Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Bu deneyin genel amacı, çoklu ham ekstraktlarda proteaz özgüllüğünü belirlemektir. Bu yöntem, proteaz özgüllüğünü belirlemek için temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, parlay'da birden fazla numunenin proteaz özgüllüğünü tanımlayabilmesidir.

Erkek ICR farelerinden elde edilen akciğer dokusu örneklerini buzda soğutun. Numuneleri bir karıştırıcıda 30 saniye boyunca 20.000 RMP'de homojenize edin. Numuneler tamamen homojen olana kadar bu adımı tekrarlayın.

Sıcaklığın artmasını önlemek için sürekli olarak bir dakikadan fazla homojenize etmeyin. 1.000 mikrolitre homojenatı 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 10.000 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanın 500 mikrolitresini yeni bir 1.5 mililitrelik plastik tüpe aktarın.

Protein konsantrasyonunu belirlemek için numunenin 10 mikrolitresini kullanın. Biskintoninik asit tahlili veya Bradford tahlili gibi yöntemleri kullanarak. Donmayı önlemek için, nihai %50gliserol konsantrasyonu için numunelere %80 gliserol ekleyin.

pH'a bağlı olarak proteaz özgüllüğündeki farkı açıklığa kavuşturmak için pH üç, beş, yedi ve dokuza ayarlanmış sindirim tamponları kullanın. 890 mikrolitrelik bir sindirim tamponuna, mikrolitre başına 10 mikrolitre 0.1 mikrogram veya TPCK tripsin, mikrolitre başına 0.1 mikrogram staphylococcus aureus V8 proteaz veya mikrolitre doku özü başına 10 mikrogram ekleyin. Doku ekstraktlarında proteazı inkübasyon ve 10 dakika kaynar su ile inaktive ederek negatif kontroller hazırlayın.

Daha sonra, numunelere 10 mikrolitre MNO biyotin etiket substratı ekleyin ve sindirmek için 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, substratların sindirimini 10 dakika kaynar su ile durdurun. Sindirilmiş substratları dört santigrat derecede 10.000 kez G'de beş dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. % 0.1 polioksietilen oktil fenil eter içeren bir molar tris tamponuna 50 mililitre% 50 streptavidin sefaroz boncukları ekleyin. Çözeltinin pH dokuz civarında olduğundan emin olmak için pH test kağıdı kullanın.

Uygun pH'ı dokuz veya daha fazlasına ayarlamak önemlidir. Amino biotin, pH dokuz veya daha yüksek olmadıkça bir boncuğu ısıramaz. Çözeltinin pH'ı düşükse, daha fazla tampon ekleyerek yaklaşık pH dokuza ayarlayın.

Ek olarak, gerekirse pH'ı yükseltmek için bir molar tris tamponu eklenebilir. MNO biyotin etiketli substratları streptavidin'e bağlamak için bir döndürücü tekerlek üzerinde sürekli yumuşak karıştırma ile süspansiyonu gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Boncuklar inkübasyon boyunca asılı kalmalıdır.

Ertesi gün, numuneleri dört santigrat derecede 10.000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, 1.000 mikrolitre yıkama tamponu ekleyerek boncukları yıkayın. Ardından, bir döndürücü üzerinde sürekli yumuşak karıştırma ile dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

Boncukları dört santigrat derecede 10.000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve bu yıkamayı dört kez tekrarlayın. Ardından, boncuklara 100 mikrolitre% 0.2 trifloroasetik asit ekleyin.

Çözeltinin pH ikinin altında olduğundan emin olmak için pH test kağıdı kullanın. Çözeltinin pH'ı yüksekse,% 1 trifloroasetik asit ekleyerek pH'ı ikinin altına ayarlayın. Süspansiyonu, bir döndürme tekerleği üzerinde sürekli yumuşak karıştırma ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Boncukları daha önce olduğu gibi santrifüjledikten sonra, süpernatanı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Etkinleştirmek için bir C18 reçinesi üzerine 20 mikrolitre asetonitril pipetleyin. Kullanılmış asetonitril'i çıkarın ve bu aktivasyon adımını üç kez tekrarlayın.

Ardından, C18 reçinesini 20 mikrolitre %0.1 trifloroasetik asit ile dengeleyin. Eluantı çıkarın ve bu dengeleme adımını üç kez tekrarlayın. Numuneleri yüklemek için bir pipet kullanarak reçineye bağlayın.

Reçineyi 20 mikrolitre% 0.1 trifloroasetik asit ile yıkayın. Bu adımı beş kez tekrarlayın. Numuneleri %0,1 trifloroasetik asit içinde üç mikrolitre %60 asetonitril ile elute edin.

Eluantı MALDI-TOF kütle spektritrisi için bir hedef plakaya pipetleyin. Hemen% 0.1 trifloroasetik asit içinde% 50 asetonitril içinde doyurulmuş CHCA çözeltisi ekleyin. Karışımı havayla kurutarak kristalleştirin.

Biyotin etiketleri substratlarının parçalanmış formu için 700 ila 900 dalton arasındaki kütle spektrumlarına çok dikkat ederek, cihaz üreticisinin protokolüne göre numunelerin kütle spektrumlarını elde edin. Sentetik substratların kütle spektrumları burada gösterilmiştir. Öncü moleküler ağırlığa karşılık gelen pikler 850 ile 1.050 arasında tespit edildi.

Bölünmüş parçalar 700 ila 850 aralığında tespit edilir. Burada, TPCK tripsin ile muamele edilen MNO biyotin etiketli substratlar için spektrumlar gösterilmiştir. 839.81 dalton ve 796.76 dalton zirveleri, sırasıyla lizin ve arginin'in C terminalinden ayrılan parçalara karşılık gelir.

Burada gösterilenler, V8 proteaz ile sindirilen sentetik substratların kütle spektrumlarıdır. 769.78 dalton ve 755.62 dalton zirveleri, sırasıyla glutamik asit ve aspartik asidin C terminalinden ayrılan parçalara karşılık gelir. MNO biyotin etiketleri, çeşitli pH koşullarında bir akciğer dokusu ekstraktı ile muamele edilmiş substratlar için spektrumlar burada gösterilmektedir.

Asidik durumda, pH beşte, bölünmüş bir parçanın moleküler ağırlığı 770.13 dalton ve 826.66 dalton idi, bu da glutamik asit ve triptofanın C terminalinde bölünmeyi gösterir. Nötr ve bazik durumda, pH yedi ve dokuzda, bölünmüş bir parçanın moleküler ağırlığı, 767 dalton ve 840 dalton zirvesinde arttırıldı, bu da arginin ve lizinin C terminalinde bölündüğünü gösterir. Tersine, glutamik asit ve triptofanın zirveleri azaldı.

Ek olarak, bu yöntem inaktive edilmiş ekstraktlar içeren parçalanmış parçaları tespit edemez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, substrat sentezi dışında, uygun şekilde gerçekleştirilirse iki gün içinde yapılabilir. Ek olarak, substrat sentezlendikten sonra, birkaç numunede ölçülebilir. Neden?

Bu prosedürü denerken, tampon pH'ında (yaklaşık dokuz) çalışmayı unutmamak önemlidir. Genel olarak, avidin amino biotin kompleksinin reaksiyonu. Bu prosedürü takiben, bir CMS gerçekleştirerek enzim aktivitesini ölçmek mümkündür.

Bu yöntem, proteon alanındaki araştırmacıların çeşitli koşullarda proteaz ekspresyonunu keşfetmenin yolunu açmasına izin verecektir.