Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

Bu CDNA Kütüphanesi hazırlığının genel amacı, resmi ve sabit parafine gömülü dokularda depolanan küçük RNA'ların başarılı bir şekilde dizilenmesini sağlamaktır. Bu yöntem, resmi ve sabit parafine gömülü numuneleri analiz etmek için çok kullanışlıdır. 18 örneğe kadar RNA'yı çıkarırsınız, bunların hepsinin içeriğini analiz edersiniz ve tüm örnekler için tüm mikroRNaz'ın bir profilini elde edersiniz.

Protokole başlamak için, ayrı ayrı ayrılmış 18 FFPERNA örneğinin her birine 8,5 mikrolitre önceden hazırlanmış ligasyon ana karışımı ekleyin. Tüpleri hafifçe vurun ve iki saniye boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra tüpleri buz üzerinde saklayın.

Her adaptörün bir mikrolitresini RNA ve ligasyon ana karışımı içeren ilgili FFPERNA numunelerine aktarmak için üç mikrolitrelik bir pipet kullanın. FFPERNA numuneleri arasında yukarı ve aşağı pipetleme yapmayın ve uçları değiştirmeyin. Her tüpü kapatın, karıştırmak için hafifçe vurun ve iki saniye boyunca santrifüjleyin.

Tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Tüpleri bir dakika boyunca 90 santigrat derecede bir ısı bloğuna yerleştirerek reaksiyonları denatüre edin ve ardından hemen buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, seyreltilmiş ligasyon enziminin bir mikrolitresini 18 RNA örneğinin her birine aktarmak için üç mikrolitrelik bir pipet kullanın.

Ligasyonları buzun üzerine yerleştirin ve 18 saatlik bir gece inkübasyonu için dört santigrat derece soğuk bir odaya yerleştirin. Ligasyon reaksiyonunu devre dışı bırakmak için tüpleri 90 santigrat derecede bir dakika boyunca bir ısı bloğuna yerleştirin ve ardından soğumaları için en az iki dakika buza geri koyun. Her tüpe 1,2 mikrolitre çökeltme ana karışımını aktarın.

63 mikrolitre% 100 etanol ekleyin. Her tüpü kapatın, karıştırmak için tüpleri hafifçe vurun ve iki saniye boyunca santrifüjleyin. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin.

18 tüpün tamamının içeriğini tek bir 1,5 mililitrelik silikonlu tüpte birleştirin ve karıştırmak için üç kez ters çevirin. Tüpleri iki saniye santrifüjleyin ve çökelmesi için 60 dakika buzun üzerine koyun. Çökeltmeden sonra, 1.5 mililitrelik tüpü havuzlanmış ligasyonlarla santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanı bir mililitrelik pipet ucuyla çıkarın, ancak altta biraz sıvı bırakın. Tüpü eğin ve kalan süpernatanı çıkarmak için 20 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Süpernatanı 10 mikrolitre uçlu bir Pasteur pipeti ile vakumla emin, ardından tüpü hafifçe vurarak RNA peletini 20 mikrolitre RNaz içermeyen suda yeniden süspanse edin.

RNA'yı yeniden süspanse etmek için 20 mikrolitre PAA jel yükleme solüsyonu ekleyin. Tüpü hafifçe vurun, tüpü oda sıcaklığında iki saniye santrifüjleyin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Jel aparatının önceden hazırlanmış 0.5 XTBE'sini taze 0.5 XTBE ile değiştirin ve ikincisini, boyut işaretleyicilerini ve bağlı RNase'yi jelin ortasına yükleyin ve her iki tarafta iki boş kuyucuk bırakın.

Ardından jeli çalıştırın. Jeli çalıştırdıktan sonra, cam plakalardan birini çıkararak %15'lik sayfayı açın. Cam plaka üzerinde oturan jele 10 mikrolitre floresan boya solüsyonu ve 25 mililitre 0.5 XTBE ile hafifçe püskürtün ve karanlıkta beş dakika düz bir şekilde oturmasına izin verin.

Camı jel ile birlikte mavi ışıklı bir transilluminatör üzerine yerleştirin ve bağlanmış küçük RNA'ların eksizyonunu yönlendirmek için hem 19 nükleotid hem de 24 nükleotid boyutu işaretleyicisini bir cetvelle hizalayın. Ardından, jeli çıkarın. Eksize edilen jeli, 1,5 mililitrelik silikonize mikrosantrifüj tüpüne güvenli bir şekilde yerleştirilmiş jel dilimlerini parçalamak için tasarlanmış 0,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Jeli oda sıcaklığında üç dakika boyunca 16 bin kez G'de santrifüjleyin. Parçalanmış jeli 300 mikrolitre 400 milimolar sodyum klorür çözeltisi ile tekrar süspanse edin. Tüpü kapatın ve parafin film ile kapatın.

Bir gece boyunca inkübasyon için içeriği dört santigrat derece soğuk bir odada 11 yüz RPM'de bir termo karıştırıcı üzerinde çalkalayın. Ertesi gün, tüpü termo karıştırıcıdan alın ve çözeltiyi 1,5 mililitrelik silikonize RNaz içermeyen bir toplama tüpüne yerleştirilmiş beş mikrometrelik bir filtre tüpüne aktarmak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Tüpü oda sıcaklığında 23 yüz kez G'de üç dakika santrifüjleyin.

Filtre tüpünü atın, filtrelenmiş çözeltiyi içeren toplama tüpüne 950 mikrolitre% 100 etanol ekleyin ve karıştırmak için tüpü ters çevirin. Tüpü iki saniye santrifüjleyin ve 60 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Ardından, RNA peletini çökeltin.

Ardından, kapağı açarak ve süpernatanı bir mililitrelik pipetle dikkatlice çıkararak RNA peletini kurutun ve altta bir miktar sıvı bırakın. Pelete dokunmadan kalan tüm süpernatanı çıkarmak için 20 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Tüpü, kalan herhangi bir çözelti peletin karşı tarafına hareket edecek şekilde eğin.

Süpernatanı aspire etmek için bir Pasteur pipeti kullanın ve peleti bir vakum kullanarak kurutun. RNA peletini 5.6 mikrolitre RNaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. Ters transkripsiyon reaktiflerini buz üzerinde 15 dakika boyunca çözdürün.

Üç mikrolitre 5X tampon, 4.2 mikrolitre 10X dioksinükleotid trifosfat veya DNTP'ler ve 1.5 mikrolitre ditiyotreitol veya DTT ekleyerek bir ters transkripsiyon reaksiyonu ayarlayın. Reaksiyonu karıştırmak için tüpü hafifçe vurun ve çözeltiyi toplamak için iki saniye santrifüjleyin. Reaksiyon tam olarak 30 saniye boyunca 90 santigrat derecede bir ısı bloğunda kaldıktan sonra, sıcaklığı eşitlemek için iki dakika boyunca doğrudan 50 santigrat derecede bir termo karıştırıcıya aktarın.

0.75 mikrolitre ters transkripsiyon enzimini doğrudan çözeltiye ekleyin. Karıştırmak için hafifçe vurun ve tüpü hemen 30 dakika boyunca 50 santigrat derecede termo karıştırıcıya geri koyun. 30 dakika sonra, ters transkripsiyonu durdurmak için tüpü bir dakika boyunca 95 santigrat derecede bir ısı bloğuna aktarın.

Ters transkripsiyona doğrudan 95 mikrolitre RNaz içermeyen su ekleyin. Karıştırmak için tüpü hafifçe vurun ve iki dakika boyunca doğrudan buzun üzerine koyun. Pilot PCR reaksiyonunu birleştirin ve termo döngüleyici üzerinde iki PCR döngüsü ayarlayın.

Termo döngüleyicide pilot PCR reaksiyonunu ayarlayın ve birinci dosyayı başlatın. Birinci dosyanın sonunda, pilot PCR reaksiyonundan 12 mikrolitreyi üç mikrolitre 5X jel yükleme boyası içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için 20 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Ve 10 döngü olarak etiketleyin. Pilot PCR tüpünü kapatın ve termo döngüleyicide ikinci dosyayı başlatın. İkinci dosyanın sonunda, 12 mikrolitre çözeltiyi üç mikrolitre 5X jel yükleme boyası ile 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için 20 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve 12 döngü olarak etiketleyin.

PCR döngüleri 14, 16, 18 ve 20'de pilot PCR reaksiyonundan 12 mikrolitre PCR ürünü toplamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın. Daha sonra, 12 mikrolitrelik PCR alikotlarının her birine ve üç mikrolitre merdiven ve dokuz mikrolitre RNaz içermeyen su içeren 20 nükleotid merdivenine üç mikrolitre 5X jel yükleme boyası ekleyin. Numuneleri 0.5 XTBE içeren bir agaroz jel üzerinde çalıştırdıktan sonra, optimum PCR döngüsünü belirlemek için jeli bir UV kutusu üzerinde değerlendirin.

Ardından, agaroz jel kütüphanesi saflaştırması için büyük ölçekli PCR reaksiyonlarını ayarlayın. PCR amplifikasyonundan sonra, her bir PCR tüpünden dokuz mikrolitreyi, üç mikrolitre 5X jel yükleme boyası içeren altı adet 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 20 nükleotidlik bir merdiven hazırlayın.

Merdiveni, negatif PCR kontrolünü ve altı PCR ürününü agaroz jelin üzerine yükleyin ve jeli 120 voltta 30 dakika çalıştırın. Bir UV kutusundaki şeritler arasındaki PCR basitleştirmelerinin tekdüzeliğini doğrulayın ve bir görüntü alın. Üç PCR reaksiyonunu iki adet 1.5 mililitrelik silikonize mikrosantrifüj tüpünde birleştirin, 27 mikrolitre beş molar sodyum klorür ve 950 mikrolitre %100 etanol ekleyin.

Karıştırmak için tüpleri ters çevirin ve PCR ürünlerini çökeltmek için gece boyunca 20 santigrat dereceye ayarlayın. Protokol kullanılarak, iki taze donmuş tümör RNA'sı ile bunların spesifik FFPERNA örneği muadilleri arasındaki mikro RNA ekspresyon korelasyonu tespit edildi. Eşleşen taze dondurulmuş ve FFPE mikro RNA arasındaki grafikler, farklı şekilde işlenen örneklerde tespit edilen mikroRNA arasında yüksek korelasyon olduğundan, CDNA Kütüphanesi preparatının iyi bir tekrarlanabilirlik sağladığını göstermektedir.

Optimize edilmiş CNDA Kütüphanesi hazırlık protokolünün giderek daha eski FFPE örnekleriyle uygulanabilir ve tekrarlanabilir olup olmadığını belirlemek için, 18, 20, 22, 27, 30 ve 35 yıl boyunca arşivlenen FFPE dokularından mikro RNA ekspresyon profilleri elde edildi. Korelasyon katsayısı, örneğin yaşına veya kütüphane hazırlık haftasına bakılmaksızın 0.96'nın üzerinde kalmıştır. Bu nedenle, optimize edilmiş CDNA Kitaplığı hazırlama protokolü, arşiv sürelerinden bağımsız olarak FFPE örneklerinin tekrarlanabilir analizi için sağlam bir araç sağlar.

Bu nedenle, bu videoyu izledikten sonra, küçük RNA kütüphanelerinizi nasıl hazırlayacağınız ve tüm değerli resmi ve sabit parafine gömülü örneklerinizin tam bir mikroinekspresyon profilini nasıl elde edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.