak için. Rock 60 dk için çözüm.</li>
	<li>Filtre ve filtrate 50 mL tüp içinde toplamak.</li>
	<li>40 mL soğuk dietil etanol ve mağaza gecede-20 ° C'de ekleyin</li>
	<li>-20 ° C'de 30 dakika süreyle santrifüj 4.000 x g Pelet toplamak.</li>
	<li>3 h için bir desiccator dietil eter kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>% 50 Asetonitril 1 mL su ekleyin ve ham peptidler geçiyoruz. Trifluoroacetic asit kaldırmak için çözüm lyophilize. Bu adımı birkaç kez yineleyin.</li>
	<li>
C18 kartuş sütun kullanarak peptidler arındırmak.
	<ol>
<li>3 mL Asetonitril (ACN) kullanarak C18 kartuş sütunundaki reçine etkinleştirin.</li>
		<li>5 mL %5 ACN, % 0,1 TFA H2O. ile equilibrate</li>
		<li>Ham sentetik peptidler C18 kartuş sütuna yerleştirin.</li>
		<li>10 mL %5 ACN, % 0,1 TFA H2o yıkayın</li>
		<li>%60 3 mL örnekleriyle elute ACN, % 0,1 TFA H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Peptidler MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanarak kendi moleküler ağırlığı ölçerek kontrol edin.
	<ol>
<li>Eluent bir hedef plaka üzerinde 1 µL pipet. Hemen % 0,1 trifluoroacetic asit % 50 Asetonitril doymuş α-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) çözüm ekleyin</li>
		<li>Karışımı air-drying tarafından kristalize.</li>
		<li>Araç üreticisinin protokolüne göre örneklerin kitle spectra elde etmek.<ol>
<li>El ile ayarlamak için olumlu bir MALDI-TOF Kütle Spektrometre modu yansıtmak.</li>
			<li>CHCA kullanarak kütle spektrometre kalibre, bradikinin parçası 1-7 (monoisotopic molekül ağırlığı 756.3997 Da =) ve Anjiyotensin II (monoisotopic molekül ağırlığı 1,045.5423 Da =).</li>
			<li>Sentetik peptidler kitle spectra alacak ve kuramsal moleküler ağırlığı ile karşılaştırarak değerlendirmek.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. doku özleri hazırlanması
<ol><li>Erkek ICR fareler bir isoflurane inhalasyon odasında anestezi ve anestezi derinliği ayak tutam ile doğrulayın. Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi.</li>
	<li>Makas kullanarak, cilt xiphoid süreci kadar uzanan aracılığıyla bir karın ensizyon olun.</li>
	<li>Diyafram kesin ve tüm akciğer doku toplamak. Doku küçük parçalar halinde kesin.</li>
	<li>Doku buz gibi 50 mM Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (pH 7,4) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Doku ve bir 12 x 75 mm2 cam tüp 100 mg dokuların aktarmak tartın.</li>
	<li>Ayıklama arabellek (50 mM Tris-arabellek, % 0,1 poli (oxyethylene) octylphenyl eter içeren pH 7.4,) 0.3 mL ekleyin.</li>
	<li>
Bir karıştırma homogenizer kullanarak akciğer doku örnekleri lunaparkçı.
	<ol>
<li>Buz üzerinde örnekleri ne yapıyorsun?</li>
		<li>Örnekleri için 30 20.000 rpm'de homojenize bir karıştırıcıda s. Tamamen homojen olduğu kadar bu adımı yineleyin. Not: sıcaklık artışı önlemek amacıyla sürekli olarak daha fazla 1 dakikadır homojenize değil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogenate 1000 µL 1,5 mL tüp ve santrifüj 10.000 x g 4 ° C'de, 5 min için transfer</li>
	<li>500 µL süpernatant ile yeni bir 1,5 mL plastik tüp aktarın.</li>
	<li>Örnek 10 µL protein konsantrasyonu, bicinchoninic asit (BCA) gibi yöntemler veya Coomassie parlak mavi (CBB) yöntemini kullanarak belirlemek için kullanın.</li>
	<li>Donma önlemek için örnekleri % 50 gliserol son bir konsantrasyon için % 80 gliserol ekleyin.</li>
	<li>-80 ° C'de örnekleri daha fazla kullanılmasını kadar saklayın.</li>
</ol>3. sindirim yüzeylerde modeli proteaz ve doku ayıklar
<ol><li>
0.1 µg/µL N-tosyl-L-Fenilalanin chloromethyl keton (TPCK) 10 µL eklemek-tripsin, 0.1 µg/µL Staphylococcus aureus V8 proteaz veya 10 µg/µL doku özler bir sindirim arabellek 890 µL içine.
	<ol>
<li>Proteaz özgüllük bağlı olarak pH farkı açıklamak için pH 3, 5, 7 ve 9 ayarlanabilir arabelleklerini kullan. Sindirim arabellek bileşimi Tablo 3' te gösterilmiştir.</li>
		<li>Etkin olmayan proteaz doku özleri, 10 dakikadır kuluçka kaynar su (veya ısıtma 100 ° c) tarafından hazırlanan kullanarak bir negatif kontrol yerine getirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İminobiotin etiketli yüzeylerde 10 µL ekleyin (dimetil sülfoksit (DMSO), nihai toplama çözünmüş 100 pmol/10 µL =).</li>
	<li>37 ° C'de iminobiotin etiketli yüzeylerde sindirmek için 3 saat kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra yüzeylerde kaynar su ile (veya ısıtma 100 ° c) sindirim 10 dakikadır durdurmak.</li>
	<li>Sindirilir yüzeylerde, 10.000 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant yeni 1,5 mL tüp içine aktarın.</li>
</ol>4. Iminobiotin etiketli substrat saflaştırılması
<ol><li>
50 µL % 50 streptavidin sepharose boncuk 1 M Tris-tampon (pH 9) kapsayan %0,1 poly(oxyethylene) octylphenyl eter içinde ekleyin.
	<ol>
<li>Çözüm pH 9 olması için pH test kağıt kullanın. Çözüm pH düşükse, pH yaklaşık 9 1 M Tris-tampon (pH 9) kapsayan %0,1 poly(oxyethylene) octylphenyl eter ekleyerek ayarlayın. Bu adım önemlidir, iminobiotin etiketli substrat streptavidin için bağlama karıştırmak gibi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gecede 4 ° C'de sürekli nazik iminobiotin etiketli yüzeyler için streptavidin bağlamak için bir rotator tekerlek üzerinde karıştırma ile kuluçkaya. Boncuk kuluçka asılı kalması gerekir.</li>
	<li>10.000 x g 4 ° C'de, 1 dk santrifüj Süpernatant kaldırın.</li>
	<li>
Boncuk aşağıdaki gibi beş kez yıkama:
	<ol>
<li>Bir yıkama arabellek (50 mM Tris-tampon, pH 9) 1.000 µL boncuk için ekleyin.</li>
		<li>4 ° C'de sürekli nazik bir rotator tekerlek üzerinde karıştırma ile 10 dakika yıkayın. Boncuk kuluçka asılı kalması gerekir.</li>
		<li>10.000 x g 4 ° c de 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
100 µL % 0,2 trifluoroacetic asit için boncuk ekleyin.
	<ol>
<li>Çözüm pH 2 olması için pH test kağıt kullanın. Çözüm pH yüksek ise, için pH 2 aşağıda %1 trifluoroacetic asit ekleyerek ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sürekli nazik bir rotator tekerlek üzerinde karıştırma ile Oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>10.000 x g 4 ° c de 1 dk santrifüj kapasitesi, sonra yeni bir 1,5 mL tüp süpernatant transfer.</li>
</ol>5. örnek hazırlama ve matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma uçuş zaman kütle spektrometresi (MALDI-TOF Kütle spektrometresi)
Not: Aşağıdaki adımlarda tüm çözümleri ile yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) hazırlanmalıdır-sınıf veya amino asit sıralama-grade su.
<ol><li>Asetonitril etkinleştirmek için C18 reçine üzerine 500 µL pipet. Kullanılan Asetonitril kaldırın. Bu üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>C18 reçine 100 µL % 0,1 trifluoroacetic asit ile equilibrate. Eluent kaldırın. Bu üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Örnekleri yüklemek için bir pipet kullanarak reçine örnekleri bağlayın.</li>
	<li>Reçine 20 µL % 0,1 trifluoroacetic asit ile yıkayın. Bu beş kez tekrarlayın.</li>
	<li>Örnekleri 3 µL % 60 Asetonitril %0,1 trifluoroacetic asit ile elute. Eluent MALDI-TOF Kütle spektrometresi için hedef tabakta pipette. Hemen doymuş α-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) çözüm % 50 Asetonitril %0,1 trifluoroacetic asit ekleyin.</li>
	<li>Karışımı air-drying tarafından kristalize.</li>
	<li>
Araç üreticisinin protokolüne göre örneklerin kitle spectra elde etmek.
	<ol>
<li>El ile ayarlamak için olumlu bir MALDI-TOF Kütle Spektrometre modu yansıtmak.</li>
		<li>CHCA kullanarak kütle spektrometre kalibre, bradikinin parçası 1-7 (monoisotopic molekül ağırlığı 756.3997 Da =) ve Anjiyotensin II (monoisotopic molekül ağırlığı 1,045.5423 Da =).</li>
		<li>Örnekleri yakın kitle spectra 700 üzerinden 900 savcıya biotin etiketli yüzeylerde cleaved form için dikkat, kitle spectra elde etmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tablo 1kullanarak algılanan doruklarına tanımlayın. Uygun moleküler ağırlık tespiti C-terminus ilgili amino asit, bölünme gösterir.</li>
</ol>

<ol><li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+%28a+review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li>
<li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein%5BTitle%5D)+AND+%22Vopr+Med+Khim%22%5BJournal%5D)">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li>
<li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li>
<li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li>
<li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li>
<li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li>
<li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li>
<li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li>
<li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li>
<li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li>
<li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00897a025">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li>
<li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2%2C4%2C6-trinitrobenzenesulphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li>
<li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+NeutraLite+avidin%3A+A+non-glycosylated%2C+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li>
<li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Bu iletişim kuralı MALDI-TOF Kütle spektrometresi proteaz özgüllük doku özler elde edilen ham örneklerinde tanımlamak için kullanır ve kolayca birden çok örnek işleme için ölçekli. Özellikle, pH substrat özgüllüğü bir değişiklik neden manipüle.
Yaygın Biyokimya onun bağlama özgüllüğü nedeniyle kullanılmıştır, avidin-biotin karmaşık (ABC) yöntemi, bizim iletişim kuralında kullanılmıştır. ABC güçlü yakınlığı nedeniyle, avidin biotin için bağlama neredeyse tedavi edilemez. Benzeşme arıtma ABCs iç...

Proteaz proteinler fizyon tarafından fizyolojik süreçleri düzenleyen ve belirli zamanlarda ve yerlerde proteaz aktivitesinin başlangıcında düzenlenmiş1. Bu nedenle ifade ve yerel olarak düzenlenmiştir dokuların aktivite tanımlama ve proteaz algılamak için yeni bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Önerilen yöntem bu çalışma proteaz özgüllük proteaz tespit için paralel olarak tanımlamak amaçlamaktadır.
Proteaz özgüllük algılamak için bazı yöntemler vardır. Azocasein yönteminin kullanımı ile proteaz2 algılanması için iyi bilinen ama onun yetenek daha fazla bilgi almak için sınırlıdır. Zymography, proteaz3molekül ağırlığı belirlemek için kullanılan başka bir kapsamlı proteaz algılama yöntemi olmakla birlikte, substrat özgüllüğü incelemek için kullanılamaz. Proteaz özgüllük spektrometrik deneyleri, p-nitroanilide4gibi yüzeylerde kullanarak ve Fluorometrik deneyleri, coumarin yüzeylerde5 veya floresan rezonans enerji transferi (FRET) deneyleri6kullanarak tarafından belirlenebilir. Bu yöntemler tek bir kuyuda bulunan yüzeylerde tek-özgüllük algılanmasını etkinleştirin. Bu özler birden çok proteaz içeren çalışmanın, doku özleri proteaz özgüllük çeşitli koşullar altında incelenir. Proteaz aktivitesi pH, koenzimler, prostetik gruplar ve iyon gücü de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından düzenlenmiştir. Son zamanlarda, proteomik tabanlı yöntemleri proteaz özgüllük tanımlamak için kullanılmıştır; Örneğin, Biniossek ve arktarafından bildirilen yöntemi. 7 Proteom substrat özgüllüğü bile içinde ham özleri belirlemek için kullanır ve birden çok amino asit dizileri8tanımak proteaz bölünme etkinliğinin doğru belirlenmesi sağlar. Ancak, bu yöntem çok sayıda örnekleri analiz için uygun değildir. Buna ek olarak, bizim Yöntem birden çok örneği aynı anda işleme ve kullanım Matrix-Assisted Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma sağlar saat uçuş (MALDI-TOF) örnek analiz için kütle spektrometresi i ciddi, hızlı ve kolay algılama kolaylaştırır yüzeylerde.
Bu kağıt proteaz özgüllük benzersiz yüzeylerde molekül ağırlığı ölçmek için MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak değerlendirmek için bir yöntem özetliyor. Onların kuramsal moleküler ağırlıkları birlikte i ciddi yüzeylerde moleküler formları Şekil 1 ve Tablo 1' de gösterilmiştir. Önceki çalışmalarda polyglycine çubukları ve biotin9içeren yüzeylerde kullanılan; Ancak, polyglycine sıra glisin sıra tanımak enzimler tarafından i ciddi çünkü bu yüzeylerde hatalı. Ayrıca, yüksek afinite avidin ve biotin arasında düşük kurtarma oranı için neden olabilir. Polietilen glikol (PEG), iminobiotin ve bölünme sitesi (Şekil 1) teşhis edebilecek bir amino asit oluşan benzersiz bir substrat sentezlenmiş Bu çalışmada bu sakıncaları üzerine geliştirmek için. Benzer moleküler ağırlık amino asitler arasında ayırımcılık için D-serin PEG spacer ve amino asit cleaved sitesinde arasında eklendi.
N-terminal substrat, benzeşim arıtma ham örneklerinden sağlayan iminobiotin ile etiketli oldu. İminobiotin yerine biotin kullanımı önemlidir; biotin avidin avidin için iminobiotin'ın ilgi pH tarafından değiştirilebilir iken hangi biotin etiketli yüzeylerde avidin reçine, düşük oranda düşük kurtarma sonuçlar ile güçlü bir ilgi vardır. İminobiotin etiketli yüzeylerde pH 4 aşağıdaki koşullarda avidin bültenleri iken Iminobiotin etiketli yüzeylerde avidin pH 9, yukarıdaki koşullarda bağlayacaksınız. Bu nedenle, iminobiotin benzeşme arıtma10için kullanıldı. Özetle, biz proteaz özgüllük benzersiz yüzeylerde kullanarak tespit için detaylı bir protokol tanımlamak.

<table><tbody><tr><td>FMOC-NH-SAL Reçine (- [2,4-Dimetoksifenil-N- (9-florenilmetoksikarbonil) aminometil] fenoksi reçinesi)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00102</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamid (DMF)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00185</td><td></td></tr><tr><td>piperidin</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00176</td><td></td></tr><tr><td>trinitrobenzensülfonik asit (TNBS)</td> <td>WAKO Kimyasal</td><td>209-1483</td><td></td></tr><tr><td>O- (6-Kloro-1H-benzotriazol-1-il) -N, N, N ', tetrametiluronyum hekzaflorofosfat (HCTU)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00067</td><td></td></tr><tr><td>1-Hidroksi-1H-benzotriazol, monohidrat (HOBt)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00014</td><td></td></tr><tr><td>diizopropiletilamin (DIPEA)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00030</td><td></td></tr><tr><td>triizopropilsilan (TIS)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00170</td><td></td></tr><tr><td>ethanedithiol (EDT)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00057</td><td></td></tr><tr><td>trifloroasetik asit (TFA)</td><td>Millipore</td><td>S6612278 403</td><td></td></tr><tr><td>asetonitril</td><td>Kokusan Kimyasal</td><td>2153025</td><td></td></tr><tr><td>C18 kartuş sütunu</td><td>Sular</td><td>WAT051910</td><td></td></tr><tr><td>poli (oksietilen) oktilfenil eter</td><td>WAKO Chemical</td><td>168-11805</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>karıştırma homojenizatörü</td><td>Kinematica</td><td>PT3100</td><td>Polytron Homojenizatör</td></tr><tr><td>Coomassie Parlak Mavi (CBB) -G250</td><td>Nakarai Kimyasal</td><td>094-09</td><td></td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Nakarai Kimyasal</td><td>170-18</td><td></td></tr><tr><td>N-tosil-L-fenilalanin klorometil keton (TPCK)-tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>WAKO Kimyasal</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin sefaroz</td><td>GE Sağlık</td><td>17-511-01</td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-siyano-4-hidroksisinnamik asit (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF kütle spektrometresi</td><td>Bruker Daltonics, Almanya</td><td>autoflex</td><td></td></tr><tr><td>2-iminobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4632</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-amino asitler</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi maldi-tof kütle spektrometresi tarafından ayıklar: ph özgüllük değişiklikler neden manipüle

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteaz protein harekete geçirmek/inactivation ve gıda sindirimi de dahil olmak üzere birçok biyolojik fonksiyonları var. Proteaz özgüllük tanımlayan proteaz işlevi ifşa için önemlidir. Bu çalışmada önerilen yöntem matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kullanarak benzersiz yüzeylerde molekül ağırlığı ölçerek proteaz özgüllüğü belirler saat uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi. Cleaved site amino asitleri oluşur ve boşluk Ekleyici Polietilen glikol oluşur yüzeylerde iminobiotin, içerir. Cleaved substrat cleaved bir amino asit kullanarak benzersiz bir moleküler ağırlığı oluşturur. Bu yöntem yararları bu ham numuneleri kullanılarak bir tencereye yürütülen ve aynı zamanda birden fazla örnekleri değerlendirmek için uygundur biridir. Bu makalede, biz basit bir deneysel Yöntem doku çıkarma, sindirim yüzeylerde yerleşimini farklı pH koşullarında sindirim yüzeylerde arıtma örnekleri, içine dahil olmak üzere fare akciğer dokusundan elde örnekleri ile optimize tarif ve yüzeylerde moleküler ağırlık MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak ölçümü. Özet olarak, bu teknik proteaz özgüllük ham örneklerinde kolayca birden çok örnek işleme için ölçekli MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak doku özleri elde tanımlanması için izin verir.

Proteaz özgüllük modeli proteaz tarafından tanımlanması için yöntem değerlendirilmesi
Bu sistemin verimliliği TPCK-tripsin ve V8 proteaz olan substrat özelliklerine elde edilmiştir, kullanılarak değerlendirilmiştir. TPCK-tripsin ve V8 proteaz amino asit dizisi lizin ve arginin kalıntılarının C terminalinde ve carboxy yanında aspartik asit ve glutamik asit kalıntıları eklenmesi, sırasıyla ayırmak için tahmin edilmiştir. Tabl...

Burada, proteaz özgüllük ham fare doku belirlemek için bir protokol MALDI-TOF spektrometresi kullanılarak özleri mevcut.

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Bu deneyin genel amacı, çoklu ham ekstraktlarda proteaz özgüllüğünü belirlemektir. Bu yöntem, proteaz özgüllüğünü belirlemek için temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, parlay'da birden fazla numunenin proteaz özgüllüğünü tanımlayabilmesidir.Erkek ICR farelerinden elde edilen akciğer dokusu örneklerini buzda soğutun. Numuneleri bir karıştırıcıda 30 saniye boyunca 20.000 RMP'de homojenize edin. Numuneler tamamen homojen olana kadar bu adımı tekrarlayın.Sıcaklığın artmasını önlemek için sürekli olarak bir dakikadan fazla homojenize etmeyin. 1.000 mikrolitre homojenatı 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 10.000 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanın 500 mikrolitresini yeni bir 1.5 mililitrelik plastik tüpe aktarın.Protein konsantrasyonunu belirlemek için numunenin 10 mikrolitresini kullanın. Biskintoninik asit tahlili veya Bradford tahlili gibi yöntemleri kullanarak. Donmayı önlemek için, nihai %50gliserol konsantrasyonu için numunelere %80 gliserol ekleyin.pH'a bağlı olarak proteaz özgüllüğündeki farkı açıklığa kavuşturmak için pH üç, beş, yedi ve dokuza ayarlanmış sindirim tamponları kullanın. 890 mikrolitrelik bir sindirim tamponuna, mikrolitre başına 10 mikrolitre 0.1 mikrogram veya TPCK tripsin, mikrolitre başına 0.1 mikrogram staphylococcus aureus V8 proteaz veya mikrolitre doku özü başına 10 mikrogram ekleyin. Doku ekstraktlarında proteazı inkübasyon ve 10 dakika kaynar su ile inaktive ederek negatif kontroller hazırlayın.Daha sonra, numunelere 10 mikrolitre MNO biyotin etiket substratı ekleyin ve sindirmek için 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, substratların sindirimini 10 dakika kaynar su ile durdurun. Sindirilmiş substratları dört santigrat derecede 10.000 kez G'de beş dakika santrifüjleyin.Süpernatanı 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. % 0.1 polioksietilen oktil fenil eter içeren bir molar tris tamponuna 50 mililitre% 50 streptavidin sefaroz boncukları ekleyin. Çözeltinin pH dokuz civarında olduğundan emin olmak için pH test kağıdı kullanın.Uygun pH'ı dokuz veya daha fazlasına ayarlamak önemlidir. Amino biotin, pH dokuz veya daha yüksek olmadıkça bir boncuğu ısıramaz. Çözeltinin pH'ı düşükse, daha fazla tampon ekleyerek yaklaşık pH dokuza ayarlayın.Ek olarak, gerekirse pH'ı yükseltmek için bir molar tris tamponu eklenebilir. MNO biyotin etiketli substratları streptavidin'e bağlamak için bir döndürücü tekerlek üzerinde sürekli yumuşak karıştırma ile süspansiyonu gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Boncuklar inkübasyon boyunca asılı kalmalıdır.Ertesi gün, numuneleri dört santigrat derecede 10.000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, 1.000 mikrolitre yıkama tamponu ekleyerek boncukları yıkayın. Ardından, bir döndürücü üzerinde sürekli yumuşak karıştırma ile dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.Boncukları dört santigrat derecede 10.000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve bu yıkamayı dört kez tekrarlayın. Ardından, boncuklara 100 mikrolitre% 0.2 trifloroasetik asit ekleyin.Çözeltinin pH ikinin altında olduğundan emin olmak için pH test kağıdı kullanın. Çözeltinin pH'ı yüksekse,% 1 trifloroasetik asit ekleyerek pH'ı ikinin altına ayarlayın. Süspansiyonu, bir döndürme tekerleği üzerinde sürekli yumuşak karıştırma ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Boncukları daha önce olduğu gibi santrifüjledikten sonra, süpernatanı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Etkinleştirmek için bir C18 reçinesi üzerine 20 mikrolitre asetonitril pipetleyin. Kullanılmış asetonitril'i çıkarın ve bu aktivasyon adımını üç kez tekrarlayın.Ardından, C18 reçinesini 20 mikrolitre %0.1 trifloroasetik asit ile dengeleyin. Eluantı çıkarın ve bu dengeleme adımını üç kez tekrarlayın. Numuneleri yüklemek için bir pipet kullanarak reçineye bağlayın.Reçineyi 20 mikrolitre% 0.1 trifloroasetik asit ile yıkayın. Bu adımı beş kez tekrarlayın. Numuneleri %0,1 trifloroasetik asit içinde üç mikrolitre %60 asetonitril ile elute edin.Eluantı MALDI-TOF kütle spektritrisi için bir hedef plakaya pipetleyin. Hemen% 0.1 trifloroasetik asit içinde% 50 asetonitril içinde doyurulmuş CHCA çözeltisi ekleyin. Karışımı havayla kurutarak kristalleştirin.Biyotin etiketleri substratlarının parçalanmış formu için 700 ila 900 dalton arasındaki kütle spektrumlarına çok dikkat ederek, cihaz üreticisinin protokolüne göre numunelerin kütle spektrumlarını elde edin. Sentetik substratların kütle spektrumları burada gösterilmiştir. Öncü moleküler ağırlığa karşılık gelen pikler 850 ile 1.050 arasında tespit edildi.Bölünmüş parçalar 700 ila 850 aralığında tespit edilir. Burada, TPCK tripsin ile muamele edilen MNO biyotin etiketli substratlar için spektrumlar gösterilmiştir. 839.81 dalton ve 796.76 dalton zirveleri, sırasıyla lizin ve arginin'in C terminalinden ayrılan parçalara karşılık gelir.Burada gösterilenler, V8 proteaz ile sindirilen sentetik substratların kütle spektrumlarıdır. 769.78 dalton ve 755.62 dalton zirveleri, sırasıyla glutamik asit ve aspartik asidin C terminalinden ayrılan parçalara karşılık gelir. MNO biyotin etiketleri, çeşitli pH koşullarında bir akciğer dokusu ekstraktı ile muamele edilmiş substratlar için spektrumlar burada gösterilmektedir.Asidik durumda, pH beşte, bölünmüş bir parçanın moleküler ağırlığı 770.13 dalton ve 826.66 dalton idi, bu da glutamik asit ve triptofanın C terminalinde bölünmeyi gösterir. Nötr ve bazik durumda, pH yedi ve dokuzda, bölünmüş bir parçanın moleküler ağırlığı, 767 dalton ve 840 dalton zirvesinde arttırıldı, bu da arginin ve lizinin C terminalinde bölündüğünü gösterir. Tersine, glutamik asit ve triptofanın zirveleri azaldı.Ek olarak, bu yöntem inaktive edilmiş ekstraktlar içeren parçalanmış parçaları tespit edemez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, substrat sentezi dışında, uygun şekilde gerçekleştirilirse iki gün içinde yapılabilir. Ek olarak, substrat sentezlendikten sonra, birkaç numunede ölçülebilir. Neden?Bu prosedürü denerken, tampon pH'ında (yaklaşık dokuz) çalışmayı unutmamak önemlidir. Genel olarak, avidin amino biotin kompleksinin reaksiyonu. Bu prosedürü takiben, bir CMS gerçekleştirerek enzim aktivitesini ölçmek mümkündür.Bu yöntem, proteon alanındaki araştırmacıların çeşitli koşullarda proteaz ekspresyonunu keşfetmenin yolunu açmasına izin verecektir.

the-determination-protease-specificity-mouse-tissue-extracts-maldi

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Yakalama Bileşikler fotoğraf crosslinking ve saflaştırma takip fonksiyonel geri dönüşümlü küçük molekül-protein etkileşim proteom karmaşıklığını azaltmak için trifunctional küçük moleküllerdir. Burada Yakalama...

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

Her yerde bulunan ikinci haberci c-di-GMP, birçok bakterinin büyümesini ve davranışını kontrol eder. Hemen hemen her bakteri türünde c-di-GMP bağlayıcı proteinleri biyokimyasal olarak tanımlamak ve karakterize etmek için yeni bir Yakalama Bileşik Kütle Spektrometresi tabanlı teknoloji geliştirdik.

Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

SPOT yöntemiyle sentezlenen peptit dizileri, Protein lizin metiltransferazların (PKMT'ler) substrat özgüllüğünü analiz etmek ve biyolojik rollerini anlamak için PKMT'lerin substrat spektrumunu tanımlamak için kullanılabilir. Bu protokol, peptit dizilerinin nasıl sentezleneceğini, PKMT'lerle nasıl metilleneceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi

Burada izole periosteum fare kalp üzerinde profil oluşturma polysome gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz kalp perfüzyon, profil oluşturma polysome ve polysome kesirler ile ilgili mRNA'ların, miRNAs ve polysome Proteom analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Bu protokol, gelişmiş özellik ekstraksiyonu ve biyoinformatik analiz yazılımı ile birlikte sıvı kromatografi kütle spektrometresi kullanılarak peptidoglikan bileşiminin ayrıntılı bir analizini kapsar.

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Bu protokol, mutant L274G-Metiyonin tRNA sentetazı (MetRS*) ifade eden bir fare çizgisi kullanılarak azidonorlösin (ANL) ile hücre tipine özgü protein etiketlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini ve etiketli hücre tipine özgü proteinlerin izolasyonu için gerekli adımları açıklar. Canlı farelerde (1) içme suyu ve (2) intraperitoneal enjeksiyonlarla iki olası ANL uygulama yolunu özetliyoruz.

Mutant Metiyonin tRNA Sentetaz Fare Hattı Kullanılarak Hücre Tipi Özgül Protein Saflaştırma ve Kompleks Dokulardan Tanımlama

Burada, endojen fosfoprotein fosfatazların ve bunların hücre ve dokulardan etkileşen proteinlerinin zenginleştirilmesi ve kütle spektrometrisine dayalı proteomiklerle tanımlanması ve nicelleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz.

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Benzer proteinlere sahip türlerin karışımlarındaki bileşenlerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz. Kütle spektrometresi, tanımlama için peptitleri tespit eder ve tepe alanlarının oranlarına göre nispi nicelik verir. Dolandırıcılık tespiti için bir araç gıda olarak, yöntem sığır etinde% 1 at tespit edebilir.

Et kimlik doğrulaması için peptidler Uygulanan MRM Kütle Spektrometresi kullanarak karışımlar türlerin belirlenmesi ve miktar tayini

Öğrenin fare doku ekstrelerinde proteaz özgüllüğünü MALDI-TOF kitle spektrometresi ile belirleme yöntemini. Bu teknik çoklu örneklerin eş zamanlı analizini sağlayarak proteaz aktivitesi araştırmalarını hızlandırır.

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle (Video) | JoVE Journal

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Daha fazla video keşfet