Name: Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Öğrenin, formalin sabit parafin gömülü dokulardan mikroRNA analizi için cDNA kütüphane hazırlama protokolünü. Bu yöntem 35 yıllık arşiv örneklerinden RNA dizilemesi sağlar ve biyobelirteç keşfi için güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Thomas Tuschl, RNA Moleküler Biyoloji Laboratuvarı başkanı, hem de üyeleri onun laboratuvar destekleri ve onun laboratuar ve RNAworld boru hattı erişim sağlayan geliştirilen teknoloji paylaşımı için teşekkür ederiz. Biz Ayrıca Dr. Markus Hafner onun Protokolü paylaşımı ve onun ilk yordamda kullanılan tüm biyokimyasal ve enzimatik adımları hakkında detaylı açıklama sağlamak için teşekkür ederiz.

<ol><li>Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows.+Arch%22%5BJournal%5D)">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li>
<li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues%3A+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).</li>
<li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li>
<li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li>
<li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517(2013).</li>
<li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393(2013).</li>
<li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li>
<li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR%3A+the+strengths+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li>
<li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li>
<li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144(2011).</li>
<li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li>
<li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%3A+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li>
<li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671346/">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li>
<li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+targets+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li>
<li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500(2011).</li>
<li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li>
<li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627(2017).</li>
<li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+DNA%2FRNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs%2C+mRNAs%2C+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683(2012).</li>
<li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li>
<li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing%2C+selection%2C+extension+and+ligation+platform%3A+assessing+its+performance+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar bu el yazması sunulan verilerin bir bölümünü içeren bir yayını International Journal moleküler Bilimler içinde Loudig vd tarafından yayımlanan ifşa etmek isterdim 21.

Küçük RNA'lar FFPE RNA örnek arşivlenen NGS için son derece tekrarlanabilir ve sağlam cDNA Kütüphanesi hazırlık Protokolü Hafner vd tarafından açıklanan yordamı değiştirilmiş ve en iyi duruma getirilmiş sürümüdür bu protokol sunulmuştur 22
Bu iletişim kuralının tüm adımları FFPE numuneler kurtarılan eski arşivlenmiş ve güvenliği aşılan toplam RNA ile kullanım için optimize edilmiştir. Bu protokol, FFPE RNA, az miktarda işlemek için önemli bir adım tüm RNA örnek...

miRNAs oldukça iyi formalin sabit parafin gömülü (FFPE) örnek1,2,3' te korunmuş. Önceki çalışma bu kısa düzenleyici kodlamayan tek iplikçikli RNA molekülleri ifade FFPE örneklerinden toplam RNA kullanarak başarıyla değerlendirilecek ve orijinal taze karşılaştırıldığında ilgili gen ifadesi verileri sağlamak göstermiştir doku4,5,6,7,8. FFPE doku işleme (formaldehit, ısı, kuruma, vb), endojen RNases ve küçük boyutu miRNAs (~ 18-24 yaş örneklerin tarafından etkilenmesine neden için gösterilen büyük boyutlu haberci RNA karşılaştırıldığında nukleotid) onları bozulması için dayanıklı ve esnek de yüksek üretilen iş mRNA çalışmalar arşivlenmiş numuneler9daha iyi performans miRNA ifade çalışmalar aracılığıyla gösterdi uzun süreli depolama için yapmak görünür. miRNA ifade çalışmalar çoğunlukla küçük ölçekli analizleri yapılmıştır, arşivlenmiş klinik örnekler kullanarak o tek gösterdi veya kantitatif PCR deneyleri multiplexed, Mikroarray teknolojileri ve en yakın zamanda NGS farklı olabilir korunmuş miRNAs ifadeden sonra en iyi duruma getirme Bu deneyleri10,11,12,13,14değerlendirmek için kullanılabilir.
Verilen bu bozukluk miRNA ifade insan maligniteler çeşitli gelişimi ile ilişkili olmuştur ve orada olduğunu potansiyel olarak büyük bir kaynağı klinik olarak arşivlenmiş örnekleri açıklamalı, belirgin olmuştur ki bu küçük RNA molekülleri potansiyel kanser biyolojik15,16,17,18gelecek vaat eden bir kaynağı temsil eder. NGS gibi yüksek üretilen iş gen ifade teknoloji kullanımı miRNA transkriptlerinizin PCR ve/veya microarrays19gibi hedeflenen teknolojileri karşılaştırıldığında genel bir değerlendirme sağlama avantajına sahiptir. Bu nedenle, en iyi duruma getirilmiş, uygun fiyatlı ve kolayca uygulanabilir bir iletişim kuralı cDNA Kütüphanesi hazırlanması için eski arşivlenmiş örnekler üzerinden küçük RNA'ların NGS için büyük ölçekli retrospektif çalışmalar20etkinleştirmek için optimize edildi.
Biz daha önce bir eşzamanlı RNA/DNA ekstraksiyon protokol çağdaş ticari kitleri21daha iyi performans için bulduğumuz eski arşivlenmiş numuneler RNA ve DNA ayrı kurtarma için kurulmuş. Toplam RNA FFPE doku kez uzun süre arşivlenmiş edinmek için bu ayıklama protokolü kullanarak, klinik örnekler 35 yaşına kadar korunmuş miRNAs NGS cDNA kitaplıkları hazırlanması optimize edilmiştir. Ayrıca, klinik olarak sınıflandırılmış duktal Karsinom situ kitaplıklardan cDNA (DCIS) örnekler nerede hazırladığımız son yayınlanan bir çalışmada, belirtilen kantitatif PCR tarafından doğrulanmış differentially ifade miRNAs tespit belirli miRNA ifade değiştiğine DCIS lezyonlar DCIS lezyonlar için meme kanseri geliştirmek mi hastalar karşılaştırıldığında meme kanseri hastaların tespit olabilir.
Küçük RNA cDNA kütüphaneler hazırlanması için ticari kitleri, onların kesilmesi için potansiyel maliyetini, hem de göz önüne alındığında optimize değil telif hakkı/patent-korumalı reaktifler kullanımı, daha önce yayımlanmış uyum karar verdik Laboratuvar tabanlı ve kiti ücretsiz 3' barkodlu cDNA Kütüphanesi hazırlık iletişim kuralı için küçük RNA'lar FFPE örnek arşivlenen NGS 18 eş zamanlı analiz izin22örnekler. Bu iletişim kuralı FFPE RNA numuneler adaptasyon için kritik olan görsel ve teknik değerlendirme kontrol noktaları ile ideal ve sağlam bir adım adım yordam sağlar ve uygulama güvenliği aşılan veya zor diğer kaynakları için güçlü bir potansiyele sahiptir RNA malzeme kullanmak için. Özgün protokolün uygulanabilirliği ile floresan (örneğin, SYBR altın) radioactively etiketli boyutu işaretleri değiştirerek düzelmiştir büyük polyacrylamide jelleri ve birleştirilmiş arşivini seçimi sırasında kullanılan tespit RNA boyutu işaretleri. Ligasyonu 3' barkodlu bağdaştırıcılarının çoğu 18 bireysel FFPE RNA numuneler için en iyi duruma getirilmiş bu protokolü kullanır sonra 5' bağdaştırıcısı ligasyonu geçmesi birlikte havuza alınmış, ters-transkripsiyon ve bir pilot PCR analiz için uygun son cDNA amplifikasyon yüksek üretilen iş sequencer üzerinde kütüphane büyük ölçekli PCR güçlendirme, arıtma ve NGS önce.

<table><tbody><tr><td>% 1 Triton x-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>10mM ATP</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10X dNTPs</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>14M Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>O3445I-100</td><td></td></tr><tr><td>20 nt merdiven</td><td>Jena Bioscience</td><td>M-232S</td><td></td></tr><tr><td>20mg / ml Sığır Serumu</td><td>Albümin Sigma</td><td>B8894-5ML</td><td></td></tr><tr><td>50X Titanyum Taq</td><td>Clontech Laboratuvarları</td><td>639208</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>BRL Cam plakalı ve taraklı Dikey Jel Elektroforez Sistemi</td><td>GIBCO</td><td>V16</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D9170-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf mikrosantrifüj 5424R</td><td>ABD bilimsel</td><td>4054-4537Q</td><td></td></tr><tr><td>Eppndorf Thermomixer</td><td>ABD bilimsel</td><td>4053-8223Q</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand ve ticaret; Silikonize Düşük Tutulmalı Mikrosantrifüj Tüpleri 1.5ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Jel Kırıcı Tüp 0.5 ml</td><td>IST Mühendislik A.Ş.,</td><td>3388-100</td><td></td></tr><tr><td>Jel elektroforez cihazı 7cm x10cm- Jel tepsileri ve tarakları ile Mini-sub Cell GT</td><td>Biorad</td><td>1704446</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Jersey-Cote</td><td>LabScientific, Inc</td><td>1188</td><td></td></tr><tr><td>KcL 2M</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge çift rotorlu kişisel santrifüj</td><td>ABD bilimsel</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Model V16 poliakrilamid jel elektroforez aparatı, camlar, taraklar ve ara parçalar</td><td>Ciore Yaşam Bilimleri</td><td>21070010</td><td></td></tr><tr><td>Oligonükleotidler</td><td>IDT</td><td>Tanımlı sipariş</td><td></td>sırasında</tr><tr><td>Owl EasyCast B2 mini elektroforez sistemi - jel tepsileri ve tarakları ile</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Jel Ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Restriksiyon enzimi PmeI</td><td>NEB</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Güvenli Görüntüleyici 2.0 mavi ışık transilluminatörü</td><td>Thermofisher</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE agarose</td><td>Lonza</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td>Üst simge III ters transkripsiyon kiti</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligaz 1</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligaz 2 Kesik K227Q</td><td>NEB</td><td>0351L</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Isıtmalı kapaklı Themocycler</td><td>Uygulanan Biyosistem</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sequagel sistemi konsantre, seyreltici ve tampon</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>EC-833</td><td></td></tr></tbody></table>

retrospektif mikrorna sıralama: parafin gömülü rna formalin sabit örnekler kullanarak tamamlayıcı dna kütüphane hazırlık protokolü

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

-Arşivlenmiş, formalin sabit klinik olarak sınıflandırılmış parafin gömülü (FFPE) doku kanseri geliştirme retrospektif moleküler çalışmalar için nükleik asitler sağlayabilir. Daha sonra invaziv hastalık geliştirmek hastalarda non-invaziv veya önceden Malign lezyonlar kullanarak, gen ifade analizleri Kanser riski için yatkınlık erken moleküler değişiklikler tanımlamaya yardımcı. De nükleik asitler FFPE dokulardan kurtarılan şiddetli fiziksel hasar ve kimyasal değişiklikler, daha onların analiz yapmak zor ve genellikle adapte deneyleri gerektirir uğramıştır tanımlanmıştır. Küçük bir sınıfı temsil mikroRNA (miRNAs), ancak, RNA molekülleri ~ 18-24'e kadar sadece kapsayan nükleotit, gösterilmiştir uzun süreli depolama dayanabilir ve başarılı bir şekilde FFPE örnekleri analiz için. Burada özellikle hangi son zamanlarda güçlü ve son derece tekrarlanabilir kullanarak arşivlenmiş zaman gerekir gösterilmiştir analiz arşivlenmiş dokulardan çıkarılan küçük RNA'ların en iyi duruma getirilmiş bir 3' barkodlu Tamamlayıcı DNA (cDNA) Kütüphane hazırlık iletişim kuralı mevcut Klinik örneklerin 35 yıl boyunca saklanır. Bu kütüphane hazırlık nerede RNA örnekleri (en fazla 18) bireysel 3' barkodlu bağdaştırıcılarla bakmaksızın ve birlikte sonraki enzimatik ve biyokimyasal hazırlıkları havuza alınmış tehlikeye/bozulmuş malzeme multiplex analizine de adapte önce analiz. Tüm purifications boyutu özel seçimleri ve enrichments barkodlu küçük RNA türlerin sağlayan polyacrylamide Jel Elektroforez tarafından (sayfa), gerçekleştirilir. Bir pilot Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) yeni nesil sıralama (NGS) için malzeme en uygun miktarda üretmek belirli amplifikasyon döngüsü belirlenmesi bu cDNA Kütüphanesi hazırlık dakika RNA girişleri için de adapte önemlidir. Bu yaklaşım bozulmuş FFPE RNA 35 yaşına kadar arşivlenmiş örnekler üzerinden kullanımı için optimize edildi ve son derece tekrarlanabilir NGS veriler sağlar.

Yönteminde burada, toplam 18 bireysel FFPE RNA örneklerinin açıklandığı gibi (100 ng her) ayrı tüplerde 3' adenylated barkodlu Oligonükleotid T4 ligasyonu gecede geçmesi ayarlanır. Ertesi gün, enzimatik reaksiyonları ısı devre dışı, kombine ve tek bir tüp çöktürülmüş. RNA Pelet resuspended ve bir polyacrylamide nerede sayfa jel bitişik wells göç RNA Oligonükleotid boyutu işaretleri uygun ölçekli 3' barkodlu seçmek için kullanılır jel (sayfa), denaturing % 15 üzerinde ve birleştirilmiş RNA...

Parafin katıştırılmış örneklerden formalin sabit insan hastalıkların moleküler biyolojik değerli bir kaynağı temsil eder. Burada başlangıçta taze donmuş RNA ile tasarlanmış ve dokulara gelen arşivlenmiş mikroRNA'lar analizini 35 yaşına kadar saklı için en iyi duruma getirilmiş bir laboratuar tabanlı cDNA Kütüphanesi hazırlık protokolü, mevcut.

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Bu CDNA Kütüphanesi hazırlığının genel amacı, resmi ve sabit parafine gömülü dokularda depolanan küçük RNA'ların başarılı bir şekilde dizilenmesini sağlamaktır. Bu yöntem, resmi ve sabit parafine gömülü numuneleri analiz etmek için çok kullanışlıdır. 18 örneğe kadar RNA'yı çıkarırsınız, bunların hepsinin içeriğini analiz edersiniz ve tüm örnekler için tüm mikroRNaz'ın bir profilini elde edersiniz.Protokole başlamak için, ayrı ayrı ayrılmış 18 FFPERNA örneğinin her birine 8,5 mikrolitre önceden hazırlanmış ligasyon ana karışımı ekleyin. Tüpleri hafifçe vurun ve iki saniye boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra tüpleri buz üzerinde saklayın.Her adaptörün bir mikrolitresini RNA ve ligasyon ana karışımı içeren ilgili FFPERNA numunelerine aktarmak için üç mikrolitrelik bir pipet kullanın. FFPERNA numuneleri arasında yukarı ve aşağı pipetleme yapmayın ve uçları değiştirmeyin. Her tüpü kapatın, karıştırmak için hafifçe vurun ve iki saniye boyunca santrifüjleyin.Tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Tüpleri bir dakika boyunca 90 santigrat derecede bir ısı bloğuna yerleştirerek reaksiyonları denatüre edin ve ardından hemen buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, seyreltilmiş ligasyon en

retrospective-microrna-sequencing-complementary-dna-library

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Gen ekspresyonu, mutasyonlar ve gen füzyonları için seçilen transkriptleri sorgulamak için indekslenmiş cDNA kütüphanelerinin hazırlanmasını, özel problarla hibridizasyon ve yakalama ve veri analizini içeren hedefli RNA dizileme tabanlı bir yöntemi tanımlıyoruz. Hedeflenen RNAseq, seçilen transkriptlerin bir masaüstü sıralayıcıda uygun maliyetli, hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

Bu modifiye çıkarma protokolü histopatolojik doku blokları ilgi daha doğrusu hedef bölgelerden RNA ve DNA verimi artırır.

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Bu iletişim kuralı kimliği ve lenf düğümlerinden hayvancılık ve yaban hayatının yaklaşımlar örnekleme, eksizyon adımlar dahil olmak üzere büyük hayvanlar dokulardan lenf nodu transcriptomic profilleme için RNA izolasyonu için yordamlar genel bakış sağlar sonrası koleksiyonu saklama ve işleme için RNA analizi için birden fazla hayvan ve dikkat edilmesi gereken noktalar artı temsilcisi sonuçları arasında tutarlılığı sağlamak için.

Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

Bu iletişim kuralı birden çok model organizmalar transkripsiyon kalitesini izlemek için araştırmacılar ile yeni bir araç sağlar.

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), transkripsiyonel düzenlemede ve proteinler arasındaki iletişimlerde rol alabilecek kodlamayan RNA'lardır. CircRNA sıralama kütüphanelerinin inşası için farklı parametrelerin değerlendirilmesinin ardından, RNase R ön arıtma ile mahsur kalan toplam RNA kitaplığı hazırlığı kullanılarak bir protokol derlenmiş ve burada sunulmuştur.

RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNA'ların Tanımlanması

Standart yöntemlere göre daha az önyargılı ve 2'-O-metil RNA'lar için artan hassasiyetiçeren ayrıntılı bir küçük RNA kütüphane telafi protokolü saiyoruz. Bu protokol maliyet tasarrufu veya kolaylık sağlamak için kitleri kullanarak ev yapımı reaktifler kullanılarak izlenebilir.

Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti

Tedavi direnci genellikle ileri prostat kanseri olan hastalarda gelişir, ve bazı durumlarda, kanser nöroendokrin prostat kanseri denilen ölümcül bir alt tip ilerler. Bu geçişi kolaylaştıran küçük kodlamayan RNA aracılı moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi, daha iyi hastalık tabakalaşmasına ve nöroendokrin prostat kanserigelişimine yol açan nedensel mekanizmaların tanımlanmasına olanak sağlayacaktır.

Formalin-sabit Dokulardan Küçük Kodlamaz RNA'nın ve Kastrasyona Dirençli Prostat Kanseri Hastalarından Serum Türetilmiş Ekzozomların Dizilimi

Erken fare embriyolarında mikroRNA'ların profilini çıkarmak için bir teknik tanımladık. Bu protokol, düşük hücre girişi ve küçük RNA zenginleştirme zorluğunun üstesinden gelebiliyor. Bu tsay erken fare embriyofarklı hücre soylarında zaman içinde miRNA ifade değişiklikleri analiz etmek için kullanılabilir.

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

Bu protokol, paraformaldehit sabitlenmiş, Optimal Kesme Sıcaklığı bileşen gömülü fare karaciğer dokusunun tanımlı histolojik bölgelerinden RNA'yı lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanarak izole etme yöntemini tanımlar; böylece hedefe yönelik aşağı akım gen ekspresyonu analizi mümkün olur.

RNA analizi için paraformaldehit sabitli fare karaciğer dokusunun lazer yakalama mikrodiseksiyonu

Burada bir protokol Metil-Bağlama DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq veya MBD-seq) teknolojisi ve sonraki biyoinformatik analiz boru hattı kullanılarak büyük ölçekli klinik hasta tarama çalışmalarında genom DNA metilasyonu araştırmak için sunuyoruz.

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Öğrenin, formalin sabit parafin gömülü dokulardan mikroRNA analizi için cDNA kütüphane hazırlama protokolünü. Bu yöntem 35 yıllık arşiv örneklerinden RNA dizilemesi sağlar ve biyobelirteç keşfi için güvenilir sonuçlar sunar.

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü (Video) | JoVE Journal

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

Daha fazla video keşfet