Name: Yetişkin kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre mühendislik manyetik hedefleme ile kombine etkinleştirmek için hücre içine mikroRNA Transfer için iletişim kuralı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Keşfedin manyetik nanopartikül tabanlı transfeksiyon yöntemiyle CD133+ hematopoietik kök hücrelerine mikroRNA aktarımı. Bu protokol hücre özelliklerini koruyarak genetik mühendislik sağlar ve rejeneratif tıpta hücre izleme için manyetik rezonans görüntüleme olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma Almanya (FKZ 0312138A ve FKZ 316159), devlet Mecklenburg-Western Pomerania AB yapısal fonları (ESF/IVWM-B34-0030/10 ve ESF/IVBM-B35-0010/12) ile ve DFG (DA1296/2-1), tarafından desteklenmiştir Alman Kalp Vakfı (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) ve nemli Vakfı. Buna ek olarak, F.H. ve saatleri arasında FORUN Program, Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından (889001) desteklenir.

Hücre izolasyon için sternum insan BM araştırmasına göre Helsinki bildirimi için saldırganın saklanıp örnekleri kullanmak için onların yazılı izni veren bilinçli bağışçılardan elde edildi. Rostock Üniversitesi Etik Komite sunulan çalışma (reg. Hayır ' 2010 23, 2015 yılında uzun süredir devam eden) onayladı.
1. hücre hazırlık
Not: koagülasyon BM muayene için önlemek için heparin sodyum (250 IU/mL BM) kullanın.
<ol><li>CD133+ SC yalıtım
	<ol>
<li>Gerekli çözümleri hazırlanması<ol>
<li>Fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlamak / ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) stok çözüm (2 mM) 1 x PBS 996 mL EDTA (0, 5 M) 4 mL ile karıştırılarak. Şiddetle çözüm mix ve 0,45 µm filtre kullanarak filtrate. (RT) Oda sıcaklığında saklayın.</li>
			<li>MAC'ler arabellek 2 mm PBS/EDTA 995 mL Sığır serum albumin (BSA) 5 g ile karıştırarak hazırlayın. Şiddetle çözüm mix ve 0,45 µm filtre kullanarak filtrate. 4 ° C'de mağaza</li>
			<li>Collagenase B hisse senedi çözüm (40 mg/mL) 500 mg collagenase B'den ( Clostridium histolyticum) PBS 12,5 ml sulandrarak hazırlayın. Şiddetle çözüm mix, 350 µL aliquots alın ve -20 ° C'de saklayın</li>
			<li>Deoksiribonükleaz (ben stok çözüm (10 mg/mL) 100 mg DNaz sulandrarak DNaz) hazırlamak ben (dan bovine pankreas) PBS 10 ml. Şiddetle çözüm mix, 350 µL aliquots alın ve -20 ° C'de saklayın</li>
		</ol>
</li>
		<li>İnsan BM enzimatik sindirim<ol>
<li>İnsan lenfosit orta RT olarak önceden sıcak ve enzimler (1 aliquot her collagenase B ve DNaz 20 mL BM başı) çözülme.</li>
			<li>BM şırınga 50 mL konik tüp içine toplamak ve karışımı yavaşça. Varolan herhangi bir pıhtı atma. Not: sonraki akış sitometrik çözümlemesi için 1,5 mL tüp içine su katılmamış BM 200 µL Transfer. 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak.</li>
			<li>10 mL BM bir yeni 50 mL konik tüp içine aktarmak, PBS / (2 mM), EDTA insan lenfosit orta, 175 µL Collagenase b (40 mg/mL) ve 175 µL 20 mL 6 mL DNaz ekleyin ben (10 mg/mL). Yavaşça çözüm mix ve RT bir shaker tarih itibariyle 30 dk için kuluçkaya. Kalan BM örnek için yineleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Yoğunluk gradient Santrifüjü<ol>
<li>50 mL yoğunluk gradient Santrifüjü tüp insan lenfosit orta 50 mL tüp içine ayıran 15 mL uygulayarak Başbakan. Santrifüj 1000 x g , 30 s.</li>
			<li>Dikkatle seyreltilmiş BM yoğunluk gradient Santrifüjü tüp filtresi ve RT. 35 min için 445 x g , santrifüj en üstünde 35 mL katman Not: Santrifüj ayarlarıdır düşük ivme (3) ve fren yok (1).</li>
			<li>Dikkatle sallayarak olmadan santrifüj tüpü çıkarması. Dikkatle ~ 20 mL üst açık çözüm filtre üzerinde doğrudan bulutlu katmanı dokunmadan atmak.</li>
			<li>Dikkatle (doğrudan filtredir üstüne ve mononükleer hücreler (ÇUŞ 'un) içeren) bulutlu tabakası bir yeni 50 mL konik tüp içine aktarmak ve 50 mL son bir hacim için PBS/EDTA ile doldur. Not: bir BM hasta örnek gelen tüm ÇUŞ 'un bir yeni tüp içine birleştirmek.</li>
			<li>Çok uluslu şirketler 50 mL hücre süspansiyon 10 µL 1,5 mL tüp içine aktararak saymak. Metilen mavisi ile %3 Asetik asitin 10 µL ekleyin. Yavaşça karıştırın ve bir sayım odasına 10 µL uygulayın. Çok uluslu şirketler sayısını hesaplayın.</li>
			<li>10 dakika süreyle santrifüj MNC süspansiyon 300 x g de süpernatant atmak. Not: RT gelen santrifüj ile 4 ° c Santrifüjü sırasında sakin</li>
		</ol>
</li>
		<li>CD133 manyetik seçimi+ SCs insan CD133 antikor bağlı superparamagnetic demir dextran parçacıkları kullanma Not: Bu adım sırasında buz üzerinde çalışmaz. Kullanım 4 ° C'de kadar depolama çözümleri MAC'ler Daimi Mıknatıs, ayrılık sütunlar ve ön ayırma filtre 4 ° C'de depolayın<ol>
<li>Sütun boyutu seçin. &lt; 1.2 x 108 çok uluslu şirketler, kullanım MS sütunlar ve için &gt; için 1.2 x 108 çok uluslu şirketler, LS sütun (bkz. Tablo reçetesi) kullanın.</li>
			<li>1 x 108 toplam cep numarası için manyetik seçimi hazırlamak için dikkatli bir şekilde çok uluslu şirketler 300 µL MAC'ler arabellekte (4 ° C) resuspend. 100 µL FcR engelleme reaktif (4 ° C) ve 100 µL CD133 antikor bağlı superparamagnetic demir dextran parçacıklar (4 ° C) ekleyin.</li>
			<li>Yavaşça hücre süspansiyon mix ve 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Yavaşça hücre süspansiyon sırasında kuluçka (2-3 x) sallamak.</li>
			<li>MAC'ler arabellek (4 ° C) 2 mL 1 x 108 toplam karışımı çok uluslu şirketler. yavaşça hücre süspansiyon ve 300 x g , santrifüj 4 ° C'de 10 dakika başına ekleyin</li>
			<li>MAC'ler Mıknatıs tutucu ayarla ve MAC'ler Daimi Mıknatıs ekleyebilirsiniz. MAC'ler sütun yüklemek ve üst ön ayırma filtreyi uygulayın.</li>
			<li>Ilk MAC'ler MS/LS sütun ve ön ayırma filtre ile 0.5 mL (MS) veya 3 mL (LS) MAC'ler arabellek (4 ° C) equilibrate. Not: Asla denge sonra kurumaya MAC'ler sütunları izin.</li>
			<li>Süpernatant atın ve MAC'ler arabelleği (4 ° C) 500 µL elde edilen Pelet başına 1 x 108 Toplam hücresini miktar resuspend. Hücre süspansiyon ön ayırma filtre uygulayın.</li>
			<li>Üç kez kullanarak, her yıkama 0.5 mL (MS) MAC'ler sütun ve ön ayırma filtresini yıkamak veya 3 mL (LS) MAC'ler tampon (4 ° C). Not: Üçüncü çamaşır adım sırasında ikinci bir MAC'ler sütun MAC'ler Daimi Mıknatıs yükleyin ve ikinci MAC'ler MS/LS sütun 0.5 mL (MS) veya 3 mL (LS) MAC'ler arabellek (4 ° C) ile equilibrate.</li>
			<li>Ön ayırma filtre atmak.</li>
			<li>İkinci MAC'ler sütun üzerine doğrudan hücreye kesir elute: 1 mL (MS) veya 5 mL (LS) MAC'ler arabellek (4 ° C) ilk MAC'ler sütuna eklemek ve MAC'ler Daimi Mıknatıs MAC'ler sütun kaldırmak. Hemen ilk MAC'ler sütun ikinci MAC'ler sütunun üzerindeki aktarım ve hücre süspansiyon üzerinden sağlanan pistonu kullanma MAC'ler sütun itin.</li>
			<li>Her yıkama 0.5 mL (MS) kullanarak üç kez, MAC'ler sütun yıkamak veya 3 mL (LS) MAC'ler (4 ° C) arabellek.</li>
			<li>1 mL (MS) veya 5 mL (LS) MAC'ler arabellek (4 ° C) ikinci MAC'ler sütuna ekleyerek ve MAC'ler Daimi Mıknatıs MAC'ler sütun kaldırma sütundaki hücre kesir elute. Hemen bir 1,5 mL tüp (MS) veya 15 mL konik tüp (LS) Yukarıdaki ikinci MAC'ler sütunda aktarmak ve hücre süspansiyon üzerinden sağlanan pistonu kullanma MAC'ler sütun itin.</li>
			<li>4 ° C'de 10 dakika için 300 x g , santrifüj Dikkatle süpernatant atın ve elde edilen Pelet MAC'ler arabellek (4 ° C) 100 µL içinde resuspend.</li>
			<li>CD133 saymak+ hücreleri: transfer 6 µL 1,5 mL tüp içine hücre süspansiyon. 6 µL trypan mavi çözüm (% 0,4) ekleyin. Yavaşça karıştırın ve bir sayım odasına 10 µL uygulayın. CD133 sayısını hesaplamak+ hücreleri.</li>
			<li>CD133 mağaza+ hücreleri buza tohum kadar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Taze izole CD133 karakterizasyonu+ SCs Not: Aşağıdaki iş (loş sadece Aydınlatma) parlak ışıktan korunan bir odada yapılmalıdır. Tüpler, arabellekleri ve antikorlar buz Aksi belirtilmediği sürece tutun.<ol>
<li>SCs hazırlanması için akış sitometrik çözümlemesi<ol>
<li>İki örnek (her 10 µL), BM aliquots ve taze izole CD133 bir örneğini kullanın+ SCs (en az, 1 x 104 hücreleri) analiz için. Hücreleri bir 1,5 mL tüp içine aktarın. Reaktif engelleme FcR 10 µL ekleyin ve MAC'ler arabelleğe (4 ° C) 33 µL hacmi ile doldur.</li>
			<li>Aşağıdaki antikorlar ilgili iç tarafında üzerine eklemek (bkz. Tablo 1) tüp: anti-CD34-floresein isothiocyanate (FITC) (klon: AC136), anti-CD133/2-phycoerythrin (PE) (klon: 293C 3), izotip kontrol fare IgG 2b-PE, Anti-CD45-allophycocyanin () APC)-H7 (klon: 2D 1) ve 7-aminoactinomycin (AAD). Tüm antikorlar ekledikten sonra tüp antikorlar yan salla. Yavaşça (son hacim 50 µL) çözüm mix ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya</li>
			<li>1 mL 1 x kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek ekleyin, yavaşça süspansiyon mix ve buz 10 dk santrifüj süspansiyon 300 x g de 4 ° C'de 10 dakika için üzerinde kuluçkaya</li>
			<li>Süpernatant atın ve elde edilen Pelet 100 µL PBS (4 ° C) resuspend. Buz üzerinde akış sitometrik çözümlemesi kadar saklayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Akış sitometrik analizinde CD133+ SCs<ol>
<li>Hücre canlılığı ve CD133 saflığı incelemek için+ SC, bir adapte uluslararası toplum Hematotherapy ve greft mühendislik (ISHAGE) akış sitometresi gating strateji41 (bkz: Şekil 1' deki temsilcisi tasvir) kullanın. Aşağıdaki sırayla kullanın: 1. Adım: seçim hücre nüfus (Şekil 1A) Adım 2: seçim CD45+ hücreleri (Şekil 1B) Adım 3: seçim uygun CD45+ hücreleri (Şekil 1 c) Adım 4: seçim uygun CD45+/CD34+ hücreleri (Şekil 1 d) Adım 5: seçim uygun CD45+/CD34+/CD133+ hücreleri (1E rakam) Akış Sitometresi çalıştırmak ( Tablo malzemelerigörmek) üretici yönergelerine göre.</li>
			<li>Hücre canlılığı ve saflık aşağıdaki denklemleri kullanarak hesaplar:</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57474/57474eq1v2.jpg">   Denklem 1
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57474/57474eq2v2.jpg">   Denklem 2
<ol start="3"><li>
Hücre kültürü taze izole CD133+ SCs
	<ol>
<li>Aliquot 100 rekombinant insan sitokin x 100 µL aliquots ek ve -20 ° C'de depolayın Daha önce Orta hazırlık tezcan bir 100 x aliquot.</li>
		<li>CD133 hazırlamak+ SC Kültür orta, serum-Alerjik hematopoietik hücre genişletme orta rekombinant insan sitokin ek (Son 1 x) ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiştir.</li>
		<li>Tohum 5 x 104 taze izole CD133+ SCs 24-şey plaka 500 µL kültür orta ile transfection için. 37 ° C, % 5 CO2 ve O2hücreleri kuluçkaya. Not: Tohum 5 x 104 taze CD133 izole+ SCs olarak bir denetim akış sitometrik çözümlemesi için.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Transfection konut projeleri hazırlanması
Not: Bu adım sırasında tüm çalışma alanı ribonükleaz (RNAse) tutmak-RNAse dekontaminasyon çözüm kullanarak ücretsiz ve sadece RNAse free sarf malzeme kullanın.
<ol><li>
MiR hazırlanması Not: Aşağıdaki iş (loş sadece Aydınlatma) parlak ışıktan korunan bir odada yapılmalıdır. Not: miR-numune için: kullanım siyanür 3 boya etiketli habercisi miR ve etiketsiz habercisi miR.<ol>
<li>MiR hisse senedi çözüm (50 µM) hazırlamak için miR nükleaz ücretsiz su (Örneğin, 100 µL suda miR, seyreltik 5 nmol) uygun hacmine istenilen miktarda oranında seyreltin. Yavaşça çözüm, aliquot miR hisse senedi (5 µL) mix ve -20 ° c altında depolamak</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PEI hazırlanması
	<ol>
<li>Aşağıdaki standart protokolleri ve Not PEI hisse senedi toplama31,42 PEI hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MNP hazırlanması
	<ol>
<li>Standart protokolleri takip MNPs hazırlamak ve MNP hisse senedi toplama31,42unutmayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MiR/PEI konut projeleri hazırlanması
	<ol>
<li>D-(+) sulandrarak %5 glikoz çözüm hazırlamak-glikoz suda nükleaz ücretsiz. Yavaşça çözüm, aliquot stok (1,5 mL) mix ve 4 ° C'de depolayın Not: Aşağıdaki iş (loş sadece Aydınlatma) parlak ışıktan korunan bir odada yapılmalıdır.</li>
		<li>20 pmol miR 24-şey plaka30kuyu kullanın. MiR 0,25 pmol miR/µL son bir konsantrasyon için %5 glikoz çözümde sulandırmak.</li>
		<li>PEI gerekli miktarda esas miR tutarı (20 pmol, adım 2.3.1) ve fosfat (miR) Toplam (Toplam PEI) en uygun azot (N/P) oranı PEI hisse senedi toplama göre hesaplamak (2.2.1; adım burada, 7.5 oranında kullanıldı)30. %5 glikoz çözüm üzerinde denklemi dayalı eşit miktarda PEI seyreltik: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57474/57474eq3v2.jpg"> Hangi için yeniden düzenler <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57474/57474eq4v2.jpg">    Denklem 3 PEI birim µL ve [PEI] nerede mM, ve N/P (Bu iletişim kuralı için optimize edilmiş) 0,75. 0.12 miR için belirli bir dönüşüm faktördür.</li>
		<li>Önceden seyreltilmiş PEI eklemek önceden seyreltilmiş miR ve 30 için girdap içine s.</li>
		<li>MiR/PEI RT., 30 dk için karmaşık kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MiR/PEI/MNP konut projeleri hazırlanması Not: Aşağıdaki iş (loş sadece Aydınlatma) parlak ışıktan korunan bir odada yapılmalıdır.<ol>
<li>MiR/PEI kompleksleri kuluçka sırasında MNPs MNPs RT süspansiyon parçacıkların olduğundan emin olmak için sonicating su banyosu içinde 20 dk 35 kHz için sonicating ve değil toplayarak hazırlanın.</li>
		<li>MNP hisse senedi çözüm (adım 2.3.1) göre gerekli MNPs (3 µg demir/mL) sayısını hesaplayın.</li>
		<li>Sonicated MNPs miR/PEI kompleksleri ve girdap 30 s. Incubate için 30 dk miR/PEI/MNP kompleksleri RT. Ekle</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection kompleksleri için hazırlanması dört renkli SIM kullanarak etiketleme Not: etiketsiz habercisi miR kullanın.<ol>
<li>MiR siyanür 5 bir siyanür 5 boya miR etiketleme kiti ( Tablo malzemelerigörmek) boya kullanarak etiket üreticinin yönergeleri izleyin. Listelenen spektrofotometre kullanarak son miR konsantrasyon ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek) (nükleik asit, RNA-40) üreticisi tarafından sağlanan ön ayarı uygun olarak. MiR (5 µL) ve mağaza-80 ° C'de ışıktan korunan aliquot.</li>
		<li>Bir uygun protein etiketleme kiti ( Tablo malzemelerigörmek) kullanarak bir parlak yeşil floresans boya ile PEI etiket üreticinin yönergeleri izleyin. Son PEI konsantrasyon Ninhydrin tahlil (adım 2.2.1) kullanarak tanımlayın. Aliquot PEI (birimindeki temel alınarak Denklem 3hesaplanır) ve ışıktan korunan 4 ° C'de depolayın.</li>
		<li>1:1,000 w/w oranında kullanarak biotin Birleşik rodamine boya ile MNPs etiket, MNP için boya. Rodamine boya ve MNPs miR/PEI karmaşık oluşumu hazırlanması ile aynı anda mix ve karanlıkta 30 dk için çözüm kuluçkaya. Doğrudan etiketli MNPs kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. transfection CD133+ SCs
Not: Bu adım sırasında tüm çalışma alanı ribonükleaz (RNAse) tutmak-RNAse dekontaminasyon çözüm kullanarak ücretsiz ve sadece RNAse free sarf malzeme kullanmak Not: Aşağıdaki iş (loş sadece Aydınlatma) parlak ışıktan korunan bir odada yapılmalıdır.
<ol><li>Hazırlanan miRNA/PEI/MNP karmaşık dropwise doğrudan uygun kuyunun içine taze izole CD133 içeren eklemek+ SCs kültür orta.</li>
	<li>Karışımı yavaşça ileri geri plaka Rock yaparak. 18 h 37 ° C, % 5 CO2 ve O2için hücreleri kuluçkaya.</li>
</ol>4. miR Transfection Analizi
<ol><li>
MiR alımını verimlilik ve transfection kompleksleri sitotoksisite incelenmesi Not: miR-numune için: öncü miR alımını değerlendirme ve sigara transfected CD133 etiketli siyanür 3 boya kullanın+ SCs akış sitometresi denetim giriş kapıları için. Not: Aşağıdaki iş (loş sadece Aydınlatma) parlak ışıktan korunan bir odada yapılmalıdır. Not: Aksi belirtilmedikçe tüpler, arabellekleri ve antikorlar buz üzerinde tutun.<ol>
<li>Paraformaldehyde hisse senedi çözüm (PFA, % 4) 4 g PFA 100 ml PBS sulandrarak ve çözüm ile 80 ° c Isıtma hazırlayın Şiddetle çözüm mix ve 7.3 pH değerine ayarlayın. Aliquot ise (1,5 mL) stok ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>18 h transfection sonra toplamak her şey ayrı bir 1,5 ml tüp. Her biri de bir kez PBS 500 µL yıkama ve bu hücre süspansiyon için aynı tüp aktarmak.</li>
		<li>4 ° C'de 10 dakika için 300 x g, santrifüj Süpernatant atın ve elde edilen Pelet 4 ° C MAC'ler arabellek 100 µL içinde resuspend.</li>
		<li>Canlı ve ölü hücreleri arasında ayırt etmek, yavaşça süspansiyon karıştırmak ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya bir amin reaktif boya 0.5 µL Ekle 1 mL PBS (4 ° C) ve santrifüj 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için ekleyin</li>
		<li>Süpernatant atmak, elde edilen Pelet 100 µL PBS resuspend, 33 µL PFA (% 4) ekleyin ve buz üzerinde veya 4 ° C'de akış sitometrik çözümlemesi kadar saklayın.</li>
		<li>Şekil 2' deki temsilcisi tasvir göre gating strateji düzenleyin. Akış Sitometresi örneklerini çalıştırma ( Tablo malzemelerigörmek) üretici yönergelerine göre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MiR transfected CD133 karakterizasyonu+ SCs Not: kullanılan etiketlenmemiş habercisi miR yanı sıra sigara transfected CD133+ SCs akış sitometresi denetim giriş kapıları için.<ol>
<li>Ve toplamak için her bir ayrı 1,5 mL tüp içinde iyi vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Perdeleme strateji 1.2. adımda açıklandığı gibi kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection kompleksleri tarafından SIM hücre içi dağıtım incelenmesi
	<ol>
<li>Konut projeleri hazırlamak ve Bölüm 2 ve Bölüm 3'te açıklandığı gibi hücreleri transfect.</li>
		<li>18 h transfection sonra toplamak her şey ayrı bir 1,5 ml tüp. Her biri de bir kez PBS 500 µL yıkayın ve yıkama kuyu ilgili tüp içine aktarın. 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g , santrifüj</li>
		<li>Süpernatant atmak ve 1 ml % 2 fetal Sığır serum (FBS) elde edilen Pelet PBS içinde resuspend, yavaşça süspansiyon karıştırın ve vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Süpernatant atmak, elde edilen Pelet PBS 100 µL içinde resuspend ve 20 dk 33 µL PFA (%4) ekleyin.</li>
		<li>Steril cam coverslips ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj 300 x g de içeren yeni bir 24-Kültür plaka içine hücre süspansiyon transfer</li>
		<li>Süpernatant atmak ve PBS 500 µL ekleyin. Yavaşça plaka sallamak ve PBS atın.</li>
		<li>Hazır coverslips floresan korumak ve kuru onları RT en az 1 h için sulu montaj orta kullanarak mikroskobik slaytlar üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Görüntüleri bir 100 X yağı daldırma hedefi kullanarak elde. SIM ayarları: 405, 488, 561 ve uyarma ve z-bir 16-bit derinliği 3 açılarda, 4, ızgaralar lazer çizgi başına ortalama ile 3 aşama Baca'ya 633 nm lazer hatları: 23 µm-405, 34 µm-488, 42 µm-561, 51 µm-633.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Son yıllarda, CD133+ SCs ortaya çıktı umut verici bir hücre nüfus olarak birkaç tarafından kanıtlanan SC tabanlı terapiler aşama için ı, II ve III klinik43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , <sup clas...

CD133+ SCs temsil rejeneratif tıp için potansiyel vaat ile bir türdeş olmayan kök ve progenitör hücre nüfus. Onların hematopoetik, endotel ve myogenic farklılaşma potansiyel1,2,3 CD133 sağlar+ hücreleri, neovaskülarizasyon işlemlere farklılaşma yoluyla katkıda bulunmak için Örneğin, yeni gemiler ve pro-anjiogenik parakrin mekanizmaları4,5,6,7tarafından sinyal aktivasyonu içine şekillendirme.
30'dan fazla onaylanmış klinik denemeler (ClinicalTrails.gov) gösterdi yüksek potansiyellerini rağmen tedavi sonuçlarının hala tartışmalı tartışma4altında olması. Nitekim, SCs bir klinik uygulama düşük saklama faiz ve büyük ilk hücre ölüm5,8,9organı tarafından engel oluyor. Ek CD133 mühendislik+ SCs önceki nakli bu zorlukların üstesinden yardımcı olabilir.
Bir etkin hücre tedavisi için bir ön koşul tedavi ilgili hücre10engraftment geliştirmek için büyük ilk hücre ölümü azalma olacaktır. Mevcut çalışmalar ilk 1-2 h sırasında transplante hücre türü bağımsız bir büyük hücre kaybı 90-%99 beyin ve kalp gibi son derece derin organlarında gösterdi veya uygulama rota11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. Manyetik Nano tanecikleri (MNPs) kullanarak SC etiketleme faiz22,23,24,25,26 siteye hedef hücrelere yenilikçi bir non-invaziv strateji sağlar ve aynı anda MRG27 ve Manyetik Parçacık (MPI) Imaging kullanarak hücre izleme sağlar. Uygulanan manyetik hücre hücre rehberlik sonra İntravenöz enjeksiyon23,24,28 yerine yerel yönetim sonra kullanılan hücreye saklama hedefleme en verimli in vivo çalışmalar . Bu nedenle, bizim grup superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri29uncu oluşan bir iletim sistemi tasarlanmıştır. Bu teknik, CD133 ile+ SCs ve insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) verimli hedeflenen, vitro 30,31tarafından gösterildiği gibi çalışır.
SC tedaviler için başka bir engel düşmanca inflamatuar etkilenen doku nakli, ilk hücre ölüm32' ye katkıda sonra ortamıdır. Birçok öncesi Klima Araştırma ek olarak, tedavi edici ilgili miRs uygulama test33vardı; başarılı bir şekilde anti-apoptotik miRs apoptosis vitro inhibe ve hücre engraftment vivo içinde33geliştirmek kanıtlanmıştır. 20 – 25 nükleotit oluşan bu küçük moleküller, haberci RNA (mRNA) posttranscriptional modülatörler olarak çok önemli bir rol oynamak ve böylece kök hücre kader ve davranış34etkiler. Ayrıca, miRs eksojen giriş ana bilgisayar genom34istenmeyen istikrarlı entegrasyon kaçının.
Nükleik asitler (NAs) verimli giriş içine birincil SCs için geçerli girişimleri çoğunlukla rekombinant virüs8,35üzerinde temel alır. Yüksek transfection verimlilik rağmen rekombinant virüs manipülasyon bir tezgah başucu çevirisi, Örneğin, kontrol edilemeyen gen ekspresyonu, patojen, immünojenisite ve insertional mutagenesis35 için büyük bir engel sunar. ,36. Bu nedenle, polimer esaslı yapılarını gibi viral teslim sistemleri geliştirmek için önemlidir. Bu arasında polyethylenimine (PEI) miRs bozulması, hücresel alımı, korumak için NA yoğunlaşma gibi sağlayacağı yararlar sunan bir geçerli teslim araç temsil eder ve endosomal aracılığıyla hücre içi yayın kaçış37,38. Ayrıca, miR-PEI kompleksleri yüksek biyouyumluluk klinik39' gösterdi. Bu nedenle, bir biotinylated bizim teslimat sistemi oluşur dallı 25 kDa PEI bir streptavidin kaplı MNP çekirdekli30,31,40' a bağlı.
Bu makale, biz (i) CD133 el ile izolasyonu açıklayan kapsamlı bir iletişim kuralı mevcut+ SC SC ürün ve (ii) bir verimli ve nazik transfection stratejisi detaylı karakterizasyonu insan kemik iliği (BM) bağış gelen bir manyetik olarak viral polimer tabanlı dağıtım sistemi CD133 genetik mühendisliği için+ SCs miRs kullanarak. CD133+ SCs izole ve manyetik (Mac) sistemi sıralama bir yüzey antikor tabanlı manyetik aktif hücre kullanarak insan sternal BM boğulmadan zenginleştirilmiş. Daha sonra hücre canlılığı hem de hücre saflık akış sitometresi kullanarak analiz edilir. Daha sonra miR/PEI/MNP konut projeleri hazırlanır ve CD133+ SCs transfected. 18 h transfection sonra alımını verimlilik ve transfection SC marker ifade ve hücre canlılığı üzerinde etkisini analiz edilir. Ayrıca, hücre içi dağıtım transfection karmaşık bileşiklerin değerlendirilmesi dört renkli etiketleme ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanılarak gerçekleştirilir.

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Metilen Mavisi Kök Hücre Teknolojili Asetik Asit</td><td></td><td>7060</td><td>%3</td></tr> <tr><td>anti-CD133/2-PE (klon: 293C3)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34-FITC (klon: AC136)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC-H7 (klon: 2D1)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560178</tr><tr><td>rodamin boyası; Atto 565 biotin ile konjuge</td> boya <td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII akış sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Yazılımı 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133 antikora bağlı süperparamanyetik demir dekstran parçacıkları; CD133 Mikro Boncuk Kiti</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>kollajenaz B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>sayma odası</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siyanin 3 boya etiketli öncü miR; Cy3 Boya Etiketli Pre-miR Negatif Kontrol #1</td><td>Ambion</td><td>AM17120</td><td></td></tr><tr><td>Siyanin 5 boya miR etiketleme kiti; Cy5 boya Etiketi IT miRNA Etiketleme Kiti</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 konfokal mikroskop</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR Bloke Edici Reaktif, insan</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>parlak yeşil protein etiketleme kiti; Oregon Green 488 Protein Etiketleme Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>sulu montaj ortamı; Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>yoğunluk gradyan santrifüj tüpü; Leukosep Santrifüj Tüpü</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>MACS mıknatıs tutucu; MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS ön ayırma filtresi</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 &micro; m</td></tr><tr><td>MACS ayırma kolonu (MS / LS)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS sabit mıknatıs; MACS Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF Filtre</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0.45 & mu; m</td></tr><tr><td>fare IgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>amin reaktif boya; Near-IR LIVE/DEAD Sabitlenebilir Ölü Hücre Leke Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>insan lenfosit ayırma ortamı; Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>yoğunluk: 1.077 g/mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td>, <td>Ca ve Mg olmadan</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727</td><td>dallı; 25 kDa</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U / mL, 100 & mu; g/mL,</td></tr><tr><td>PFA</td><td>, Merck, Schuchardt, OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>etiketsiz öncü miR; Pre-miR miRNA Öncüsü Negatif Kontrol #1</td><td>Ambion</td><td>AM17110</td><td></td></tr><tr><td>RBC lizis tamponu</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RNAse dekontaminasyon solüsyonu; RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>insan lenfosit ortamı; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta Pan</td><td>Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant insan sitokin takviyesi; StemSpan CC100</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>serumsuz hematopoietik hücre genişletme ortamı; StemSpan H3000</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere Paramanyetik Parçacıklar</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi çözümü</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>%0,4</td></tr> <tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0,5 M; pH 8.0</td></tr><tr><td>ZEN2011 yazılımı</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH sonikasyon su banyosu</td><td>Bandelin elektronik</td><td></td><td>Ultrasonik nominal çıkış: 80 W; Ultrasonik frekans: 35 kHz</td></tr></tbody></table>

yetişkin kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre mühendislik manyetik hedefleme ile kombine etkinleştirmek için hücre içine mikrorna transfer için iletişim kuralı

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Süre CD133+ hematopoietik kök hücre (SCs) rejeneratif tıp alanında yüksek potansiyel sağlamak için kanıtlanmıştır, yaralı doku hem de gözlenen büyük hücre ölüm oranları içine enjeksiyon sonra onların düşük tutma oranları çok yol sınırlı tedavi edici etkileri. Bu sınırlamalarını aşmak için bir viral tabanlı iletişim kuralı uygun hücre mühendisliği önce kendi yönetim için kurmak istedi. İnsan CD133 değişiklik+ yüklenmiş mikroRNA (miR) manyetik polyplexes kullanarak SCs ifade ele alımı verimliliği ve emanet gibi hücreleri hedefleme potansiyeli ile ilgili. Bizim iletişim kuralı üzerinde güvenerek, biz yüksek miR alımı CD133 ise % 80 – 90 oranda elde edebilirsiniz+ kök hücre özellikleri etkilenmemiş kalır. Ayrıca, bu değiştirilmiş hücreler manyetik hedefleme seçeneği sunuyoruz. Biz burada CD133 modifikasyonu için güvenli ve yüksek verimli bir yordam tarif+ SCs. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) üzerinden yönetilen hücre ürün izleme ve tedavi kök hücre etkileri duruma getirilmesi için standart bir teknoloji sağlamak için bu yaklaşım bekliyoruz.

Bir el ile yalıtım ve insan BM kaynaklı CD133 Manyetik Zenginleştirme sunulan protokolünü açıklar+ ile in vitro hücre düzenleme ve için non-invaziv bir teknoloji olarak strateji, mühendislik bir sonraki virüs bağımsız hücre SCs Vivo izleme aracı.
Bu üç adım izolasyon teknolojisi çok uluslu şirketler ayrılması önceden sindirilmiş sternal BM aracılığıyla yoğunluk gradient Santrifüjü üzerinden izin veri...

Bu iletişim kuralı CD133 değiştirmek için güvenli ve verimli bir yordam gösterilmektedir+ hematopoietik kök hücre. Sunulan viral sigara, manyetik polyplex dayalı yaklaşım temel terapötik kök hücre etkileri de manyetik rezonans görüntüleme üzerinden yönetilen hücre ürün izleme gelince optimizasyonu için sağlayabilir.

Yetişkin kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre mühendislik manyetik hedefleme ile kombine etkinleştirmek için hücre içine mikroRNA Transfer için iletişim kuralı

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Protokolümüz, rejeneratif tıp alanında, hücrelerin faydalı özellikler için geliştirilip geliştirilemeyeceği ve ilgilenilen bölgeye hedeflenip hedeflenemeyeceği gibi temel soruları yanıtlayabilir. Protokolümüzün ana avantajı, hücrelerin viral olmayan transfeksiyon yöntemimiz kullanılarak geçici olarak, genetik olarak tasarlanabilmesi ve böylece hücrelerin özelliklerini koruyabilmesidir. Sauter'in yöntemi, mezenkimal kök hücreler gibi transplantasyon için kullanılan diğer hücre tiplerine uygulanabilen hematopoietik kök hücrelerin modifikasyonu hakkında fikir verebilir.Protokole başlamak için, insan lenfosit ortamını oda sıcaklığına önceden ısıtın ve Kollajenaz B ve DNaz'ı çözün. Kemik iliğini veya BM'yi 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Mevcut pıhtıları atın.Sonraki akış sitometrik analizi için 200 mikrolitrelik bir BM örneği alın. Numuneyi ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra, on mililitre BM'yi 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın ve altı mililitre PBS EDTA, 20 mililitre insan lenfosit ortamı, 175 mikrolitre Kollajenaz B ve 175 mikrolitre DNaz ekleyin.Çözeltiyi yavaşça karıştırın ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika ink

protocol-for-microrna-transfer-into-adult-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Hedeflenen hücre iletimi, çeşitli biyomedikal uygulamalarda yararlıdır.  Bu protokolün amacı, hücreleri etiketlemek için süperparamanyetik demir oksit nanopartikülleri (SPION) kullanmak ve böylece hücre iletimi ve lokalizasyonu üzerinde yüksek derecede kontrol için manyetik hücre hedefleme yaklaşımlarını mümkün kılmaktır.

Hücre Etiketleme ve Süperparamanyetik Demir Oksit Nanopartiküller ile Hedefleme

Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Bu yazıda bir PEI / MNP vektörü ve mıknatıslanarak endotel hücrelerine miR verimli, viral olmayan iletimi açıklanır. Bu nedenle, genetik modifikasyon ek olarak, bu yaklaşım, manyetik hücre rehberlik ve MR taranabilirlik sağlar. teknik terapötik hücre ürünleri özelliklerini geliştirmek için de kullanılabilir.

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

Bu iletişim kuralı insan diş kökü çıkarılan diş kök hücrelerin geçici genetik mühendisliği açıklar. Uygulanan non-viral değişiklik strateji tedavi kök hücre ürünlerin geliştirilmesi için bir temel olabilir.

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu (HKHT) genetiği hematopoetik hücrelerin kötü huylu potansiyelini değerlendirmek için nasıl kullanılacağını açıklar. HKHT çeşitli malign hematopoetik hücrelerin vivo içinde değerlendirmek için hem de Roman terapiler değerlendirmek için büyük bir kohort myelodisplastik sendrom (MDS) veya lösemi ile farelerin üreten yararlıdır.

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu myelodisplastik sendromu kökeni değerlendirmek için kullanımı

Bu iletişim kuralının amacı insan dışı primat CD34 izole etmektir+ hücreleri astarlanmalıdır kemik iliği, gen-lentiviral vektörler ile bu hücreleri değiştirme ve otolog ana bilgisayar içine infüzyon için bir ürün hazırlamak için gelen. Toplam iletişim kuralı yaklaşık 48 saat uzunluğudur.

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Mevcut protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanması için optimize edilmiş bir hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) kültür prosedürünü tanımlamaktadır.

CRISPR/Cas9 Gen Tedavisi Uygulamaları için Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Gen Düzenlemesi

Bu protokol, in vitro olarak bir araya getirilen ve elektroporasyon yoluyla iletilen Cas9-sgRNA ribonükleoprotein kompleksleri kullanılarak fare kemik iliği türevi makrofajlarda genom düzenleme prosedürünü açıklar.

Elektropore Cas9-sgRNA Kompleksleri Kullanılarak Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Yüksek Verimli Gen Bozulması

Bu protokol, gen düzenlenmiş hücreler de dahil olmak üzere birkaç hematopoietik veya lösemik kök hücrenin murin ksenogreft modellerinde intrafemoral enjeksiyonunu tanımlar, bu da sadece hücrelerin hızlı ve güvenli bir şekilde nakledilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kemik iliğinin seri analizlerini de sağlar.

Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir

Keşfedin manyetik nanopartikül tabanlı transfeksiyon yöntemiyle CD133+ hematopoietik kök hücrelerine mikroRNA aktarımı. Bu protokol hücre özelliklerini koruyarak genetik mühendislik sağlar ve rejeneratif tıpta hücre izleme için manyetik rezonans görüntüleme olanağı sunar.

Yetişkin kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre mühendislik manyetik hedefleme ile kombine etkinleştirmek için hücre içine mikroRNA Transfer için iletişim kuralı (Video) | JoVE Journal

Yetişkin kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre mühendislik manyetik hedefleme ile kombine etkinleştirmek için hücre içine mikroRNA Transfer için iletişim kuralı

Daha fazla video keşfet